MỞ ĐẦU Thực phẩm chứa mầm bệnh ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe con ngƣời và là nguyên nhân chính gây ra các dịch bệnh. Mặc dù các tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và nguyên tắc về vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP,…) đã đƣợc áp dụng, nhƣng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng tăng. Chính vì thế, các chất bảo quản hóa học đƣợc sử dụng tràn lan. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các chất phụ gia trong thực phẩm gây ra tác dụng không mong muốn cho ngƣời tiêu dùng.
Do đó, việc tìm ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đang đƣợc quan tâm. Trƣớc những yêu cầu trên, vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều nhất do chúng có khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic, hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin và reutericyclin. Trong đó, bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn thu hút đƣợc nhiều sự quan tâm. Chúng có khả năng kháng các vi sinh vật gây hỏng trong thực phẩm nhƣ Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella… Do tính chất an toàn đối với con ngƣời và cả động vật, LAB đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm và là đối tƣợng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong những năm qua.
Việt Nam là nƣớc nhiệt đới gió mùa với nguồn động thực vật phong phú. Nguồn thực vật dồi dào, gần gũi với đời sống con ngƣời nhƣ lá lô hội, ngải cứu, rau muống, lá sung… không chỉ là thực phẩm hàng ngày mà còn có tác dụng trong y học. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm kháng khuẩn của vi khuẩn lactic phân lập từ một số thực vật ở Việt Nam”. Mục tiêu ban đầu là phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và định danh.
Qua đó, xác định ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, enzyme tiêu hóa đến hoạt tính bacteriocin và sơ bộ tinh sạch bacteriocin nhằm góp phần làm phong phú thêm những thông tin cũng nhƣ tiềm năng ứng dụng từ bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp từ vi khuẩn LAB. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Sơ lƣợc về các loài thực vật dùng trong nghiên cứu Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật rất phong phú và đa dạng.
Thống kê cho thấy ở Việt Nam có đến 12000 loài thực vật có mạch bậc cao, sinh trƣởng trong các điều kiện sinh thái và hình thành các kiểu thảm thực vật khác nhau [2]. Từ trƣớc đến nay có rất nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu các cây thuốc và vị thuốc để chữa trị các bệnh nhƣ: GS. Đỗ Tất Lợi (1999) trong cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” giới thiệu 800 cây để làm thuốc; sách “Cây thuốc Việt Nam” của lƣơng y Lê Trần Đức (1997) có ghi 830 cây thuốc; TS. Võ Văn Chi (1997) với cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” có ghi 3200 cây thuốc trong đó có cả các loài cây thuốc nhập ngoại… Theo tài liệu của Viện dƣợc liệu (2000) thì Việt Nam có đến 3820 loài cây làm thuốc.
Nhƣng qua điều tra tìm hiểu thì con số này có thể đƣợc nâng lên vì kiến thức sử dụng cây thuốc của ngƣời dân còn chƣa đầy đủ. Ngoài công dụng làm thực phẩm trong cuộc sống hàng ngày thì một số tác dụng y học của mƣời loài thực vật đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng 1.1 dƣới đây: Bảng 1. Tác dụng y học của 10 loài thực vật STT Tên thực vật Tác dụng y học Cải xanh - Lợi tiểu, chữa ho, viêm khí quản, trị đau 1 Brassica juncea L., họ cải dây thần kinh [2,10]. Brassicaceae Sung - Trị kém ăn, mất ngủ; ghẻ lở ở trẻ em, da 2 Ficus racemosa, họ Dâu tằm mẩn sƣng đỏ…[2].
Moraceae 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Thanh nhiệt, giải các chất độc xâm nhập Rau muống vào cơ thể (nấm độc, sắn độc, cá thịt độc, 3 Ipomoea aquatica Forssk, họ lá ngón, khuẩn độc hoặc do côn trùng, rắn Khoai lang Convolvulaceae rết cắn.), mƣng nhọt, quai bị, lở ngứa, loét ngoài da; rôm sẩy, sởi, thủy đậu…[2]. - Thông đại tiện, hạ nhiệt, ăn uống không tiêu, đắp ngoài trị phỏng, rôm sảy. Lô hội - Chống viêm nhiễm dị ứng, lão hóa tế 4 Aloe vera, họ Huệ tây bào, giải độc cơ thể, điều trị các triệu Liliaceae chứng lâm sàng nhƣ: táo bón, đau lƣng, trị mụn nhọt, trị rôm sảy [9,14]. - Thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, thƣờng dùng để chữa các bệnh nhiễm Rau càng cua trùng đƣờng hô hấp, viêm họng, viêm ruột 5 Peperomia pellucida, họ Hồ thừa, viêm gan truyền nhiễm, viêm dạ dày tiêu Piperaceae - ruột, tiêu hóa kém, đau nhức xƣơng khớp, sốt rét [12].
Chanh - Trị ho, thanh nhiệt, chữa cảm cúm. Citrus aurantifolia, họ Cửu - Chữa bệnh chƣớng bụng ở trẻ nhỏ, tiểu 6 lý hƣơng Rutaceae bí, sốt rét và hen phế quản [2]. Mồng tơi - Giải độc, thanh nhiệt, chữa đại tiện bí 7 Basella alba L., họ Mồng tơi kết, đại tiện xuất huyết, tiểu tiện khó, tiểu Basellaceae dắt, chữa kiết lỵ hiệu quả [2]. Ngải cứu - Chữa trị các bệnh nhƣ kinh nguyệt 8 Artemisia vulgris L, họ Cúc không đều, bụng lạnh đau, tử cung lạnh 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Asteraceae không thể có thai, trị mụn trứng cá, mẩn ngứa, tẩy tế bào chết, giúp máu lƣu thông mạnh hơn, các cơ đang bị đau và chỗ bị sƣng hay viêm [5].
- Chống lạnh bụng, giảm đau, nôn mửa, Lá lốt đầy hơi, ngƣời bị bệnh tê thấp, hay đổ mồ 9 Piper lolot C., họ Hồ tiêu hôi tay, chân, chữa sâu răng, nhức răng Piperaceae [2]. Húng quế - Chữa cảm cúm, ho, kinh nguyệt không đều, thấp khớp, dùng ngoài da trị rắn cắn Ocimum basilicum L., họ 10 và sâu bọ đốt, viêm da, giảm đau, chữa Hoa môi Lamiaceae đau dạ dày, kém tiêu hóa, chữa đau sâu răng [1]. Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB) 1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Acid lactic Bacteria - LAB) là nhóm thu nhận năng lƣợng nhờ quá trình phân giải carbohydrate kị khí và sinh ra acid lactic.
Chúng thuộc họ Lactobacteriaceae, không hình thành bào tử, Gram dƣơng, hình que hoặc hình cầu, không di động, phản ứng oxidase và catalase âm tính [17]. Vi khuẩn lactic bao gồm các chi: Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus Symbiobacterium, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella và Bifìdobacterium [31,51]. Trong đó, các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus, Lactococcus và Enterococcus đƣợc ứng dụng nhiều trong lên men thực phẩm. Những vi sinh vật này góp phần tạo hƣơng vị cho sản phẩm và ức chế vi khuẩn gây bệnh bằng cách tạo các hợp chất kháng khuẩn nhƣ acid lactic cùng với các acid hữu cơ khác, hydrogen, peroxide, peptide kháng khuẩn và bacteriocin [26,28,35].
4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lactobacillus Lactobacillus là chi lớn nhất trong bộ Lactobacillales với hơn 80 loài và phân loài đƣợc công nhận [61]. Các vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus là Gram dƣơng, không sinh bào tử, không di động và catalase âm tính. Các chủng Lactobacillus có thể thực hiện trao đổi chất theo cả hai con đƣờng lên men đồng hình và dị hình. Nhiệt độ tăng trƣởng dao động từ 2 đến 53oC và chúng có thể phát triển trong khoảng pH từ 3 đến 8 nhƣng điều kiện tăng trƣởng tối ƣu thƣờng là 30 - 40oC và pH 5,5 - 6,2 [64].
Chúng phân bố rất nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã đƣợc ứng dụng trong thực phẩm do chúng có mặt trong cơ thể ngƣời (khoang miệng, đƣờng tiêu hóa,.) và trong một số thực phẩm lên men nhƣ thịt, sữa, rau quả, ngũ cốc [42]. Lactococcus Chi Lactococcus đƣợc phát sinh từ một nhánh của chi Streptococcus. Những nghiên cứu gần đây cho thấy chi này có 5 loài, gồm L. piscum; trong đó loài L.
lactis có 3 dƣới loài là L. Chúng là vi khuẩn Gram dƣơng, hình cầu, dị dƣỡng, ƣa ẩm và không sinh bào tử. Nhiệt độ tăng trƣởng tối ƣu là 30oC nhƣng chúng có thể tồn tại ở 10oC và không sống sót ở 45oC. Ngoài ra các chủng Lactococcus có khả năng tăng trƣởng trong môi trƣờng có pH từ 3,5 - 9,2 nhƣng bị chết ở pH 9,6 cũng nhƣ tồn tại đƣợc trong môi trƣờng có nồng độ NaCl thấp hơn 6,5%.
Chúng đƣợc ứng dụng trong công nghiệp chế biến sữa, sản xuất protein tái tổ hợp và mới nhất hiện nay là sử dụng trong các liệu pháp điều trị chống lại các bệnh truyền nhiễm và không truyền nhiễm [71]. Enterococcus Chi Enterococcus thuộc Gram dƣơng, không bào tử, catalase âm tính, oxidase âm tính và kị khí. Theo Foulquie´ Moreno và cộng sự, đến năm 2006, có 28 loài là E. pallens, 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
villorum đã đƣợc phát hiện. Nhiệt độ sinh trƣởng dao động từ 10 đến 45oC, nhƣng tối ƣu là ở 35oC. Ngoài ra, các chủng Enterococcus cũng có thể phát triển trong môi trƣờng chứa NaCl 6,5%, ở pH 9,6 và chúng tồn tại ở -60oC trong 30 phút [39]. Trao đổi chất của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic đƣợc chia thành hai nhóm dựa trên đặc điểm lên men: Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose.
Các vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đƣờng theo con đƣờng EMP (Embden - Meyerhof - Parnas Pathway). Phƣơng trình tóm tắt của quá trình lên men đồng hình nhƣ sau: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3CHOHCOOH + 2ATP Glucose Acid lactic Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình thƣờng gặp là Lactococus lactis, L. delbrueckii, Streptococcus cermoris… [40,43]. Lên men dị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lƣợng ethanol, acid acetic và CO2.
Phƣơng trình tóm tắt của quá trình lên men dị hình nhƣ sau: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3CH2OH + CO2 + xKcal Glucose Acid lactic Ethanol Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình thƣờng gặp là L. manihotivorans, Leucnostoc, Oenococcus, Weissella. 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic 1.
Carbohydrate Carbohydrate là nguồn cung cấp carbon và năng lƣợng chính cho sự sinh trƣởng của vi khuẩn lactic bằng cách tạo ra các hợp chất khác nhau (chủ yếu là acid lactic) thông qua quá trình lên men. Ngoài ra, carbon cũng có thể đƣợc lấy từ protein, acid amin và glycerol. Vi khuẩn lactic sử dụng đƣợc hầu hết các loại đƣờng, nhƣng glucose là nguồn carbon thích hợp nhất và tùy từng loại LAB khác nhau mà nguồn carbon phù hợp đƣợc lựa chọn. acidophilus đã cho thấy tăng trƣởng tốt hơn khi glucose đƣợc thay thế bằng maltose; S.
thermophilus thƣờng sử dụng đƣờng lactose không phải glucose.