Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm gây bệnh của hệ vi khuẩn nội sinh từ các cây cỏ mực eclipta prostrata l và cây diệp hạ châu đắng phyllanthus amarus schum et thonn

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ vi khuẩn nội sinh của cây cỏ mực và diệp hạ châu đắng, góp phần vào nghiên cứu y học.

• Tác giả: Nguyễn Thị Mai Thi
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Nhật Linh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Vi Sinh - Sinh Học Phân Tử
• Đề tài: Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Khuẩn và Kháng Nấm của Vi Khuẩn Nội Sinh Từ Cây Cỏ Mực và Diệp Hạ Châu Đắng
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Tp. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN I: TỔNG QUAN
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH
• 1.1.1. Sơ lược về vi sinh vật nội sinh
• 1.1.2. Phân loại vi sinh vật nội sinh
• 1.1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU
• 1.2.1. Sơ lược về cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.)
• 1.2.2. Sơ lược về cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 1.2.3. Nguyên tắc cơ bản trong chọn lựa thực vật để phân lập vi sinh vật nội sinh
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH THỬ NGHIỆM
• 2. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Bố trí thí nghiệm
• 2.4.2. Quy trình thu nhận và xử lý mẫu
• 2.4.3. Phân lập vi khuẩn nội sinh
• 2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của hệ vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.) và Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.) và Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 2.4.6. Định danh các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao theo phương pháp truyền thống
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CÂY THUỐC
• 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH
• 3.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.)
• 3.2.2. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY DƯỢC LIỆU
• 3.3.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.)
• 3.3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 3.4. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH LỌC VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÁC CÂY DƯỢC LIỆU
• 3.4.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.)
• 3.4.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÁC CÂY DƯỢC LIỆU
• 3.5.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm của hệ vi khuẩn nội sinh từ các cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.) và Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 3.5.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng nấm của dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.) và Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum.)
• 3.6. ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CAO NHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY CỎ MỰC (ECLIPTA PROSTRATA L.) VÀ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG (PHYLLANTHUS AMARUS SCHUM.)
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Tóm tắt

I. Tổng quan về khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong sinh học phân tử và vi sinh vật học. Hai loại cây này không chỉ được biết đến với các ứng dụng y học truyền thống mà còn chứa đựng nhiều tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm kháng khuẩn và kháng nấm. Việc tìm hiểu về hoạt tính sinh học của các vi khuẩn nội sinh từ hai loại cây này có thể mở ra hướng đi mới trong việc điều trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra.

1.1. Khái niệm về vi khuẩn nội sinh và vai trò của chúng

Vi khuẩn nội sinh là những vi sinh vật sống trong mô thực vật mà không gây hại cho cây. Chúng có khả năng sản xuất các hợp chất sinh học có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, góp phần bảo vệ cây khỏi các tác nhân gây bệnh. Nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh giúp hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa thực vật và vi sinh vật, từ đó phát triển các ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh tại Việt Nam

Tại Việt Nam, nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh từ các cây thuốc như Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng còn hạn chế. Tuy nhiên, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm cao, mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm mới từ thiên nhiên.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của vi khuẩn nội sinh, nhưng vẫn còn nhiều thách thức trong việc xác định và phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao. Các yếu tố như điều kiện môi trường, phương pháp phân lập và xác định hoạt tính đều ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Do đó, việc phát triển các phương pháp nghiên cứu hiệu quả là rất cần thiết.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loại cây, điều kiện nuôi cấy và phương pháp phân lập. Việc tối ưu hóa các yếu tố này có thể giúp tăng cường khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn.

2.2. Thách thức trong việc phân lập vi khuẩn nội sinh

Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây thuốc gặp nhiều khó khăn do sự hiện diện của các vi sinh vật khác. Việc sử dụng các phương pháp phân lập hiện đại và kỹ thuật sinh học phân tử có thể giúp cải thiện khả năng phân lập và xác định các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn cao.

III. Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng, các phương pháp như phân lập vi khuẩn, xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ giúp xác định các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao mà còn cung cấp thông tin về cơ chế hoạt động của chúng.

3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh

Phân lập vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng được thực hiện bằng cách sử dụng các môi trường nuôi cấy đặc biệt. Các mẫu cây được xử lý và nuôi cấy trong điều kiện vô trùng để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn nội sinh mà không bị nhiễm bẩn.

3.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chủng vi khuẩn nội sinh được xác định thông qua các thử nghiệm như khuếch tán trên môi trường thạch và phương pháp đếm đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU). Các kết quả này giúp đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm gây bệnh.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm đáng kể. Các chủng vi khuẩn này không chỉ có tiềm năng trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh mới mà còn có thể ứng dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra.

4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Nghiên cứu đã xác định được nhiều chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao, đặc biệt là đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh phổ biến. Các kết quả này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên.

4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp và y học

Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn vào sản xuất nông nghiệp có thể giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật. Đồng thời, các sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh cũng có thể được phát triển để điều trị các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra ở người.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu về hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng đã chỉ ra tiềm năng to lớn của các chủng vi khuẩn này trong việc phát triển các sản phẩm kháng sinh tự nhiên. Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động và khả năng ứng dụng của chúng trong thực tiễn.

5.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu đã xác định được nhiều chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao. Những phát hiện này có thể đóng góp vào việc phát triển các sản phẩm mới từ thiên nhiên.

5.2. Triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc khai thác và phát triển các sản phẩm từ vi khuẩn nội sinh, đồng thời tìm hiểu sâu hơn về cơ chế hoạt động của chúng để ứng dụng hiệu quả trong y học và nông nghiệp.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong hệ sinh thái tự nhiên tại Việt Nam, nguồn tài nguyên cây thuốc và thảo dược có sự đa dạng sinh học cao. Theo thống kê của Viện Dược liệu – Bộ Y tế được tác giả dẫn giải, Việt Nam ghi nhận khoảng 3.948 loài cây dược liệu, trong đó gần 90% là cây mọc tự nhiên trong rừng và chỉ hơn 10% là cây được trồng trọt. Mặc dù tiềm năng dược liệu phong phú, việc khai thác và nghiên cứu ứng dụng chuyên sâu nhiều loài thảo mộc vẫn chưa được chú trọng đúng mức, điển hình là cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., thuộc họ Asteraceae) và cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn, thuộc họ Euphorbiaceae).

Y học cổ truyền và các nghiên cứu dược lý thực nghiệm đã chứng minh nhiều giá trị chữa bệnh của hai loài dược liệu này. Cây Cỏ mực (còn gọi là nhọ nồi, hạn liên thảo) thường được dân gian dùng để cầm máu, chữa ho ra máu, kiết lỵ, chống viêm nhiễm, trị nấm da và bỏng; các nghiên cứu quốc tế đã ghi nhận cao chiết cỏ mực có khả năng ức chế enzym HIV-1 IN, kháng virus Ranikhet và bảo vệ phục hồi chức năng gan bị tổn thương. Trong khi đó, cây Diệp hạ châu đắng (còn gọi là chó đẻ răng cưa, cam kiềm) được dùng phổ biến để sát khuẩn, lợi tiểu, điều trị sỏi mật, sỏi thận, hạ men gan và hỗ trợ điều trị viêm gan B mãn tính nhờ khả năng ức chế enzym polymerase và sự sao chép của virus HBV, đồng thời hợp chất Nuruside chiết xuất từ cây có hoạt tính kìm hãm sự nhân bản của virus HIV-1.

Tuy nhiên, phần lớn các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước đến nay chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm hoặc phân lập các hợp chất hóa thực vật từ cao chiết của mô thực vật. Thực tế, mô thực vật còn là môi trường cư trú của hệ vi sinh vật nội sinh (endophytic microorganisms) – các vi sinh vật sống cộng sinh bên trong các cơ quan của cây mà không gây triệu chứng bệnh. Vi khuẩn nội sinh có khả năng tự tổng hợp nhiều hoạt chất thứ cấp tương tự hoặc mang hoạt tính sinh học mới (kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống oxy hóa, kích thích tăng trưởng), mở ra hướng đi bền vững thay thế cho việc thu hái tàn phá dược liệu tự nhiên. Do đó, tác giả thực hiện đề tài nhằm khảo sát hệ vi khuẩn nội sinh trên hai loài cây thuốc này để tìm kiếm các chủng có hoạt tính sinh học đối kháng với các tác nhân vi sinh vật gây bệnh phổ biến.

Mục tiêu tổng quát của khóa luận là xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm gây bệnh của hệ vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng. Để đạt được mục tiêu này, bốn nội dung và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được xác lập:

1. Phân lập hệ vi khuẩn nội sinh từ các bộ phận (rễ, thân, lá) của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.) và Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn).
2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm gây bệnh của sinh khối các chủng vi khuẩn nội sinh thu nhận được.
3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm gây bệnh của dịch lọc nuôi cấy không tế bào từ các chủng vi khuẩn nội sinh tuyển chọn.
4. Định danh các chủng vi khuẩn nội sinh thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất bằng phương pháp vi sinh vật học và thử nghiệm sinh hóa truyền thống.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu được xác định rõ:

• Đối tượng thực vật: 33 mẫu cây Diệp hạ châu đắng khỏe mạnh thu thập từ bốn địa phương (Bình Dương, Tiền Giang, Long An và huyện Bình Chánh – TP. Hồ Chí Minh), đã được giám định tên khoa học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh theo tài liệu Cây cỏ Việt Nam (CCVN 2/191); 36 mẫu cây Cỏ mực thu thập tại Bình Dương, Long An, Tiền Giang, giám định theo CCVN 3/272.
• Đối tượng vi sinh vật chỉ thị: Các chủng vi khuẩn và vi nấm gây bệnh được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh (Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh) và Khoa Xét nghiệm (Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh), bao gồm các vi khuẩn Gram dương (Staphylococcus aureus, tụ cầu vàng kháng Methicillin - MRSA), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Klebsiella spp., Acinetobacter spp., cùng các chủng lâm sàng phân lập) và vi nấm ngoài da Dermatophytes (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes).
• Phạm vi không gian và thời gian: Đề tài được thực hiện từ ngày 19/10/2015 đến ngày 16/05/2016 tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (Cơ sở 3, số 68 Lê Thị Trung, TP. Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết về vi sinh vật nội sinh thực vật. Thuật ngữ "endophyte" được De Bary đề xuất từ năm 1866, sau đó được Bacon và White (2000) định nghĩa là các sinh vật sống bên trong mô thực vật ít nhất ở một giai đoạn của chu kỳ sống mà không gây hại hoặc biểu hiện bệnh lý cho cây chủ. Các nghiên cứu kinh điển của Baldani, Stoltzfus và Strobel chia vi sinh vật nội sinh thành hai nhóm: nội sinh bắt buộc (chỉ tồn tại trong mô cây) và nội sinh tùy ý (có thể tồn tại ngoài đất, bề mặt thực vật và môi trường nhân tạo). Về mặt sinh thái và dược học dân tộc, Strobel và cộng sự đã đề ra các nguyên tắc định hướng chọn mẫu thực vật để phân lập nội sinh có hoạt tính sinh học cao: cây sống trong điều kiện khắc nghiệt, cây có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền, và thực vật có tính đặc thù cao.

Khóa luận triển khai các phương pháp thực nghiệm vi sinh in vitro chuẩn hóa, bao gồm:

• Quy trình khử trùng bề mặt mô thực vật: Áp dụng quy trình của Roy và cộng sự (2010). Mẫu rễ, thân, lá sau khi rửa sạch được cắt đoạn 2–4 cm, ngâm lần lượt trong cồn ethanol 70% (2 phút), dung dịch sodium hypochlorite 4–6% (1,5 phút), cồn ethanol 70% (30 giây), và tráng lại 5 lần bằng nước cất vô trùng. Hiệu quả khử trùng bề mặt được kiểm soát nghiêm ngặt bằng cách hút 200 µL nước cất ở lần rửa cuối cùng cấy gạt lên đĩa thạch Tryptone Soya Agar (TSA), ủ ở 30°C trong 24 giờ; mẫu chỉ được dùng để phân lập khi đĩa kiểm tra hoàn toàn không mọc khuẩn lạc.
• Phương pháp phân lập và thuần khiết hóa: Mô thực vật đạt chuẩn được đặt lên môi trường TSA, ủ ở 30°C trong điều kiện có ánh sáng trong 48 giờ. Các khuẩn lạc mọc ra từ mép vết cắt mô được cấy ria nhiều lần trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (NA) cho đến khi đạt độ thuần nhất, sau đó quan sát hình thái đại thể (dạng khuẩn lạc, màu sắc, mép, độ trong, độ nhầy) và hình thái vi thể bằng phương pháp nhuộm Gram dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1.000 lần.
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối kháng trực tiếp: Sử dụng kỹ thuật cấy vạch vuông góc (perpendicular streak method) theo Purivirojkul và cộng sự (2012) trên đĩa thạch NA. Vi khuẩn kiểm nghiệm được cấy một vạch thẳng, sau đó cấy chủng vi khuẩn nội sinh thử nghiệm một vạch vuông góc giao thoa, ủ ở 37°C trong 24 giờ và đánh giá khả năng ức chế tại điểm giao nhau (lặp lại 3 lần).
• Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm và kháng khuẩn của dịch lọc: Chủng vi khuẩn nội sinh được nuôi tăng sinh trong môi trường lỏng Nutrient Broth (NB) ở 37°C trong 5 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm lạnh ở 8.000 vòng/phút trong 8 phút ở 4°C, sau đó lọc qua màng lọc vô trùng kích thước lỗ 0,2 µm để thu dịch lọc không tế bào (cell-free supernatant). Hoạt tính ức chế vi khuẩn và vi nấm Trichophyton rubrum (chỉnh mật độ quang OD 530 nm đạt 0,08–0,12, tương đương 1 × 10^6 CFU/mL) được khảo sát theo phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) của Roy (2011), Ingroff (1995) và Kumar (2009). Thạch được đục lỗ đường kính 6 mm, nhỏ 100 µL dịch nuôi cấy hoặc dịch lọc, để khuếch tán 15 phút trước khi ủ ở nhiệt độ thích hợp và đo đường kính vòng kháng.
• Phương pháp định danh sinh hóa: Các chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nhất được định danh theo khóa phân loại vi khuẩn chuẩn của Cowan và Steel (Feltham và Barrow, 1993; Trần Linh Thước, 2007) thông qua hệ thống các thử nghiệm sinh hóa: nhuộm Gram, thử nghiệm enzym catalase (H2O2 5%), oxidase (giấy tẩm N-dimethyl-paraphenylenediamine), khả năng sinh indol từ tryptophan (thuốc thử Kovacs), phân giải tinh bột bằng enzym amylase (thuốc thử Lugol), khử nitrate thành nitrite hoặc khử tiếp thành NH3/N2 (thuốc thử Gress A, Gress B và bụi kẽm), sử dụng nguồn cacbon citrate duy nhất trên môi trường Simmon's Citrate, thử nghiệm men urease trên môi trường Christensen's Urea, phản ứng Voges-Proskauer (VP) phát hiện acetoin, và khả năng lên men các nguồn đường với chỉ thị đỏ phenol.

Nội dung chính theo từng chương

Phần I: Tổng quan

Chương tổng quan tập trung hệ thống hóa cơ sở dữ liệu khoa học về vi sinh vật nội sinh, đặc điểm thực vật học của hai loài cây nghiên cứu và sinh học bệnh học của các vi sinh vật kiểm định:

• Tổng quan vi sinh vật nội sinh: Trình bày nguồn gốc tiến hóa, mối quan hệ tương hỗ giữa vi khuẩn nội sinh và cây chủ, các vị trí khu trú (khoang gian bào, mô dẫn) và khả năng tổng hợp các chất biến dưỡng thứ cấp mới có giá trị dược học (ví dụ: ecomycins từ Pseudomonas viridiflava, taxol từ nấm nội sinh Pestalotiopsis microspora). Đánh giá khái quát tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh kiểm soát sinh học tại Việt Nam trên các đối tượng như cây keo lai, keo tai tượng, cúc xuyến chi và cây cao su.
• Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.): Mô tả phân loại thực vật học (chi Eclipta, họ Asteraceae), đặc điểm hình thái thân thảo có lông nháp, phân bố sinh thái, cùng các nhóm hợp chất hóa học đặc trưng như thiophen, coumestan (wedelolacton, demethylwedelolacton), triterpen glycosid (ecliptasaponin A, B, C) và các bài thuốc dân gian trị xuất huyết, tổn thương gan.
• Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn): Trình bày phân loại (chi Phyllanthus, họ Euphorbiaceae), sinh thái phân bố tại các vùng nhiệt đới, thành phần các hợp chất đắng, lignan, hoạt chất Nuruside kháng virus và các bài thuốc kinh nghiệm chữa bệnh lý về gan, sỏi mật, nhiễm trùng tiết niệu.
• Đặc điểm các vi sinh vật gây bệnh kiểm nghiệm: Hệ thống hóa phân loại học, hình thái, độc lực và bệnh sinh học của 7 tác nhân gây bệnh nhiễm trùng phổ biến: Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng, nhiễm trùng mủ, độc tố), chủng tụ cầu kháng Methicillin (MRSA), trực khuẩn đường ruột Escherichia coli, trực khuẩn thương hàn Salmonella typhi, trực khuẩn mủ xanh đa kháng Pseudomonas aeruginosa, trực khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện Klebsiella spp., trực khuẩn Acinetobacter spp., và vi nấm gây bệnh nấm da sợi Dermatophytes (Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum).

Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết điều kiện thực nghiệm, xuất xứ mẫu, danh mục thiết bị, hóa chất và quy trình thao tác:

• Cung cấp nguồn gốc 33 mẫu Diệp hạ châu đắng và 36 mẫu Cỏ mực thu thập tại các tỉnh miền Nam (Bình Dương, Long An, Tiền Giang, TP. Hồ Chí Minh).
• Quy định các thông số kỹ thuật chuẩn: nồng độ chất sát khuẩn, nhiệt độ hấp vô trùng (121°C trong 20 phút), tỷ lệ môi trường đổ đĩa petri (20 mL/đĩa đường kính 90 mm), đường kính giếng thạch (6 mm), thể tích dịch thử nghiệm nạp giếng (100 µL).
• Chi tiết hóa quy trình thao tác cấy vạch vuông góc, quy trình ly tâm thu dịch lọc (8.000 vòng/phút, 8 phút, 4°C, lọc qua màng 0,2 µm) và bảng hướng dẫn nguyên tắc phản ứng, thuốc thử, cách đọc kết quả âm/dương tính cho từng phản ứng sinh hóa theo khóa Cowan và Steel.

Phần III: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả và thảo luận trình bày toàn bộ số liệu thu thập được từ thực nghiệm phân lập, sàng lọc hoạt tính và định danh:

• Giám định thực vật và phân lập vi khuẩn nội sinh: Kết quả giám định tiêu bản cây thuốc đạt độ tin cậy khoa học. Quy trình khử trùng bề mặt 7 bước cho thấy độ sạch tuyệt đối trên các đĩa TSA đối chứng. Từ các bộ phận rễ, thân, lá của Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng, nghiên cứu đã phân lập và làm thuần được nhiều chủng vi khuẩn nội sinh có hình thái đại thể (màu sắc từ trắng sữa, vàng ngà đến trong mờ, bờ đều hoặc răng cưa) và vi thể (trực khuẩn hoặc cầu khuẩn Gram dương, Gram âm) đa dạng. Ký hiệu các chủng tiêu biểu được tác giả ghi nhận gồm: LC5, LC6 (phân lập từ lá Cỏ mực), RC10 (từ rễ Cỏ mực), TC6, TC7 (từ thân Cỏ mực); TD9 (từ thân Diệp hạ châu đắng), RD4, RD14 (từ rễ Diệp hạ châu đắng).
• Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối kháng: Thử nghiệm cấy vạch vuông góc cho thấy một số chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng ức chế trực tiếp sự phát triển của các chủng vi khuẩn kiểm nghiệm (S. aureus, E. coli, MRSA, Acinetobacter spp., Klebsiella spp.).
• Khảo sát hoạt tính của dịch lọc nuôi cấy: Khảo sát trên dịch lọc không tế bào (nuôi cấy 5 ngày) xác nhận các chất kháng khuẩn được vi khuẩn nội sinh tiết ra ngoài môi trường ngoại bào. Dịch lọc của một số chủng tạo vòng vô khuẩn rõ nét xung quanh giếng thạch khi thử nghiệm trên các chủng chỉ thị.
• Khảo sát hoạt tính kháng nấm Trichophyton rubrum: Nghiên cứu tiến hành thử nghiệm so sánh 13 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Cỏ mực và 8 chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Diệp hạ châu đắng đối với nấm da T. rubrum. Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cả hai loài dược liệu đều có đại diện ức chế mạnh sự phát triển của sợi nấm và bào tử nấm T. rubrum, trong đó nổi bật là các chủng RC10, TC6, TC7, LC6 (từ Cỏ mực) và RD14 (từ Diệp hạ châu đắng) với vòng ức chế nấm phát triển rõ rệt quanh giếng thạch.
• Định danh sinh hóa các chủng có hoạt tính cao: Tác giả tiến hành thử nghiệm đầy đủ các phản ứng sinh hóa theo Cowan và Steel cho các chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh nhất từ cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng. Dữ liệu sinh hóa ghi nhận chi tiết tính chất bắt màu Gram, hoạt tính catalase, oxidase, khả năng sinh indol, thử nghiệm nitrate reductase, sử dụng citrate, phân giải ure và khả năng lên men các nguồn carbohydrate nhằm định vị vị trí phân loại học sơ bộ của các chủng tiềm năng.

Phần IV: Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận tổng kết về sự hiện diện phong phú của vi khuẩn nội sinh trong cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng, khẳng định tiềm năng ức chế vi khuẩn và vi nấm gây bệnh của các chủng tuyển chọn, đồng thời đề xuất các định hướng nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo.

Bảng tổng hợp các bước thực nghiệm chính và phương pháp đánh giá trong khóa luận:

Giai đoạn thực nghiệm	Phương pháp / Môi trường thực hiện	Chỉ tiêu đánh giá / Tiêu chuẩn kỹ thuật
Xử lý vô trùng mẫu	Cồn 70% (2 phút, 30 giây), Sodium hypochlorite 4–6% (1,5 phút)	Đĩa TSA đối chứng cấy 200 µL nước rửa cuối không mọc khuẩn lạc sau 24 giờ ở 30°C
Phân lập & làm thuần	Đặt mô trên TSA (48 giờ, 30°C); cấy ria thuần trên thạch NA	Đặc điểm đại thể (màu sắc, hình dạng mép) và vi thể (hình thái que/cầu, nhuộm Gram)
Kháng khuẩn trực tiếp	Cấy vạch vuông góc trên môi trường NA (37°C, 24 giờ)	Vùng ức chế sinh trưởng tại vị trí giao thoa giữa hai vạch cấy
Kháng khuẩn, kháng nấm từ dịch lọc	Giếng khuếch tán thạch (lỗ 6 mm, nạp 100 µL dịch lọc qua màng 0,2 µm sau ly tâm 8.000 rpm)	Xuất hiện và đo đường kính vòng vô khuẩn, vòng ức chế nấm T. rubrum xung quanh giếng thạch
Định danh sinh hóa	Khóa Cowan & Steel: Gram, catalase, oxidase, indol, citrate, urease, amylase, nitrate, VP, lên men đường	Sự đổi màu chỉ thị, sủi bọt khí, phản ứng hóa màu đặc trưng của từng enzym chuyển hóa

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã đạt được các kết quả cụ thể theo đúng mục tiêu đặt ra:

• Khẳng định tính hiệu quả và ổn định của quy trình khử trùng bề mặt 7 bước đối với các mô thực vật lấy từ tự nhiên, loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật biểu sinh bám trên bề mặt rễ, thân, lá của 33 mẫu Diệp hạ châu đắng và 36 mẫu Cỏ mực mà không làm tổn thương hệ vi khuẩn nội sinh bên trong mô.
• Phân lập thành công tập đoàn vi khuẩn nội sinh từ cả ba bộ phận rễ, thân và lá của hai loài cây dược liệu. Tác giả đã định danh mã chủng và quan sát chi tiết đặc tính hình thái của các chủng có tiềm năng, tiêu biểu như chủng RC10 (phân lập từ rễ Cỏ mực), LC5, LC6 (từ lá Cỏ mực), TC6, TC7 (từ thân Cỏ mực), TD9 (từ thân Diệp hạ châu đắng), RD4, RD14 (từ rễ Diệp hạ châu đắng).
• Khảo sát và so sánh định lượng khả năng kháng nấm da Trichophyton rubrum trên 13 chủng nội sinh từ Cỏ mực và 8 chủng từ Diệp hạ châu đắng. Thử nghiệm ghi nhận các chủng RC10, TC6, TC7, LC6 và RD14 thể hiện hoạt tính kháng nấm T. rubrum vượt trội thông qua cả hai hình thức: sinh khối sống và dịch lọc không tế bào.
• Chứng minh cơ chế kháng khuẩn, kháng nấm ngoại bào: Dịch lọc sau khi nuôi cấy 5 ngày trong môi trường NB và loại bỏ tế bào vi khuẩn qua màng lọc 0,2 µm vẫn tạo được vòng kháng khuẩn và kháng nấm rõ rệt trên thạch. Điều này chứng minh các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp và tiết các hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế vi sinh vật gây bệnh ra môi trường nuôi cấy.
• Hoàn thành bộ hồ sơ định danh sinh hóa sơ bộ theo khóa phân loại Cowan và Steel cho các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính cao nhất từ hai loài cây, tạo cơ sở phân loại học thực nghiệm cho các bước nghiên cứu định danh phân tử tiếp theo.

Về đóng góp so với các nghiên cứu trước, khóa luận đã chuyển hướng tiếp cận từ việc khai thác cao chiết toàn phần của cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng (vốn phụ thuộc vào nguồn sinh khối thực vật tự nhiên và biến động theo mùa) sang việc khảo sát hệ vi khuẩn nội sinh cộng sinh trong mô cây. Đây là hướng nghiên cứu vi sinh dược học mới, bổ sung dữ liệu thực nghiệm về nguồn vi sinh vật nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm da tại khu vực phía Nam Việt Nam.

Tác giả kiến nghị tiếp tục mở rộng nghiên cứu bằng việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại (giải trình tự gen 16S rRNA) để định danh chính xác tên loài cho các chủng có hoạt tính mạnh nhất; đồng thời tiến hành tách chiết, tinh sạch và phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất kháng sinh ngoại bào có trong dịch lọc nuôi cấy.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tồn tại một số giới hạn thực nghiệm do khuôn khổ của một đề tài cử nhân:

• Phương pháp định danh vi sinh vật mới chỉ dừng lại ở các thử nghiệm hình thái vi thể và sinh hóa truyền thống theo khóa phân loại Cowan và Steel. Phương pháp này chỉ cho phép định hướng sơ bộ nhóm hoặc chi vi khuẩn chứ chưa thể xác định chính xác tên loài hay dưới loài như các phương pháp sinh học phân tử hiện đại.
• Nghiên cứu mới dừng ở bước đánh giá định tính và bán định lượng hoạt tính in vitro trên đĩa thạch thông qua đường kính vòng kháng. Khóa luận chưa xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của dịch lọc, chưa tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp hoạt chất, và chưa tiến hành chiết xuất, tinh sạch để xác định bản chất hóa học cụ thể của các hợp chất kháng sinh ngoại bào.
• Hệ vi sinh vật gây bệnh thử nghiệm tuy có bao gồm một số chủng phân lập lâm sàng nhưng chưa mở rộng khảo sát trên nhiều loài vi nấm da khác (Microsporum, Epidermophyton) hoặc các chủng vi khuẩn đề kháng đa kháng sinh ở quy mô lâm sàng rộng hơn.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được xác định gồm:

• Tiến hành tách chiết DNA hệ gen, khuếch đại và giải trình tự vùng gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính cao (RC10, RD14, TC6, TC7, LC6) để định danh chính xác loài trên ngân hàng gen quốc tế.
• Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu (thành phần môi trường dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, thời gian lên men) nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm.
• Sử dụng các dung môi hữu cơ phân cực khác nhau để chiết xuất hoạt chất từ dịch nuôi cấy, kết hợp các kỹ thuật sắc ký (sắc ký lớp mỏng, HPLC) và phổ học (MS, NMR) để tinh sạch và xác định cấu trúc phân tử của hoạt chất kháng sinh.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp này mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:

• Sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học, Dược học và Sinh học Phân tử có thể sử dụng tài liệu này như một quy trình chuẩn về kỹ thuật phân lập vi khuẩn nội sinh từ các loại cây thảo mộc thân mềm.
• Phần quy trình xử lý vô trùng bề mặt mô thực vật 7 bước kết hợp kiểm tra độ vô trùng bằng dịch rửa cuối là tài liệu tham khảo chi tiết, có tính ứng dụng cao cho các phòng thí nghiệm nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh và nuôi cấy mô tế bào thực vật.
• Các nhà nghiên cứu về dược lý và sàng lọc kháng sinh sinh học có thể tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm đối kháng vi sinh vật song song (phương pháp cấy vạch vuông góc đối với sinh khối vi khuẩn sống và phương pháp khuếch tán giếng thạch đối với dịch lọc không tế bào), cùng hệ thống bảng kiểm các phản ứng sinh hóa theo Cowan và Steel.

Câu hỏi thường gặp

Quy trình khử trùng bề mặt mô cây Cỏ mực và Diệp hạ châu đắng được thực hiện như thế nào để đảm bảo không bị tạp nhiễm vi sinh vật biểu sinh?

Quy trình khử trùng bề mặt gồm 7 bước liên hoàn: mẫu rễ, thân, lá được rửa sạch dưới vòi nước mạnh và nước cất vô trùng, cắt đoạn 2–4 cm; ngâm cồn ethanol 70% trong 2 phút; ngâm dung dịch sodium hypochlorite 4–6% trong 1,5 phút; ngâm lại trong cồn ethanol 70% trong 30 giây; tráng 5 lần bằng nước cất vô trùng và thấm khô trên giấy hút ẩm vô trùng. Độ sạch bề mặt được kiểm soát bắt buộc bằng cách lấy 200 µL nước cất ở lần tráng thứ 5 cấy lên đĩa thạch TSA ủ ở 30°C trong 24 giờ; mẫu chỉ được đưa vào phân lập khi đĩa kiểm tra hoàn toàn không xuất hiện khuẩn lạc.

Hoạt tính kháng nấm gây bệnh của hệ vi khuẩn nội sinh được khảo sát trên tác nhân nào và bao nhiêu chủng được so sánh?

Khảo sát hoạt tính kháng nấm tập trung vào tác nhân vi nấm da Trichophyton rubrum (chỉnh mật độ quang OD 530 nm đạt 0,08–0,12, tương đương 1 × 10^6 CFU/mL). Tác giả đã tiến hành thử nghiệm so sánh khả năng kháng nấm của 13 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Cỏ mực và 8 chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diệp hạ châu đắng bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (đường kính lỗ 6 mm, nạp 100 µL dịch thử nghiệm).

Các chủng vi khuẩn nội sinh nào thể hiện hoạt tính kháng nấm Trichophyton rubrum tiêu biểu nhất trong khóa luận?

Trong số các chủng khảo sát, các chủng thể hiện khả năng ức chế nấm Trichophyton rubrum mạnh và ổn định nhất được ghi nhận gồm có: chủng RC10 (phân lập từ rễ Cỏ mực), các chủng TC6, TC7 (phân lập từ thân Cỏ mực), chủng LC6 (phân lập từ lá Cỏ mực) và chủng RD14 (phân lập từ rễ Diệp hạ châu đắng).

Dịch lọc nuôi cấy vi khuẩn nội sinh được thu nhận bằng phương pháp nào trước khi thử nghiệm hoạt tính sinh học?

Chủng vi khuẩn nội sinh thuần được nuôi tăng sinh trong 30 mL môi trường lỏng NB ở 37°C trong 5 ngày. Sau đó, dịch nuôi cấy được đem ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong thời gian 8 phút ở điều kiện nhiệt độ 4°C để lắng bỏ sinh khối tế bào vi khuẩn. Phần dịch nổi tiếp tục được lọc qua màng lọc vi sinh vô trùng có kích thước lỗ 0,2 µm để thu dịch lọc không tế bào (cell-free supernatant) phục vụ cho thử nghiệm khuếch tán giếng thạch.

Việc định danh các chủng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính cao được thực hiện dựa trên hệ thống phân loại nào?

Nghiên cứu sử dụng phương pháp định danh vi sinh vật truyền thống dựa trên các thử nghiệm sinh hóa theo khóa phân loại của Cowan và Steel (Feltham và Barrow, 1993). Các chỉ tiêu bao gồm: nhuộm Gram, phản ứng catalase, oxidase, thử nghiệm sinh indol, phân giải tinh bột (amylase), khử nitrate, sử dụng nguồn citrate (Simmon's citrate), thử nghiệm men urease, phản ứng Voges-Proskauer (VP) và thử nghiệm lên men các loại đường với chỉ thị màu đỏ phenol.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Mai Thi đã thực hiện thành công việc phân lập và làm thuần hệ vi khuẩn nội sinh từ các bộ phận rễ, thân, lá của cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L.) và Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn). Nghiên cứu đã chứng minh thực nghiệm rằng nhiều chủng vi khuẩn nội sinh (tiêu biểu như RC10, RD14, TC6, TC7, LC6) sở hữu hoạt tính ức chế rõ rệt đối với các vi khuẩn gây bệnh phổ biến và vi nấm ngoài da Trichophyton rubrum, thể hiện qua cả dạng tế bào sống lẫn dịch lọc ngoại bào không tế bào. Toàn bộ quy trình phân lập, bố trí thử nghiệm đối kháng in vitro và hệ thống chỉ tiêu sinh hóa định danh theo Cowan và Steel được thực hiện chặt chẽ, tạo nền tảng khoa học xác đáng cho các nghiên cứu chuyên sâu về phân lập hợp chất kháng sinh tự nhiên từ nguồn vi sinh vật nội sinh dược liệu.