Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Axit gamma-aminobutyric (GABA) là một axit amin không chứa protein gồm 4 carbon, giữ vai trò là chất dẫn truyền thần kinh ức chế chủ yếu tại hệ thần kinh trung ương ở động vật có vú. Hợp chất này tham gia vào nhiều cơ chế sinh học quan trọng như an thần, giảm căng thẳng, hạ huyết áp, lợi tiểu, ngăn ngừa co giật, cải thiện giấc ngủ và hỗ trợ điều hòa tiết insulin từ tuyến tụy. Do nhu cầu ứng dụng GABA ngày càng cao trong các lĩnh vực thực phẩm chức năng và dược phẩm, việc khai thác các con đường sinh tổng hợp tự nhiên thông qua hoạt tính enzyme glutamate decarboxylase (GAD) của các vi sinh vật an toàn đang nhận được sự quan tâm rộng rãi. Trong số các đối tượng vi sinh vật, vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) thuộc các chi như Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc được đánh giá là nguồn sinh tổng hợp sinh học an toàn (GRAS) và có khả năng chuyển hóa glutamate thành GABA hiệu quả.

Song song đó, cám gạo là một phụ phẩm dồi dào từ quá trình xay xát lúa gạo, chiếm khoảng 10% trọng lượng hạt thóc. Phụ phẩm này sở hữu nguồn dinh dưỡng dồi dào với hàm lượng lipid từ 12% đến 22%, protein từ 7% đến 8%, cùng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như gamma-oryzanol, tocopherol, tocotrienol và axit ferulic. Mặc dù giàu giá trị, cám gạo hiện chủ yếu chỉ được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi hoặc chiết xuất dầu thô, giá trị kinh tế thu được chưa tương xứng với tiềm năng. Việc ứng dụng công nghệ lên men vi khuẩn lactic trên cơ chất cám gạo nhằm nâng cao hàm lượng GABA tự nhiên vừa giải quyết được bài toán gia tăng giá trị cho phụ phẩm nông nghiệp, vừa tạo ra nguồn nguyên liệu giàu hoạt tính sinh học cho ngành công nghệ thực phẩm.

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài khóa luận "Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic có khả năng sinh tổng hợp gamma - aminobutyric axit từ thực phẩm lên men và ứng dụng trong lên men trên cám gạo" được thực hiện với mục đích tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính tổng hợp GABA cao từ các loại thực phẩm lên men truyền thống, từ đó ứng dụng vào quá trình lên men trên nền cơ chất cám gạo.

Để thực hiện mục đích này, đề tài xác định 5 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Xác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm lên men.
  2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn lactic đến khả năng hình thành GABA thông qua hoạt động chuyển hóa monosodium glutamate (MSG).
  3. Nghiên cứu kiểm tra khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn.
  4. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp GABA khi lên men trên cơ chất cám gạo bằng các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau.
  5. Định danh các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn thông qua phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ 6 mẫu thực phẩm lên men truyền thống; cơ chất cám gạo thu thập tại Việt Nam; 7 chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm cả vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và nấm men; enzyme GAD và hợp chất GABA.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học - Vi sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, phối hợp với Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia Hà Nội).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài hoàn thành và bảo vệ trong năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thuộc loại hình nghiên cứu thực nghiệm ứng dụng công nghệ sinh học và vi sinh vật học thực phẩm. Cơ sở lý thuyết của nghiên cứu dựa trên con đường chuyển hóa glutamate thành GABA được xúc tác bởi enzyme glutamate decarboxylase (GAD, EC 4.1.1.15) với sự hỗ trợ của coenzyme pyridoxal-5'-phosphate (PLP), cùng các đặc tính sinh hóa - sinh lý học của nhóm vi khuẩn lactic và thành phần hóa thực vật trong phụ phẩm cám gạo.

Nghiên cứu kết hợp nhiều phương pháp thực nghiệm vi sinh vật học, sinh hóa phân tích và sinh học phân tử:

  • Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi sinh vật: Thu thập mẫu từ các nguồn thực phẩm lên men tự nhiên và thương mại; pha loãng mẫu theo nồng độ thập phân ($10^{-1}$ đến $10^{-5}$); cấy trải trên môi trường chọn lọc MRS agar có bổ sung 1% $\text{CaCO}_3$; ủ ở 37°C trong 48 giờ để tuyển chọn các khuẩn lạc tạo vòng phân giải canxi cacbonat. Chủng giống được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng ở 4°C và trong dung dịch glycerol 20% ở nhiệt độ -80°C.
  • Phương pháp hình thái và sinh hóa: Đánh giá hình thái khuẩn lạc qua mắt thường và kính hiển vi; xác định thành vách tế bào thông qua phương pháp nhuộm Gram; kiểm tra hoạt tính enzyme catalase bằng dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ 3% với chủng đối chứng Bacillus cereus.
  • Phương pháp phân tích định tính GABA: Sử dụng kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC) trên bản mỏng silicagel. Pha động gồm hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước theo tỷ lệ thể tích 5:2:2. Phát hiện vết bằng dung dịch ninhydrin 0,4% trong ethanol, hiện màu ở nhiệt độ 90–95°C trong 15 phút.
  • Phương pháp phân tích định lượng GABA: Đo độ hấp thụ quang phổ (OD) tại bước sóng 645 nm sau phản ứng so màu với thuốc thử ninhydrin. Hàm lượng GABA được tính toán dựa trên đường chuẩn GABA tinh khiết nồng độ từ 0 đến 20 µg/mL với phương trình hồi quy tuyến tính $y = 33,1393x + 1,042$ ($R^2 = 0,99$).
  • Phương pháp thử nghiệm kháng vi sinh vật: Dùng kỹ thuật khuếch tán đục lỗ thạch (agar well diffusion) trên môi trường LB. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá thông qua đường kính vòng ức chế $VVK = D - d$ (mm), trong đó $D$ là đường kính vòng vô khuẩn và $d$ là đường kính lỗ thạch.
  • Phương pháp sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn; khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi phổ biến 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTAG-3') và 1492R (5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'); điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose; giải trình tự nucleotide và so sánh độ tương đồng bằng công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu NCBI; dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp Neighbor-Joining.
  • Phương pháp xử lý dữ liệu: Toàn bộ số liệu thực nghiệm được thống kê, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn bằng phần mềm Microsoft Excel.

Nguồn dữ liệu và vật liệu sử dụng trong nghiên cứu:

  • Mẫu thực phẩm lên men: Thu thập tại chợ Voi, chợ Gia Lâm và hệ thống siêu thị Winmart (Hà Nội), gồm 6 loại: nước dưa cải muối (mẫu DC2 và DCI3), kim chi (KC4), sữa chua nha đam (SCND8), phô mai (PM11), sữa chua Proby (Lcs10).
  • Vi sinh vật kiểm định: Gồm 7 chủng chuẩn được cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội:
    • Nhóm vi khuẩn Gram âm: Escherichia coli ATCC 11105, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhi ATCC 14028.
    • Nhóm vi khuẩn Gram dương: Staphylococcus aureus ATCC 33591, Enterococcus hirae ATCC 10541, Micrococcus luteus ATCC 9341.
    • Nhóm nấm men: Candida albicans ATCC 10231.
  • Cơ chất lên men: Cám gạo thu thập từ quá trình chế biến gạo, được sấy khô ở 105°C trong 24 giờ và khử trùng ở 121°C trong 15 phút trước khi tiến hành lên men.

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Đặt vấn đề

Phần này trình bày tính cấp thiết của việc tìm kiếm các giải pháp gia tăng giá trị cho phụ phẩm nông nghiệp tại Việt Nam, đặc biệt là nguồn cám gạo dồi dào. Tác giả phân tích tiềm năng của vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống trong việc tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh GABA. Trên cơ sở đó, tác giả xác định mục tiêu tổng quát, 5 yêu cầu nghiên cứu cụ thể, đối tượng nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn của đề tài trong việc tạo tiền đề công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng lên men giàu GABA.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến ba nội dung cốt lõi:

  • Tổng quan về chất dẫn truyền thần kinh GABA: Đặc tính hóa lý, cấu trúc phân tử gồm 4 carbon, cơ chế thụ thể GABA_A và GABA_B, các tác dụng dược lý trong điều hòa huyết áp, an thần, hỗ trợ điều trị đột quỵ, bệnh Parkinson và cải thiện hoạt động tuyến tụy. Tổng quan cũng chỉ rõ con đường chuyển hóa glutamate thành GABA nhờ enzyme GAD phụ thuộc PLP và con đường phụ từ putrescine.
  • Tổng quan về nhóm vi khuẩn lactic: Lịch sử phát hiện từ Scheele (1780), Pasteur (1857) đến Lister (1873); đặc điểm sinh lý học (Gram dương, không sinh catalase, kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý, lên men lactic đồng hình hoặc dị hình); khả năng tiết các chất kháng khuẩn tự nhiên (bacteriocin); tổng kết các nghiên cứu sinh GABA nổi bật trên thế giới như các chủng L. brevis NCL912 (103,7 g/L), L. buchneri WPZ001 (129,2 g/L), L. plantarum GB01-21 (80,5 g/L).
  • Tổng quan về dinh dưỡng và hoạt tính sinh học của cám gạo: Khẳng định cám gạo chiếm khoảng 10% khối lượng hạt lúa nhưng tập trung phần lớn các dưỡng chất quý như carbohydrate (khoảng 80%), protein (7-8%), lipid (12-22%). Tác giả đi sâu phân tích giá trị của các hợp chất thứ cấp trong dầu cám gạo gồm hỗn hợp este axit ferulic của phytosterol (gamma-oryzanol có hoạt tính chống oxy hóa cao gấp 4 lần tocopherol), tocotrienol và axit ferulic tự do có tác dụng hạ cholesterol, dọn gốc tự do và bảo vệ tế bào.

Phần 3: Vật liệu và phương pháp thí nghiệm

Phần này mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị thí nghiệm và quy trình triển khai 5 nội dung nghiên cứu. Quy trình phân lập vi khuẩn lactic trên đĩa thạch MRS có bổ sung $\text{CaCO}_3$ được chuẩn hóa. Các thao tác kỹ thuật được trình bày mạch lạc: phương pháp nhuộm Gram, thử nghiệm catalase, kỹ thuật sắc ký bản mỏng phát hiện vết GABA, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 645 nm để lập đường chuẩn định lượng. Đồng thời, tác giả mô tả chi tiết quy trình xử lý nhiệt cơ chất cám gạo, bổ sung 2% MSG, điều chỉnh độ ẩm đến 60%, phối trộn tỷ lệ giống 2% và vận hành quá trình lên men ở hai mốc nhiệt độ 37°C và 45°C trong các khoảng thời gian 24, 48 và 72 giờ. Quy trình khuếch đại gen 16S rRNA bằng PCR và phân tích phả hệ cũng được cụ thể hóa về thành phần phản ứng và chu nhiệt độ.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung trình bày và phân tích các số liệu thu được từ thực nghiệm:

  • Phân lập và đặc tính sinh học: Từ 6 mẫu thực phẩm lên men ban đầu, tác giả đã tuyển chọn được 25 chủng vi khuẩn tạo vòng phân giải $\text{CaCO}_3$. Toàn bộ 25 chủng này đều là vi khuẩn Gram dương ($+$) và cho kết quả thử nghiệm catalase âm tính ($-$), khuẩn lạc có đường kính từ 0,5 đến 3 mm, dạng que ngắn hoặc hình cầu, bề mặt bóng hoặc hơi nhăn, có màu sắc từ trắng sữa đến trắng đục.
  • Đánh giá khả năng chuyển hóa glutamate: Phân tích sắc ký bản mỏng TLC ghi nhận 21 trên tổng số 25 chủng có khả năng sinh tổng hợp GABA từ tiền chất MSG 2%. Định lượng quang phổ cho thấy hàm lượng GABA tạo ra trong dịch nuôi cấy dao động từ 0,765 mg/mL đến 4,474 mg/mL. Chủng SCND8.4 có khả năng sinh GABA thấp nhất (0,765 mg/mL), trong khi hai chủng DCI3.5 (phân lập từ nước dưa cải muối) và KC4.5 (phân lập từ kim chi) đạt năng lực sinh tổng hợp cao nhất, lần lượt là 4,474 mg/mL và 24,47 mg/L (hoặc đạt mức vượt trội trong các mẫu khảo sát). Hai chủng này được lựa chọn để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo.
  • Khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định: Thử nghiệm đục lỗ thạch chứng minh cả hai chủng tuyển chọn đều có phổ kháng khuẩn rộng đối với cả 7 chủng vi sinh vật chỉ thị, với đường kính vòng vô khuẩn dao động trong khoảng từ 14,0 mm đến 21,5 mm. Chủng KC4.5 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ đối với Staphylococcus aureus (vòng kháng đạt $21,5 \pm 0,5$ mm), Pseudomonas aeruginosa ($18,5 \pm 0,5$ mm), Enterococcus hirae ($20,5 - 21,5$ mm) và nấm men Candida albicans.
  • Động thái sinh tổng hợp GABA trên cơ chất cám gạo:
    • Ở nhiệt độ 45°C: Chủng KC4.5 sinh GABA tăng dần và đạt đỉnh ở 48 giờ nuôi cấy với hàm lượng $3,965$ mg/100g (hoặc 3,97 mg/100g), sau đó suy giảm vào thời điểm 72 giờ. Chủng DCI3.5 đạt cực đại sớm hơn ở 24 giờ với $2,55$ mg/100g và giảm xuống $1,35$ mg/100g ở 48 giờ.
    • Ở nhiệt độ 37°C: Chủng DCI3.5 đạt hàm lượng GABA cao nhất tại thời điểm 24 giờ với $3,197$ mg/100g (hoặc 3,2 mg/100g), sau đó giảm dần ở các mốc 48 giờ và 72 giờ. Chủng KC4.5 đạt đỉnh tại 24 giờ với $1,78$ mg/100g rồi giảm dần.
  • Kết quả định danh phân tử: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA của hai chủng DCI3.5 và KC4.5 cho vạch điện di rõ nét ở kích thước khoảng 1500 bp, xác nhận hai chủng tuyển chọn thuộc nhóm vi khuẩn lactic sinh học an toàn.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các phát hiện thực nghiệm cốt lõi của khóa luận và đề xuất các giải pháp kỹ thuật mở rộng nhằm tiếp tục nghiên cứu nâng cao hiệu suất lên men ở quy mô pilot.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã thu thập và hệ thống hóa được các dữ liệu thực nghiệm cụ thể:

Chỉ tiêu thực nghiệm Chủng DCI3.5 (Nước dưa cải muối) Chủng KC4.5 (Kim chi)
Nguồn gốc phân lập Nước dưa cải muối Kim chi truyền thống
Đặc điểm hình thái Khuẩn lạc tròn, trắng sữa, que ngắn Khuẩn lạc tròn, nhầy bóng, que ngắn
Đặc tính sinh hóa Gram (+), Catalase (-) Gram (+), Catalase (-)
Khả năng sinh GABA trong MRS + 2% MSG 4,474 mg/mL Sinh tổng hợp mạnh trên bản TLC
Kháng Staphylococcus aureus ($D-d$) Tạo vòng ức chế rõ $21,5 \pm 0,5$ mm
Kháng Pseudomonas aeruginosa ($D-d$) Tạo vòng ức chế rõ $18,5 \pm 0,5$ mm
Hàm lượng GABA cực đại trên cám gạo ở 37°C 3,197 mg/100g (tại 24 giờ) 1,78 mg/100g (tại 24 giờ)
Hàm lượng GABA cực đại trên cám gạo ở 45°C 2,55 mg/100g (tại 24 giờ) 3,965 mg/100g (tại 48 giờ)
Kích thước đoạn gen 16S rRNA khuếch đại ~1500 bp ~1500 bp

Đóng góp của nghiên cứu:

  • Phân lập thành công 25 chủng vi khuẩn lactic bản địa từ các nguồn thực phẩm lên men quen thuộc tại Việt Nam, chứng minh có tới 21/25 chủng (chiếm 84%) sở hữu enzyme GAD có khả năng chuyển hóa glutamate thành GABA.
  • Tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn lactic triển vọng cao là DCI3.5 và KC4.5 có hoạt tính sinh tổng hợp GABA nổi trội đồng thời mang đặc tính đối kháng vi sinh vật gây bệnh phổ rộng (ức chế tốt cả vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và nấm men kiểm định).
  • Xác định được thông số công nghệ nhiệt độ và thời gian tối ưu cho từng chủng khi lên men trên cơ chất cám gạo: Chủng DCI3.5 thích hợp lên men ở 37°C trong vòng 24 giờ, trong khi chủng KC4.5 đạt hiệu suất sinh GABA cao nhất khi lên men ở 45°C trong 48 giờ.

Kiến nghị của tác giả:

  • Tiếp tục tối ưu hóa các thông số công nghệ lên men trạng thái rắn trên cơ chất cám gạo như tỷ lệ phối trộn MSG, độ ẩm cơ chất ban đầu, pH môi trường và kích thước hạt cám.
  • Khảo sát biến thiên hàm lượng các hợp chất sinh học khác trong cám gạo sau lên men như gamma-oryzanol, axit ferulic và khả năng chống oxy hóa tổng số.
  • Nghiên cứu mở rộng quy mô lên men và thử nghiệm an toàn sinh học để tiến tới ứng dụng sản phẩm bột cám gạo lên men giàu GABA trong chế biến thực phẩm chức năng hoặc dinh dưỡng vật nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

  • Quy mô thí nghiệm chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác), chưa khảo sát các yếu tố vận hành trong hệ thống thiết bị lên men bán công nghiệp hoặc pilot.
  • Quá trình lên men trên cám gạo mới chỉ khảo sát biến thiên của hàm lượng GABA ở hai mức nhiệt độ (37°C và 45°C) và ba mốc thời gian (24, 48, 72 giờ), chưa mở rộng khảo sát các dải nhiệt độ trung gian cũng như ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ban đầu và độ ẩm tới hoạt lực của hệ enzyme.
  • Hiện tượng hàm lượng GABA bị suy giảm sau khi đạt đỉnh (ở mốc 48 giờ đối với DCI3.5 hoặc 72 giờ đối với KC4.5) được quan sát nhưng cơ chế phân hủy hoặc chuyển hóa tiếp theo của GABA bởi hệ vi sinh vật chưa được phân tích sâu sắc.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Khảo sát bổ sung các yếu tố đồng kích hoạt phản ứng khử carboxyl như nồng độ cofactor PLP, ion kim loại ($\text{Ca}^{2+}$, $\text{Mg}^{2+}$) và thiết lập mô hình bề mặt đáp ứng (RSM) để tối ưu hóa toàn diện quá trình lên men cám gạo.
  • Đánh giá khả năng sống sót của chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn trong điều kiện dịch tiêu hóa nhân tạo (pH dạ dày và muối mật) để xem xét khả năng ứng dụng trực tiếp dưới dạng chế phẩm probiotic kết hợp postbiotic.
  • Phân tích chi tiết thành phần biến đổi của chất béo, protein hòa tan và các chất chống oxy hóa trong khối cám gạo sau quá trình lên men vi sinh.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học thực phẩm, Công nghệ thực phẩm và Sau thu hoạch đang tìm kiếm quy trình phân lập vi khuẩn lactic sinh GABA và phương pháp phân tích hợp chất này.
  • Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp phát triển sản phẩm định hướng gia tăng giá trị chuỗi sản xuất lúa gạo, khai thác phụ phẩm nông nghiệp tạo ra các sản phẩm giá trị gia tăng cao.
  • Các đề tài nghiên cứu liên quan đến kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC), định lượng so màu ninhydrin và kỹ thuật khuếch đại gen 16S rRNA phục vụ phân loại vi khuẩn.

Các nội dung có giá trị tham khảo kỹ thuật cao trong khóa luận bao gồm:

  • Quy trình phân lập chọn lọc vi khuẩn lactic bằng môi trường MRS thạch bổ sung $\text{CaCO}_3$ và phản ứng định tính/định lượng GABA chi tiết từ bước xử lý mẫu đến pha chế thuốc thử.
  • Số liệu so sánh về khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic đối với 7 chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế (ATCC).
  • Động thái tích lũy GABA trên nền cơ chất phụ phẩm cám gạo qua các mốc thời gian và nhiệt độ khác nhau.

Câu hỏi thường gặp

1. Tiêu chí nào được sử dụng để sơ tuyển các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp GABA từ các mẫu thực phẩm lên men?
Quá trình tuyển chọn diễn ra qua hai giai đoạn liên tiếp: Trước hết, các chủng vi sinh vật được phân lập trên môi trường MRS agar bổ sung 1% $\text{CaCO}_3$ để chọn các khuẩn lạc có vòng phân giải canxi cacbonat, sau đó kiểm tra đặc tính Gram dương và catalase âm tính. Tiếp theo, các chủng này được nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng có bổ sung 2% MSG và kiểm tra dịch lên men bằng sắc ký bản mỏng (TLC) với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước (5:2:2 v/v/v), hiện màu bằng ninhydrin để phát hiện sự xuất hiện của vết GABA so với mẫu chuẩn đối chứng.

2. Hai chủng vi khuẩn lactic nào cho hiệu quả tổng hợp GABA cao nhất và nguồn gốc phân lập từ đâu?
Hai chủng vi khuẩn lactic ưu việt nhất được tuyển chọn là DCI3.5 và KC4.5. Chủng DCI3.5 được phân lập từ mẫu nước dưa cải muối (thu thập tại chợ dân sinh), có khả năng sinh tổng hợp GABA đạt 4,474 mg/mL trong môi trường MRS bổ sung 2% MSG. Chủng KC4.5 được phân lập từ mẫu kim chi thương mại, thể hiện hoạt tính sinh tổng hợp GABA mạnh mẽ và khả năng kháng khuẩn vượt trội.

3. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng tuyển chọn KC4.5 được đánh giá như thế nào đối với các vi sinh vật kiểm định?
Chủng KC4.5 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng khi ức chế cả vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và nấm men kiểm định bằng phương pháp đục lỗ thạch. Cụ thể, chủng tạo vòng ức chế mạnh nhất đối với Staphylococcus aureus ATCC 33591 với đường kính vòng vô khuẩn đạt $21,5 \pm 0,5$ mm, tiếp đến là Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 đạt $18,5 \pm 0,5$ mm, Enterococcus hirae ATCC 10541 đạt từ 20,5 đến 21,5 mm, đồng thời có khả năng ức chế nấm men Candida albicans ATCC 10231.

4. Điều kiện nhiệt độ và thời gian lên men tối ưu trên cơ chất cám gạo của hai chủng DCI3.5 và KC4.5 khác nhau như thế nào?
Hai chủng có sự thích ứng nhiệt độ và động học tích lũy GABA khác biệt rõ rệt trên cơ chất cám gạo: Chủng DCI3.5 đạt hàm lượng GABA cực đại ($3,197$ mg/100g) khi lên men ở 37°C sau 24 giờ nuôi cấy, sau đó giảm dần nếu kéo dài thời gian. Ngược lại, chủng KC4.5 hoạt động hiệu quả hơn ở điều kiện nhiệt độ cao 45°C, đạt hàm lượng GABA cao nhất là $3,965$ mg/100g sau 48 giờ lên men trước khi suy giảm ở mốc 72 giờ.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Chu Hồ Lan Anh đã phân lập thành công 25 chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống, trong đó ghi nhận 21 chủng có hoạt tính enzyme chuyển hóa glutamate thành GABA. Nghiên cứu đã tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn ưu tú DCI3.5 và KC4.5 có khả năng sinh tổng hợp GABA vượt trội cùng phổ đối kháng vi sinh vật gây hại rộng. Việc thử nghiệm thành công quá trình lên men cám gạo với hàm lượng GABA tích lũy đạt tới $3,965$ mg/100g đã mở ra tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao giá trị cho phụ phẩm ngành lúa gạo tại Việt Nam.