Đặt vấn đề Đối với nhu cầu thực phẩm hiện nay, con người thường thích ăn thực phẩm tươi, sạch, ngon theo đúng nghĩa của nó mà không bị mat giá trị dinh dưỡng ban dau, đặc biệt là không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng. Tuy nhiên hiện nay nhiệt độ trái đất ngày càng tăng do hiện tượng biến đổi khí hậu toàn cầu đã làm cho thực phẩm hư hỏng ngày càng nhanh hơn nên con người cũng đã phát triển các phương pháp bảo quản thực phẩm như: thanh trùng, dùng chất bảo quản hoá học, ứng dụng quá trình lạnh, sây khô, lên men. Trong đó ở nước ta, đa phần các nông sản, thực phẩm tươi sống thường dùng các chất hoá học dé bảo quản, điều nay đã dẫn đến việc lạm dụng hoá chat và gây ra ảnh hưởng đối với khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật, đồng thời phương pháp nay cũng chưa đáp ứng được yêu cau về an toàn thực pham. Vì thế việc nghiên cứu các chat bảo quản thực phẩm cần phải đi theo hướng mới, an toàn hon và hiệu qua hon.
Từ các yêu cầu trên, việc tìm ra các chất bảo quản mới ngày càng trở nên quan trọng hơn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm. Đó là sử dụng các chất kháng khuẩn được tổng hợp từ vi khuan lactic để làm chất bảo quản bằng sinh học, đây là các hợp chất có có nguồn gốc từ vi sinh vật, có khả năng kháng khuân mà không gây ảnh hưởng việc kháng thuốc ở vi sinh vật và đặc biệt an toàn vời sức khoẻ con người. Đây là một phương pháp còn khá mới mẻ ở nước ta, song với những ưu điểm trên thì đây là một lựa chọn hoàn toản hợp lí. Và đề tài: “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn trong dưa giá lên men” đã được thực hiện.
Mục tiêu đề tài Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích phân lập được các chủng vi khuẩn lactic từ nước dua giá lên men. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được sinh tông hop từ các dòng vi khuẩn đã phân lập. Định danh thành công vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất bằng sinh học phân tử. Nội dung thực hiện Phân lập vi khuẩn lactic các mẫu dưa giá lên men Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn từ các vi khuẩn lactic đã chọn Định danh bằng sinh học phân tử.
TONG QUAN TÀI LIEU 2. Sản phẩm dưa giá lên men 2. Giới thiệu dưa giá lên men Dưa giá lên men là một trong các món ăn kèm quen thuộc trong mỗi gia đình hằng ngày. Các nguyên liệu quen thuộc trong món dua giá lên men bao gồm giá đỗ, he, cả rốt,.
kết hợp với các gia vị như đường, nước tắc, muối. Dưa giá khi lên men sẽ sinh ra các vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hoá con người, gop phần bồ sung thêm các vi sinh vật cho đường ruột tăng cường hệ miễn dich cho cơ thể. Đồng thời kích thích tiêu hoá nhờ có men lactic, ăn ngon miệng hơn, giảm mỡ trong máu va cải thiện lưu thông máu. Ngoài ra các vi sinh vật có lợi trong dưa giá tạ ra các enzyme thuỷ phân protein trong thức ăn, giúp cơ thể nhanh chóng hấp thụ dinh dưỡng (Theo Giáo trình mô dun Sản xuất rau quả muối chua, dầm giấm của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn).
Tiêu chuẩn của dưa giá lên men Tiêu chuẩn cảm quan: Tiêu chuẩn cảm quan của dưa giá lên men được đánh giá thông qua các yêu cau sau: Yêu cầu chung: đúng trọng lượng tịnh, đúng loại; không lẫn cát sạn hay các tạp chất khác. Màu sắc: các nguyên liệu như giá đỗ, hẹ và cà rốt phải có màu sắc đặc trưng, không bị biến đen. Trạng thái: giá đỗ và cà rốt giòn chắc, không bị héo mềm nhũn. Mùi: mùi thơm tự nhiên của dưa giá lên men, không có mùi của hiện tượng phân huỷ hay mùi lạ của các nguyên liệu.
Vi: vị chua ngọt hài hòa, không có vi lạ. Tiêu chuẩn vi sinh: Chỉ tiêu vi sinh của dưa giá lên men được quy định trong bảng 2. Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong rau quả muối, rau quả khô Tên tiêu chuẩn Giới hạn tối STT đa 1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số vi khuân/g sản pham 104 2 E.coli, số vi khuan/g sản phẩm 0 3 Coliforms, số vi khuan/g sản pham 10 4 Bacillus cereus, số vi khuan/g sản phẩm 10 5 Clostridium perfringens, số vi khuan/g sản phâm 10 6 Téng số bào tử nam men, nam mốc 10 2.Téng quan vi khuẩn lactic 2.1 Lịch sử về vi khuẩn lactic Acid lactic hay acid sữa lần đầu tiên được tìm thấy và mô tả trong sữa chua bởi nhà hóa học người Thụy Điển Karl Wilhelm Scheele vào năm 1780, ông đã tách acid này khỏi sữa lên men và tinh chế nó. Năm 1847, Bloudean đã xác nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men.
Năm 1856, Louis Pasteur đã chứng minh rằng quá trình lên men acid lactic trong sữa tươi được xúc tác bởi vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic (LAB). Cho đến năm 1878, Joseph Lister đã phân lập được một loại vi khuẩn lactic thuần chủng đầu tiên đặt tên là Bacterium lactis. Vi khuẩn lactic này hiện là Streptococcus lactis và được sử dụng dé lên men sữa dé sản xuất hang trăm sản pham sữa khác nhau. Công nghệ sản xuất lactic bắt đầu ra đời, theo thời gian, nhiều công trình nghiên cứu lên men đã được thực hiện và cho đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập liên tục.
Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic Vi khuan lactic là những vi khuẩn tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic trong quá trình lên men carbohydrate. Hầu hết vi khuẩn lactic đều được xếp chung vào họ Lactobateriaceae. Về hình thái ching không đồng nhất (gồm các vi khuẩn có dang que lẫn vi khuẩn có dạng cầu) nhưng về đặc điểm sinh lí lại giống nhau. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bao tử, hầu hết các loài đều không di động, hô hấp kị khí tuỳ tiện (Abbe và ctv, 1999).
Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải các hợp chất carbonhydrate và sinh ra acid. LAB là nhóm lên men bắt buộc không chứa các cytochrome và enzyme catalase. Chúng có thé sinh trưởng và phát triển khi có hoặc không có mặt của oxy trong môi trường. Vì thế vi khuẩn lactic là vi khuẩn ki khí, vi hiéu khí.
LAB có nhu cầu về đinh dưỡng phức tạp, không một đại điện nào của nhóm này có thé phát triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và ion NH¡”. Da số chúng rất cần các vitamin và acid amin cho sự phát triển nên người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một lượng cao nam men, điển hình là MRS, dịch cà chua hoặc thậm chí cả máu. Theo Quyết định số 08/2006/QD-BYT về Quy chuẩn kỹ thuật xác định tổng số vi khuẩn lactic trong thực phẩm, khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn lactic sẽ có dạng tròn nhỏ, trong bong, có màu môi trường, màu trắng đục hoặc màu vàng kem hay khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục và đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Phân loại vi khuẩn lactic Hiện nay, các nhà khoa hoc đã tìm được khoảng 20 chi vi khuẩn lactic Aerococus, Carnobacterium, Enterococus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella được coi là vi khuan lactic chinh (Limsowtin va ctv, 2002).
Vé hinh dang thi nhom vi khuẩn này được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus. Ngày nay người ta b6 sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuan Bifidobacterium. Dựa vào đặc điểm kiểu hình: vi khuẩn lactic được chia làm 2 loại: cầu khuẩn và trực khuẩn Trực khuẩn (Lactobacillus): là trực khuẩn phô biến nhất bao gồm 52 loài. Tế bào của chúng có thé thay đổi từ hình bau dục đến hình que dài, có thể đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.
Lactobacillus plantarum là hình que có đầu tròn, thang, thường rộng 0,9-1,2 um và dài 3-8 pum, xuất hiện đơn lẻ, thành cặp hoặc thành chuỗi ngắn trong khi Lactobacillus bulgaricus có dang que dài, mảnh, kích thước khoảng 0,7 — 0,9 um (Landete và ctv, 2010). Cầu khuẩn (Streptococcus va Leuconostoc): Streptococcus cô tế bào hình tròn hoặc oval, thường xếp thành đôi hoặc thành chuỗi. Chúng thường xếp thành chuỗi dài hoặc xếp đôi, ít khi đứng riêng lẻ, đường kính từ 0,5 — 1 um, nhiệt độ phát triển tối ưu từ 30 — 35°C. Leuconostoc mesenteroides cô đường kính khoảng 0,5-0,7 um có dạng hình que ngắn hoặc hình ovan tuỳ vào môi trường nuôi cấy, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30°C, 4 nhưng có thê tồn tại ở nhiệt độ từ 10°C đến 30°C.
Ngoài ra giống Lactococcus có hình dáng tế bao giống với Leuconostoc nhưng lại thường xếp thành tu, tạo thành đám lớn. Hình ảnh tế bào vi khuẩn lactic. a) Cầu khuẩn lactic; b) Trực khuẩn lactic. Dựa vào cơ chế lên men: có thể chia thành 2 kiểu lên men là vi khuẩn lactic lên men đồng hình và vi khuẩn lactic lên men dị hình.
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình: là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứa enzyme aldolase và enzyme triosophotphatizomerase. Chúng biến đổi một phân tử glucose theo chu trình đường phân EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) thành hai phan tử pyruvic và thu được sản phẩm cuối cùng chi là acid lactic: Co6Hi206 —› 2 CH:COOH —› 2CH:CHOCOOH acid pyruvic acid lactic Theo Nguyễn Thị Thanh Tâm (2011), các vi khuẩn lactic lên men đồng hình có thé kể đến là Streptococus cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium casei, Lactobacterium delbruclkii, Lactobacterium cucumerisfermentati. Streptococus cremoris thường tạo thành chuỗi dai, nhiệt độ phat triển tối ưu từ 25 — 30°C, lên men đường glucose, galactose. Lactobacterium bulgaricus có dạng trực khuân rat dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là 20°C, lên men glucose, lactose và có khả năng tạo độ acid cao (3,7% acid lactic).
Lactobacterium casei là những trực khuân rất ngắn, gây chua sữa tự nhiên, thường phát triển ở nhiệt độ cao hơn Streptococus cremoris, tối ưu là 35°C và tối đa là 45°C, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 — 1% acid lactic. Ở điều bình thường, chúng gây chua sữa trong vòng 10 — 12 giờ. Lactobacterium delbruckii là trực khuân lớn, thường gặp trên hạt đại mach, có khả năng tạo sợi trong quá trình phát triển, nhiệt độ tối ưu từ 45 — 50°C, không có khả năng 5 lên men đường lactose như các loài khác nên chúng không được dùng trong chế biến sữa. Lactobacterium cucumeris fermentati là trực khuân, không chuyên động, thường tìm thấy trong sữa ủ chua, vi khuẩn có đạng tế bào đơn, thường tạo thành chuỗi trong quá trình lên men, khả năng tạo acid tối đa trong môi trường từ 0,9 — 1,2%.