ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật vào trong đời sống và sản xuất đã trở nên rất phổ biến. Con ngƣời đã và đang khai thác triệt để nguồn tài nguyên vi sinh vật trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong y học, nhờ có vi sinh vật mà con ngƣời đã tổng hợp thành công nhiều loại chế phẩm nhƣ vacxin, kháng sinh, hormone, vitamin giúp phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh cho con ngƣời. Trong nông nghiệp, nhiều chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đã đƣợc sản xuất để diệt trừ sâu bệnh hại cây và làm phân bón vi sinh.
Trong công nghiệp thực phẩm, con ngƣời đã ứng dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại protein, enzyme, chế phẩm probiotic và các loại thực phẩm lên men truyền thống. Ngoài ra, vi sinh vật còn đƣợc ứng dụng vào trong xử lý rác thải hữu cơ và nƣớc thải trong sản xuất công nghiệp. Với khả năng chuyển hóa mạnh mẽ và sinh sản nhanh chóng, vi sinh vật đóng một vai trò to lớn trong hệ sinh thái tự nhiên và trong các hoạt động cải thiện chất lƣợng cuộc sống của con ngƣời. Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên đƣợc phát hiện và mô tả trong giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19.
Đây là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que và có khả năng sinh nội bào tử. Chúng phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên, từ trên cạn đến dƣới nƣớc, từ nƣớc ngọt đến nƣớc mặn và từ ven bờ đến đáy các Đại Dƣơng. Ngoài các loài vi khuẩn gây bệnh cho con ngƣời nhƣ B. cereus, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus đặc biệt là nhóm B.
subtilis có tính ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nhƣ y dƣợc học, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm và xử lý môi trƣờng. Do đó, các loài thuộc chi Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Nhằm góp phần tìm hiểu thêm kiến thức về chi Bacillus nói chung và ứng dụng của các loài thuộc nhóm B. subtilis nói riêng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu các đặc tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp.
plantarum SP 1901 phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên” với 4 mục tiêu chính sau: (i) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn thuộc nhóm B. subtilis phân lập tại rừng Quốc gia Hoàng Liên. (ii) Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự đa gen để phân loại chính xác các chủng vi khuẩn nghiên cứu đến cấp độ loài và dƣới loài. 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com (iii) Tìm hiểu các đặc tính sinh học quý của chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn.
(iv) Tách chiết, tinh sạch và đánh giá sơ bộ đặc tính các enzyme ngoại của chủng vi khuẩn nghiên cứu. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là một loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis [45].
subtilis đƣợc Christion Erenberg phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835, tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là ―Vibrio subtilis‖. Năm 1872, nhà sinh học ngƣời Đức Ferdinand Cohn đã đặt tên cho loài vi khuẩn này là Bacillus subtilis. Trong thế chiến thứ hai, tổ chức y học Nazi (Đức) đã dùng B. subtilis để phòng bệnh lị cho các binh lính chiến đấu ở Bắc Phi.
Từ đó đến nay, B. subtilis đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên Thế giới. Thuật ngữ ―Subtilis therapy‖ (điều trị bằng subtilis) ra đời từ đó và B. subtilis ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi để phòng ngừa và điều trị các loại bệnh về rối loạn đƣờng tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy.
subtilis đã đƣợc chứng minh có tiềm năng to lớn trong nhiều lĩnh nhƣ chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trƣờng [8]. subtilis có mặt ở hầu hết các loại môi trƣờng tự nhiên. Phần lớn cƣ trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô nên đƣợc gọi là ―trực khuẩn cỏ khô‖. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất nhƣ bột mì (trong bột mì B.
subtilis chiếm 75-79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo và trong các thực phẩm nhƣ mắm, tƣơng và chao [12]. subtilis có vai trò to lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác do tác dụng của những sản phẩm ngoại bào của nó. Công trình nghiên cứu của Work và cộng sự năm 1959 đã cho thấy B. subtilis có hệ thống enzyme tƣơng đối hoàn chỉnh, có khả năng thủy phân carbohydrate và protein.
subtilis còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nhƣ bacitracin, bacilysin, bacillomicin, bacillopectin, mycobacillin, subtilin và prolimicin. Những chất này có tác dụng ức chế sinh trƣởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác. Chúng tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm, gram dƣơng và nấm gây bệnh [9]. subtilis gồm ít nhất 9 loài vi khuẩn là B.
Kết quả phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy mức độ tƣơng đồng giữa chúng rất cao (> 99%). Bên cạnh đó, phƣơng pháp phân loại truyền thống dựa trên hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com và bào tử cũng nhƣ các đặc điểm sinh hóa không có khả năng phân tách các loài này. Vì vậy, 9 loài vi khuẩn trên thƣờng đƣợc gọi theo một thuật ngữ chung là nhóm vi khuẩn B. Gần đây, bên cạnh việc phân tích trình tự gen 16S rRNA các nhà khoa học đã sử dụng phƣơng pháp phân tích trình tự đa gen trong việc phân loại vi khuẩn đến cấp độ loài và dƣới loài [25].
Đặc biệt trong nhóm B. subtilis, bằng phƣơng pháp phân tích trình tự đa gen và xây dựng cây phát sinh chủng loại, nhiều loài trong nhóm này đã đƣợc phân tách thành các loài phụ nhƣ B. subtilis đƣợc phân thành B. amyloliquefaciens đƣợc phân thành B.
Phân loại các loài trong nhóm B. subtilis nói chung và B. amyloliquefaciens nói riêng đòi hỏi phải có sự tổ hợp của nhiều phƣơng pháp phân loại hiện đại. Hiện nay ở Việt Nam hầu nhƣ chƣa có bất cứ một nghiên cứu nào công bố chính xác một loài vi khuẩn phân lập trong hệ sinh thái tự nhiên đến cấp độ dƣới loài dựa trên việc phân tích trình tự đa gen.
Lịch sử phát hiện B. amyloliquefaciens đƣợc Fukomoto phát hiện vào năm 1943 nhờ khả năng sinh α-amylase và protease. Tại thời điểm đó, loài vi khuẩn này chƣa đƣợc xếp loại trong bảng Danh pháp Vi khuẩn. Cho đến năm 1975, theo điều 24a và 28a trong Bộ luật Quốc tế về Danh pháp Vi khuẩn thì cái tên B.
amyloliquefaciens mới đƣợc công bố [43]. Thời gian đầu, loài vi khuẩn này đƣợc xem là dòng khác của B. subtilis hay loài phụ B. amyloliquefaciens mang rất nhiều đặc điểm tƣơng đồng với các loài B.
Bằng các phƣơng pháp phân loại thông thƣờng rất khó để phân biệt giữa chúng. amyloliquefaciens mới đƣợc tách ra thành một loài riêng dựa vào kết quả lai DNA lần lƣợt là 23, 15 và 5% so với các loài B. Từ đó đến nay, nhiều chủng B. amyloliquefaciens phân lập từ các hệ sinh thái khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau đã đƣợc công bố.
Năm 2010, Borriss và cộng sự đã chứng minh sự khác biệt về chỉ số lai DNA, chỉ số so sánh hệ gen bằng kỹ thuật microarray, tính tƣơng đồng của toàn bộ hệ genome và phổ các chất hoạt tính lipopeptide và polypeptide giữa một nhóm B. amyloliquefaciens DSM7 không 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com có khả năng và một nhóm B. amyloliquefaciens FZB42 có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật. Dựa vào kết quả thu đƣợc, Borriss đã đề xuất tách B.
amyloliquefaciens thành 2 nhóm loài phụ là B. Phân loại Theo phân loại của Bergey (1974) [24], B. amyloliquefaciens thuộc: Giới: Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Nhóm: Bacillus subtilis Loài: Bacillus amyloliquefaciens 1. Đặc điểm sinh học và phân bố trong tự nhiên B.
amyloliquefaciens thƣờng có mặt trong các mẫu đất tự nhiên. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram dƣơng, sinh nội bào tử, có khả năng di động và kích thƣớc tế bào 3,0-4,0 × 0,7-1,5 µm. Đặc biệt, có một số chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens có khả năng sống nội cộng sinh rễ cây thực vật [23].
ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS 1. Sản xuất enzyme công nghiệp Loài vi khuẩn này đƣợc biết đến từ rất sớm nhờ khả năng sản sinh các loại enzyme ngoại bào đa dạng. amyloliquefaciens đã đƣợc sử dụng để sản xuất 2 loại enzyme công nghiệp là α-amylase và protease [43]. amyloliquefaciens nhƣ amylase, xylanase, cellulase, protease và lipase có nhiều đặc tính quý nhƣ khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và khả năng bền nhiệt.
Do đó, enzyme từ B. amyloliquefaciens đã đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa [21]. 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bên cạnh đó, nhóm B. amyloliquefaciens sống nội cộng sinh rễ cây thực vật có khả năng sinh phytase đã đƣợc công bố và gen mã hóa phytase của chúng đã đƣợc biểu hiện thành công trên chủng B.
Phytase là enzyme phân giải phytate khó tan trong các loại rau, củ và quả thành myo-inositol và các dạng phosphate hòa tan dễ hấp thụ trong hệ tiêu hóa động vật. Vì vậy, phytase đã đƣợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho nhóm động vật dạ dầy đơn và làm giảm nguy cơ ô nhiễm môi trƣờng do hàm lƣợng phosphate dƣ thừa thải ra môi trƣờng nƣớc [29]. Sản xuất chất kháng sinh Các loài thuộc nhóm B. subtilis đã đƣợc biết đến nhờ khả năng sinh các chất kháng sinh kháng vi khuẩn và nấm gây bệnh hoặc sản sinh các sản phẩm trao đổi bậc hai khác nhƣ chất kháng virus, chất kháng ung thƣ và chất ức chế miễn dịch [47].
Chất kháng sinh từ Bacillus có bản chất là các peptide đƣợc tổng hợp qua ribosome (còn gọi là bacteriocin hoặc lantibiotics). Lantibiotics có phổ kháng khuẩn hẹp và thƣờng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Nhiều chất kháng sinh có bản chất peptide tổng hợp không qua ribosome cũng đã đƣợc công bố từ loài B. amyloliquefaciens nhƣ bacylicin, lipopeptide (surfactin, fengycin, iturin và bacillomycin) và polyketide (difficidin, bacillaene và macrolactin) [18] [38].
Bacylicin là chất dipeptide đƣợc tạo nên từ L-analine và một amino axít hiếm L- anticapsin. Bacylicin có khả năng ức chế vi khuẩn Erwinia amylovora gây bệnh cháy lá trên táo và lê. Surfactin hoạt động nhƣ chất tẩy rửa trên màng tế bào.