Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò thiết yếu trong việc duy trì chức năng miễn dịch và sức khỏe chuyển hóa của cơ thể con người. Trong các nhóm vi sinh vật đường tiêu hóa, vi khuẩn acid lactic (Lactic Acid Bacteria - LAB) là nhóm vi khuẩn mang lại nhiều giá trị sinh học như cân bằng hệ vi sinh, chống lại các tác nhân gây nhiễm trùng, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và cải thiện khả năng hấp thu khoáng chất. Sữa mẹ và phân su trẻ sơ sinh được xác định là nguồn cung cấp khởi đầu quan trọng cho các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic tự nhiên đối với cơ thể người.

Bên cạnh vai trò của vi sinh vật, Selen (Se) là một nguyên tố vi lượng cần thiết tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme quan trọng như glutathione peroxidase (GPX), thioredoxin reductase và deiodinase. Thiếu hụt Selen dẫn đến suy giảm miễn dịch, tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch (bệnh Keshan), rối loạn cơ xương khớp (bệnh Kashin-Beck) và suy giảm chức năng tuyến giáp. Tuy nhiên, Selen tồn tại ở hai dạng chính: vô cơ và hữu cơ. Dạng Selen hữu cơ (axit amin seleno, hạt nano Selen - SeNPs) có hoạt tính sinh học cao hơn, độ hấp thu tốt hơn và độc tính thấp hơn đáng kể so với dạng vô cơ. Các phương pháp tổng hợp Selen hữu cơ bằng con đường hóa học hoặc vật lý truyền thống thường có chi phí cao, quy trình phức tạp và tiềm ẩn nguy cơ ô nhiễm hóa chất. Ngược lại, phương pháp biến đổi sinh học thông qua vi khuẩn acid lactic để tích tụ và chuyển hóa Selen vô cơ thành Selen hữu cơ là một giải pháp an toàn và hiệu quả. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tuyển chọn LAB có khả năng tích lũy và chuyển hóa Selen vẫn còn hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc và tuyển chọn một chủng vi khuẩn lactic từ phân su và sữa mẹ có khả năng hấp thu Selen cao và mang hoạt tính sinh học, làm nguồn nguyên liệu sinh học cho sản xuất ứng dụng và làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.

Nhiệm vụ nghiên cứu (gồm 3 nội dung):

  1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các mẫu phân su và sữa mẹ.
  2. Đánh giá khả năng hấp thu Selen và định danh chủng vi khuẩn có khả năng hấp thu mạnh nhất bằng sinh học phân tử.
  3. Đánh giá hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, chống oxy hóa) của chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ 20 mẫu sữa mẹ và 28 mẫu phân su thu thập tại các bệnh viện thuộc khu vực Thành phố Hồ Chí Minh; các chủng vi khuẩn kiểm định gồm Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 2921, Salmonella typhi ATCC 6539.
  • Địa điểm thực hiện: Phòng Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
  • Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/03/2023 đến ngày 30/06/2023.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ chế chuyển hóa Selen của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn acid lactic là nhóm vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi hoặc vi hiếu khí, không chứa catalase và sinh acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men carbohydrate. Quá trình tích lũy và chuyển hóa sinh học Selen ở LAB được mô tả qua ba giai đoạn chính:

  1. Vận chuyển qua màng: Các oxyanion Selen (selenite $\text{SeO}_3^{2-}$, selenate $\text{SeO}_4^{2-}$) xâm nhập vào tế bào thông qua protein vận chuyển sulfate permease hoặc hệ thống vận chuyển chất tan thứ cấp MFS (Major Facilitator Superfamily) và phức hợp gắn ATP (ABC transporter).
  2. Khử nội bào: Oxyanion Selen phản ứng với glutathione khử (GSH) tạo thành chất trung gian selenodiglutathione (GS-Se-SG). Dưới tác dụng xúc tác của enzyme glutathione reductase (GR) và các enzyme khử nội bào, GS-Se-SG bị khử tiếp thành selenopersulfide (GS-Se$^-$) rồi giải phóng Selen nguyên tố ($\text{Se}^0$). Ngoài ra, enzyme selenocysteine lyase (SCL) xúc tác phân giải SeCys để huy động Selen cho quá trình tổng hợp selenoprotein.
  3. Lắp ráp và hình thành hạt nano Selen (SeNPs): Selen nguyên tố $\text{Se}^0$ nội bào được lắp ráp nhờ các protein đặc hiệu (như protein SefA) hoặc theo cơ chế trưởng thành Ostwald để tạo thành các hạt nano Selen kích thước 50–280 nm và bài tiết ra khỏi tế bào.
Môi trường lỏng (SeO3 2-) 
   ↓ (Chất vận chuyển MFS / ABC / Sulfate permease)
Nội bào LAB: SeO3 2- + GSH → GS-Se-SG → GS-Se- → Se0
   ↓ (Lắp ráp nội bào / Protein SefA)
Hạt nano Selen (SeNPs) & Seleno-amino acid (SeMet, SeCys)

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phân lập và làm thuần LAB: Nuôi cấy mẫu tăng sinh trong môi trường MRS lỏng ở 37°C trong 24 giờ; cấy trải trên thạch MRS bổ sung 1% $\text{CaCO}_3$. Nhận diện khuẩn lạc LAB qua vòng phân giải $\text{CaCO}_3$ ($2\text{H}^+ + \text{CaCO}_3 \rightarrow \text{Ca}^{2+} + \text{CO}_2 + \text{H}_2\text{O}$).
  • Kiểm tra sinh lý - sinh hóa sơ bộ: Thử phản ứng catalase với dung dịch $\text{H}_2\text{O}_2$ 3% (tiêu chí: âm tính, không sinh bọt khí); nhuộm Gram quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 100X (tiêu chí: Gram dương).
  • Định lượng acid lactic: Xác định độ chua theo độ Thörner bằng phương pháp chuẩn độ dịch nuôi cấy 24 giờ với dung dịch $\text{NaOH}$ 0,1N (chỉ thị phenolphthalein 1%). Hàm lượng acid lactic ($m$, đơn vị mg/mL) được tính theo công thức: $m = 0{,}009 \times 1000 \times V_{\text{NaOH}}$.
  • Nuôi cấy tích lũy Selen: Nuôi cấy LAB trong môi trường MRS lỏng có bổ sung $\text{Na}_2\text{SeO}_3$ ở nồng độ khảo sát 150 mg/L (ủ ở 37°C, lắc 200 rpm trong 48 giờ). Thu sinh khối bằng ly tâm (10.000 rpm, 10 phút, 4°C), rửa 3 lần bằng $\text{NaCl}$ 0,9% và sấy đông khô.
  • Định lượng Selen bằng quang phổ hấp thu nguyên tử (F-AAS): Phá mẫu 0,01 g sinh khối khô bằng máy vi sóng Multiwave Pro (Anton Paar) với 8 mL $\text{HNO}_3$ 65% và 2 mL $\text{H}_2\text{O}_2$ 33%. Định mức mẫu và đo Selen tổng trên máy quang phổ F-AAS (AA-7000, Shimadzu). Đường chuẩn xây dựng với Selen chuẩn trong dải 0–50 $\mu\text{g/L}$.
  • Định danh sinh học phân tử bằng PCR 16S rDNA: Tách chiết DNA tổng số; khuếch đại gen 16S rDNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') và 1492R (5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). Chu trình nhiệt gồm biến tính 95°C (5 phút), 35 chu kỳ (95°C trong 1 phút, 56°C trong 45 giây, 72°C trong 1 phút), kéo dài 72°C (7 phút). Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% so với thang chuẩn 1 kb. Giải trình tự Sanger và đối soát độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI) bằng công cụ BLAST.
  • Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Phá vỡ tế bào sinh khối LAB-Se bằng sóng siêu âm (40 kHz, máy Qsonica, xử lý 10 phút, nghỉ lạnh 1 phút, lặp lại 3 lần) để thu huyền phù và dịch chiết nội bào. Đánh giá hoạt tính đối kháng với E. coli, S. aureus, S. typhi theo phương pháp khuếch tán giếng thạch (đường kính giếng 6 mm, nạp 70 $\mu\text{L}$ dịch chiết). Đối chứng dương: Gentamicin (10 $\mu\text{g/mL}$); đối chứng âm: nước cất.
  • Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa:
    • Bắt gốc tự do DPPH: Phản ứng giữa dịch chiết mẫu và DPPH 0,1 mM trong methanol, ủ tối 30 phút, đo mật độ quang $\text{OD}_{517\text{ nm}}$ trên máy đọc đĩa Elisa VersaMax. Xây dựng đường chuẩn với Vitamin C ($5\text{–}17{,}5\ \mu\text{g/mL}$).
    • Bắt gốc tự do ABTS: Phản ứng giữa dịch chiết và gốc tự do $\text{ABTS}^{\bullet+}$ (tạo từ ABTS 2 mM và $\text{K}_2\text{S}_2\text{O}8$ 7 mM), ủ tối 15 phút, đo mật độ quang $\text{OD}{734\text{ nm}}$. Xây dựng đường chuẩn với Vitamin C ($12{,}5\text{–}30\ \mu\text{g/mL}$).
  • Xử lý số liệu: Thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần. Tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn trên Microsoft Excel và phân tích phương sai ANOVA một yếu tố bằng phần mềm Minitab 16 ($P < 0{,}05$).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Chương này phân tích vai trò sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột và vi khuẩn lactic đối với sức khỏe trẻ sơ sinh thông qua nguồn sữa mẹ và phân su. Đồng thời, tác giả làm rõ tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng Selen, tính ưu việt của Selen hữu cơ so với Selen vô cơ, và sự cần thiết của việc khai thác LAB làm tác nhân chuyển hóa sinh học Selen tại Việt Nam. Trên cơ sở đó, xác định rõ mục tiêu tổng quát và 3 nội dung nghiên cứu cụ thể.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học về:

  • Đặc tính hóa lý của nguyên tố Selen, các dạng hợp chất vô cơ/hữu cơ, nhu cầu khuyến nghị RDA theo từng độ tuổi và vai trò sinh học (tăng cường miễn dịch tế bào T, tăng 118% độc tính tế bào khối u, chống viêm qua ức chế NF-$\kappa$B, chống oxy hóa qua enzyme GPX).
  • Phân loại, hình thái, đặc điểm sinh lý học và các ứng dụng probiotic của nhóm LAB (sinh bacteriocin, acid hữu cơ, điều hòa miễn dịch qua EPS).
  • Cơ chế vận chuyển oxyanion Selen qua màng tế bào LAB và con đường sinh hóa biến đổi thành Selen nguyên tố và hạt nano SeNPs.
  • Điểm luận các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về tổng hợp sinh học SeNPs từ LAB và các vi sinh vật khác giai đoạn 2016–2023.

Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm:

  • Nguồn mẫu và chủng chỉ thị, môi trường nuôi cấy (MRS, MRS + 1% $\text{CaCO}_3$).
  • Phương pháp phân lập, thử nghiệm catalase, nhuộm Gram, chuẩn độ acid lactic theo độ Thörner.
  • Quy trình nuôi cấy làm giàu Selen ở nồng độ 150 mg/L $\text{Na}_2\text{SeO}_3$, quy trình phá mẫu bằng vi sóng và kỹ thuật F-AAS.
  • Phương pháp tách chiết DNA, phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA với cặp mồi 27F/1492R, giải trình tự Sanger và tra cứu BLAST.
  • Kỹ thuật phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm 40 kHz, thử nghiệm khuếch tán giếng thạch xác định đường kính vòng kháng khuẩn, thử nghiệm bắt gốc tự do DPPH và ABTS so sánh với đường chuẩn Vitamin C.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương này phản ánh toàn bộ dữ liệu thực nghiệm thu được:

  1. Kết quả phân lập và sàng lọc sơ bộ: Từ 20 mẫu sữa mẹ và 28 mẫu phân su, phân lập được 45 chủng có khả năng phân giải $\text{CaCO}_3$ (19 chủng từ sữa mẹ, 26 chủng từ phân su). Thử nghiệm catalase âm tính và nhuộm Gram dương chọn lọc được 30 chủng LAB. Thử nghiệm khả năng chịu và hấp thu muối Selen trên đĩa thạch tuyển chọn được 18 chủng.
  2. Hàm lượng acid lactic và khả năng hấp thu Selen:
    • Hàm lượng acid lactic dao động từ $6{,}60 \pm 0{,}26$ mg/mL (chủng PS2) đến $21{,}75 \pm 0{,}69$ mg/mL (chủng SM6).
    • Hàm lượng tích lũy Selen trong sinh khối khô dao động từ $7{,}13 \pm 1{,}66$ mg/g (chủng SM1) đến $110{,}83 \pm 2{,}21$ mg/g (chủng SM3). Chủng SM3 từ sữa mẹ có khả năng hấp thu Selen cao nhất.
  3. Định danh chủng SM3: Sản phẩm PCR đoạn gen 16S rDNA cho một vạch sáng rõ kích thước khoảng 1500 bp trên gel agarose. Kết quả giải trình tự và tra cứu BLAST trên NCBI xác định chủng SM3 là Ligilactobacillus salivarius.
  4. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng SM3 làm giàu Selen: Dịch chiết nội bào SM3-Se tạo vòng ức chế đối kháng chọn lọc với vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus ATCC 2921 với đường kính vòng kháng là $4{,}00 \pm 0{,}50$ mm. Không ghi nhận vòng kháng đối với Escherichia coli ATCC 25922 và Salmonella typhi ATCC 6539.
  5. Hoạt tính chống oxy hóa:
    • Khả năng bắt gốc tự do DPPH của SM3-Se đạt $41{,}15 \pm 2{,}22%$ (cao hơn mẫu đối chứng SM3 không làm giàu Se là $38{,}24 \pm 2{,}28%$), tương đương hoạt tính của Vitamin C ở nồng độ 12,5 $\mu\text{g/mL}$.
    • Khả năng bắt gốc tự do ABTS của SM3-Se đạt $75{,}14 \pm 2{,}39%$ (vượt trội so với SM3 không làm giàu Se là $68{,}99 \pm 2{,}06%$), tương đương hoạt tính của Vitamin C ở nồng độ 25 $\mu\text{g/mL}$.

Chương 5. Kết luận và đề nghị

Đánh giá mức độ hoàn thành mục tiêu nghiên cứu, khẳng định việc phân lập và tuyển chọn thành công chủng Ligilactobacillus salivarius SM3 có năng lực hấp thu Selen và hoạt tính sinh học cao; đề xuất các hướng nghiên cứu mở rộng trong tương lai.

Kết quả và đóng góp

Số liệu thực nghiệm tổng hợp

Ký hiệu chủng Nguồn gốc Hình thái tế bào Hàm lượng Acid Lactic (mg/mL) Hàm lượng Selen hấp thu (mg Se/g sinh khối)
SM1 Sữa mẹ Cầu khuẩn $16{,}20 \pm 0{,}45$ $7{,}13 \pm 1{,}66$
SM2 Sữa mẹ Cầu khuẩn $16{,}80 \pm 0{,}26$ $43{,}25 \pm 1{,}16$
SM3 Sữa mẹ Trực khuẩn $16{,}50 \pm 0{,}69$ $110{,}83 \pm 2{,}21$
SM4 Sữa mẹ Trực khuẩn $11{,}40 \pm 0{,}52$ $64{,}64 \pm 3{,}49$
SM5 Sữa mẹ Trực khuẩn $13{,}80 \pm 0{,}26$ $83{,}60 \pm 2{,}88$
SM6 Sữa mẹ Cầu khuẩn $21{,}75 \pm 0{,}69$ $43{,}96 \pm 3{,}01$
SM7 Sữa mẹ Cầu khuẩn $14{,}40 \pm 0{,}45$ $13{,}11 \pm 1{,}55$
SM8 Sữa mẹ Trực khuẩn $9{,}15 \pm 0{,}26$ $49{,}24 \pm 1{,}23$
PS1 Phân su Trực khuẩn $17{,}25 \pm 0{,}69$ $13{,}52 \pm 2{,}33$
PS2 Phân su Trực khuẩn $6{,}60 \pm 0{,}26$ $45{,}02 \pm 3{,}66$
PS3 Phân su Cầu khuẩn $21{,}45 \pm 0{,}69$ $37{,}64 \pm 2{,}69$
PS4 Phân su Cầu khuẩn $9{,}75 \pm 0{,}69$ $74{,}90 \pm 4{,}18$
PS5 Phân su Trực khuẩn $17{,}70 \pm 0{,}52$ $56{,}08 \pm 4{,}63$
PS6 Phân su Trực khuẩn $15{,}15 \pm 0{,}69$ $34{,}12 \pm 3{,}83$
PS7 Phân su Trực khuẩn $15{,}60 \pm 0{,}52$ $50{,}72 \pm 2{,}70$
PS8 Phân su Trực khuẩn $14{,}55 \pm 0{,}52$ $59{,}01 \pm 3{,}45$
PS9 Phân su Cầu khuẩn $18{,}75 \pm 0{,}69$ $60{,}69 \pm 3{,}87$
PS10 Phân su Cầu khuẩn $18{,}75 \pm 0{,}69$ $66{,}69 \pm 3{,}87$

Ghi chú: Hàm lượng hấp thu trung bình ở nguồn mẫu sữa mẹ là 51,79 mg/g và phân su là 49,84 mg/g.

Chỉ tiêu hoạt tính sinh học của chủng SM3 (L. salivarius) Nghiệm thức SM3 không Se Nghiệm thức SM3 làm giàu Se (SM3-Se) Mẫu chuẩn / Đối chứng
Kháng S. aureus ATCC 2921 (mm) Không xác định $4{,}00 \pm 0{,}50$ Gentamicin ($10\ \mu\text{g/mL}$)
Kháng E. coli ATCC 25922 (mm) (-) (-) Gentamicin ($10\ \mu\text{g/mL}$)
Kháng S. typhi ATCC 6539 (mm) (-) (-) Gentamicin ($10\ \mu\text{g/mL}$)
Bắt gốc tự do DPPH (%) $38{,}24 \pm 2{,}28$ $41{,}15 \pm 2{,}22$ Tương đương Vitamin C ($12{,}5\ \mu\text{g/mL}$)
Bắt gốc tự do ABTS (%) $68{,}99 \pm 2{,}06$ $75{,}14 \pm 2{,}39$ Tương đương Vitamin C ($25\ \mu\text{g/mL}$)

Đóng góp của nghiên cứu

  • Về mặt khoa học: Sàng lọc thành công từ nguồn mẫu lâm sàng tự nhiên (sữa mẹ và phân su) một chủng vi khuẩn lactic thuộc loài Ligilactobacillus salivarius (ký hiệu SM3) có khả năng chống chịu và tích lũy hàm lượng Selen nội bào cao ($110{,}83 \pm 2{,}21$ mg Selen/g sinh khối khô).
  • Về hoạt tính sinh học: Chứng minh việc làm giàu Selen ở nồng độ 150 mg/L làm gia tăng hoạt tính chống oxy hóa của chủng SM3 (hoạt tính quét gốc tự do ABTS tăng từ 68,99% lên 75,14%, DPPH tăng từ 38,24% lên 41,15%) và tạo ra khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus.
  • Về mặt ứng dụng: Cung cấp chủng giống vi sinh vật tiềm năng có nguồn gốc từ người phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học giàu Selen hữu cơ/SeNPs dùng trong thực phẩm chức năng, dược phẩm và chăn nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc định lượng tổng hàm lượng Selen tích lũy trong sinh khối bằng F-AAS mà chưa phân tích tỷ lệ cụ thể giữa các dạng hóa học của Selen (SeMet, SeCys, $\text{Se}^0$, SeNPs).
  • Hoạt tính sinh học mới được khảo sát trên một số chủng vi khuẩn chỉ thị in vitro và hai mô hình thử nghiệm gốc tự do cơ bản (DPPH, ABTS); chưa thực hiện các thử nghiệm trên dòng tế bào hoặc mô hình động vật in vivo.
  • Chưa tiến hành tối ưu hóa các thông số lên men (pH, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, nồng độ cơ chất) ở quy mô bình lên men lớn hơn.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men để nâng cao hiệu suất tích lũy Selen của chủng Ligilactobacillus salivarius SM3.
  • Sử dụng các kỹ thuật phân tích hiện đại (như kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, quang phổ tán xạ ánh sáng động DLS, sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-ICP-MS) để xác định kích thước, hình thái hạt nano Selen và định lượng các axit amin seleno.
  • Đánh giá độc tính tế bào, độ ổn định và khả năng dung nạp của chế phẩm sinh khối SM3-Se trên mô hình in vivo.

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành: Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học ứng dụng, Công nghệ Thực phẩm, Hóa sinh học và Dược học.

Các nội dung có giá trị tham khảo chuyên môn cao bao gồm:

  • Quy trình phân lập và tuyển chọn LAB từ các nguồn mẫu sinh học người (sữa mẹ, phân su).
  • Quy trình chuẩn bị mẫu, phá mẫu vi sóng và kỹ thuật định lượng khoáng vi lượng Selen trong sinh khối vi sinh vật bằng máy F-AAS.
  • Phương pháp tách chiết, thiết kế mồi 27F/1492R và chu trình nhiệt PCR 16S rDNA để định danh loài vi khuẩn.
  • Phương pháp luận đánh giá hoạt tính chống oxy hóa (DPPH, ABTS) so sánh với đường chuẩn Vitamin C trên hệ thống đọc đĩa quang phổ ELISA.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao tác giả lựa chọn nồng độ Selen 150 mg/L để khảo sát khả năng hấp thu của vi khuẩn lactic? Tác giả căn cứ trên các công trình nghiên cứu trước đây (như nghiên cứu của Ana Paula Mörschbächer và cộng sự năm 2022 trên L. paracasei; nghiên cứu của Chen và cộng sự năm 2008). Các nghiên cứu này chỉ ra rằng ở nồng độ Selen dưới 150 mg/L, vi sinh vật tăng sinh khối và kích thích hoạt tính các enzyme chống oxy hóa; trong khi ở nồng độ từ 175–200 mg/L trở lên, Selen bắt đầu gây ức chế sinh trưởng, peroxy hóa lipid màng tế bào và làm giảm hàm lượng Selen tích lũy. Do đó, 150 mg/L là nồng độ tối ưu để đánh giá.

2. Nguồn phân lập từ sữa mẹ hay phân su cho khả năng hấp thu Selen tốt hơn? Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng Selen hấp thu trung bình giữa hai nguồn là tương đương nhau (mẫu sữa mẹ đạt trung bình 51,79 mg/g sinh khối khô; mẫu phân su đạt trung bình 49,84 mg/g sinh khối khô). Tuy nhiên, chủng có khả năng tích lũy Selen cao nhất toàn bộ nghiên cứu là chủng SM3 ($110{,}83 \pm 2{,}21$ mg/g) được phân lập từ nguồn sữa mẹ.

3. Chủng vi khuẩn SM3 được định danh là loài nào và có đặc điểm hình thái ra sao? Dựa trên kết quả nhuộm Gram và giải trình tự gen 16S rDNA đối soát trên cơ sở dữ liệu NCBI BLAST, chủng SM3 được định danh là Ligilactobacillus salivarius. Về mặt hình thái, đây là vi khuẩn Gram dương, tế bào có dạng hình que (trực khuẩn), khuẩn lạc có màu trắng đục, hình tròn, rìa nguyên và có khả năng tạo vòng phân giải $\text{CaCO}_3$.

4. Khả năng kháng khuẩn của chủng SM3 làm giàu Selen thể hiện như thế nào trên các chủng kiểm định? Dịch chiết nội bào của chủng SM3 làm giàu Selen chỉ thể hiện hoạt tính ức chế đối kháng đối với vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus ATCC 2921 với đường kính vòng kháng trung bình là $4{,}00 \pm 0{,}50$ mm; không xuất hiện vòng kháng đối với hai chủng vi khuẩn Gram âm là Escherichia coli ATCC 25922 và Salmonella typhi ATCC 6539.

5. Việc bổ sung Selen ảnh hưởng như thế nào đến khả năng chống oxy hóa của chủng SM3? Việc bổ sung Selen làm tăng khả năng chống oxy hóa của chủng SM3 trong cả hai thử nghiệm: khả năng bắt gốc tự do DPPH tăng từ $38{,}24 \pm 2{,}28%$ lên $41{,}15 \pm 2{,}22%$ (tương đương nồng độ Vitamin C 12,5 $\mu\text{g/mL}$); khả năng bắt gốc tự do ABTS tăng từ $68{,}99 \pm 2{,}06%$ lên $75{,}14 \pm 2{,}39%$ (tương đương nồng độ Vitamin C 25 $\mu\text{g/mL}$).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Huỳnh Thị Yến Nhi đã hoàn thành đầy đủ các mục tiêu đề ra khi sàng lọc thành công 18 chủng vi khuẩn lactic có khả năng hấp thu Selen từ 20 mẫu sữa mẹ và 28 mẫu phân su. Nghiên cứu đã xác định và định danh được chủng Ligilactobacillus salivarius SM3 có khả năng tích lũy Selen cao nhất ($110{,}83 \pm 2{,}21$ mg Selen/g sinh khối khô). Dịch chiết nội bào của chủng SM3 làm giàu Selen chứng minh được hoạt tính kháng khuẩn đối với Staphylococcus aureus ATCC 2921 và nâng cao khả năng bắt gốc tự do DPPH, ABTS so với chủng đối chứng không bổ sung Selen. Kết quả này tạo tiền đề thực nghiệm quan trọng cho việc ứng dụng vi khuẩn lactic làm giàu vi khoáng hữu cơ phục vụ công nghiệp sinh học và thực phẩm chức năng.