Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis tại Thái Nguyên

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập tại, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Trần Chung Dũng
• Người hướng dẫn: TS. Trương Phúc Hưng
• Trường học: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập tại Thái Nguyên
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt)
• 1.1.1. Lược sử nghiên cứu và ứng dụng Bt
• 1.1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt trên thế giới
• 1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bt tại Việt Nam
• 1.1.2. Đại cương về vi khuẩn Bt
• 1.1.2.1. Sự phân bố của Bt
• 1.1.2.2. Đặc điểm hình thái
• 1.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa
• 1.1.2.4. Phân loại Bt
• 1.1.2.5. Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var.
• 1.1.2.6. Tính chất nuôi cấy
• 1.1.2.7. Độc tố của Bt
• 1.1.2.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng
• 1.1.3. Tổng quan về sâu tơ (côn trùng thử nghiệm)
• 1.1.4. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học
• 1.1.4.1. Phương pháp lên men bề mặt
• 1.1.4.2. Lên men chìm
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Hóa chất và thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis
• 2.3.2. Phân loại Bacillus thuringiensis bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch
• 2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
• 2.3.4. Phương pháp lên men vi sinh vật
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập, tuyển chọn và phân loại các chủng Bacillus thuringiensis
• 3.1.1. Phân lập các chủng B.
• 3.1.2. Sự đa dạng hình thái tinh thể các chủng B. thuringiensis phân lập
• 3.1.3. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh
• 3.1.4. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập
• 3.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt trong phòng thí nghiệm
• 3.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến sinh trưởng của chủng TC2
• 3.2.2. Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm
• 3.2.3. Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ của chế phẩm Bt – TC2
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis

Nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis tại Thái Nguyên đang thu hút sự quan tâm lớn trong lĩnh vực nông nghiệp bền vững. Bacillus thuringiensis là một loại vi khuẩn đất có khả năng sản sinh ra các protein độc tố có hiệu quả trong việc tiêu diệt nhiều loại sâu hại cây trồng. Việc phát triển chế phẩm sinh học này không chỉ giúp bảo vệ mùa màng mà còn giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

1.1. Đặc điểm của Bacillus thuringiensis và ứng dụng trong nông nghiệp

Bacillus thuringiensis (Bt) là một vi khuẩn gram dương, có khả năng sản sinh độc tố có tác dụng diệt sâu. Chế phẩm từ Bt được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để kiểm soát sâu hại mà không gây hại cho các loài côn trùng có ích.

1.2. Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học tại Thái Nguyên

Thái Nguyên là một trong những tỉnh có nhiều chủng Bt với hoạt tính diệt sâu cao. Nghiên cứu tại đây nhằm tìm kiếm và phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả, góp phần vào sự phát triển nông nghiệp bền vững.

II. Vấn đề và thách thức trong việc sử dụng chế phẩm sinh học diệt sâu tơ

Mặc dù chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc áp dụng rộng rãi. Các vấn đề như sự kháng thuốc của sâu hại, điều kiện môi trường ảnh hưởng đến hiệu quả của chế phẩm, và sự thiếu hụt thông tin về cách sử dụng hiệu quả vẫn cần được giải quyết.

2.1. Kháng thuốc của sâu hại đối với chế phẩm sinh học

Sự phát triển của tính kháng thuốc ở sâu hại là một trong những thách thức lớn nhất. Nghiên cứu cho thấy rằng một số loài sâu đã phát triển khả năng kháng lại độc tố từ Bt, làm giảm hiệu quả của chế phẩm.

2.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến hiệu quả chế phẩm

Các yếu tố như ánh sáng mặt trời, độ ẩm và nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của chế phẩm sinh học. Việc nghiên cứu và tối ưu hóa các điều kiện này là cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng.

III. Phương pháp nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis

Nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis bao gồm nhiều phương pháp khác nhau, từ việc phân lập chủng vi khuẩn đến tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm. Các phương pháp này giúp đảm bảo rằng chế phẩm đạt được hiệu quả cao nhất trong việc diệt sâu hại.

3.1. Phân lập và xác định chủng Bacillus thuringiensis

Quá trình phân lập chủng Bt từ mẫu đất tại Thái Nguyên là bước đầu tiên trong nghiên cứu. Các chủng được phân lập sẽ được thử nghiệm để xác định hoạt tính diệt sâu.

3.2. Tối ưu hóa quy trình sản xuất chế phẩm sinh học

Nghiên cứu sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và quy trình lên men để sản xuất chế phẩm sinh học có hiệu quả cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn và kết quả nghiên cứu chế phẩm sinh học

Kết quả nghiên cứu chế phẩm sinh học từ Bacillus thuringiensis đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc diệt sâu tơ. Các thử nghiệm thực địa cho thấy chế phẩm này có thể giảm thiểu đáng kể thiệt hại do sâu hại gây ra, đồng thời bảo vệ môi trường.

4.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ

Các thử nghiệm cho thấy chế phẩm từ Bt có khả năng diệt sâu tơ lên đến 90%, cho thấy tiềm năng lớn trong việc ứng dụng trong nông nghiệp.

4.2. Ứng dụng chế phẩm trong sản xuất nông nghiệp

Chế phẩm sinh học từ Bt đã được áp dụng thử nghiệm trên nhiều loại cây trồng tại Thái Nguyên, mang lại kết quả khả quan trong việc bảo vệ mùa màng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu chế phẩm sinh học

Nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ Bacillus thuringiensis tại Thái Nguyên mở ra nhiều triển vọng cho nông nghiệp bền vững. Việc phát triển và ứng dụng chế phẩm này không chỉ giúp bảo vệ mùa màng mà còn góp phần vào việc bảo vệ môi trường.

5.1. Tương lai của chế phẩm sinh học trong nông nghiệp

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, chế phẩm sinh học từ Bt có thể được cải tiến để nâng cao hiệu quả và mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.

5.2. Khuyến nghị cho nghiên cứu và ứng dụng

Cần tiếp tục nghiên cứu để phát triển các chủng Bt mới và cải thiện quy trình sản xuất chế phẩm, đồng thời tăng cường giáo dục và thông tin cho nông dân về lợi ích của chế phẩm sinh học.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu khá thuận lợi và tốt đẹp [ 3]. Trong những năm trở lại đây, việc ứng dụng Bt được mở rộng hơn. Hiện đã có rất nhiều cơ quan đi sâu vào nghiên cứu Bt như: Viện Công nghệ Sinh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ Sau Thu hoạch, Viện Công nghiệp Thực phẩm. Tuy vậy cho tới nay ở nước ta vẫn chưa có cơ sở sản xuất thuốc trừ sâu Bt trên quy mô công nghiệp.

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cộng sự đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cộng sự đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11]. Đại cương về vi khuẩn Bt 1.

Sự phân bố của Bt Bacillus thuringiensis tồn tại ở khắp mọi nơi trong đất và trên bề mặt lá, ở đất rừng, thảo nguyên, sa mạc hay ở môi trường có điều kiện thuận lợi cho sâu bọ phát triển như bụi hạt từ các nhà máy xay lúa mì, trong các kho bảo quản ngũ cốc…Sự phân bố của Bt là không liên quan đến sự phân bố của côn trùng đích. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại nhiều trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng. Bt được xem như là loài vi khuẩn bản địa tồn tại trong rất nhiều môi trường khác nhau. Meadows phân chia ra 3 ổ sinh LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 7 thái phổ biến của Bt trong môi trường tự nhiên là côn trùng, thực vật và đất [13].

Bt dễ dàng phát triển trong môi trường thí nghiệm chỉ với một lượng tối thiểu chất dinh dưỡng. Mặc dù bào tử Bt tồn tại trong nhiều năm, nhưng chúng không nảy mầm và nhân lên như các tế bào sinh dưỡng trong đất tự nhiên. Đặc điểm hình thái Bt là thành viên của nhóm 1, chi Bacillus, là khuẩn gram dương, tế bào dạng hình que, kích thước 3-6μm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Vi khuẩn hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng di động nhờ có tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào.

Là một loài thuộc chi Bacillus nên khi gặp điều kiện không thuận lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ cao, khô hạn.Bt có khả năng sinh nội bào tử để chống lại những điều kiện bất lợi. Quá trình sống của Bt chia thành 3 giai đoạn: * Thể dinh dưỡng: Hình que, 2 đầu tù, thường đứng riêng hoặc có thể tạo thành chuỗi. Sinh sản bằng cách phân chia theo chiều ngang. * Nang bào tử: Tế bào trưởng thành, dạng hình trứng dài, to hơn thể dinh dưỡng, một đầu hình thành bào tử hình tròn (bầu dục), đầu kia hình thành tinh thể.

* Bào tử và tinh thể: Nang bào tử phát triển, vỡ ra giải phóng bào tử và tinh thể. Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hóa chất, áp suất thẩm thấu cao. Màng ngoài là phần sót lại cuả tế bào mẹ, chiếm khoảng 2-10% khối lượng khô của bào tử. Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi 3-15 lớp, chủ yếu là protein sừng.

Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém với các cation. Dưới áo bào tử là lớp vỏ bào tử.Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglycan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7-10 % dipicolinat canxi không chứa axit teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20 atm, lượng chưa nước là 70 %. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, nang bào tử, bào tử chất và vùng nhân.

LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Chủng Bt mang bào tử Hình 1. Hình dạng tế vào và tinh và tinh thể [24]. thể một số dưới loài Bt) [24].

a Lông roi (A) Tế bào vi khẩn Bt b Tế bào chứa bào tử và tinh thể (B) Hình dạng protein tinh thể của c. Protein tinh thể độc B. kustaki (C) Hình dạng protein tinh thể của B.isragensis Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm chiếm khoảng 25% khối lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, ovan, lập phương hoặc hình dạng không xác định… Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát ra ngoài [3],[13].thuringiensis với các loài khác trong chi Bacillus Các loài thuộc chi B. Gần đây có phát hiện thêm 2 loài B.

Việc sinh ra protein tinh thể là một đặc tính để phân biệt Bacillus thuringiensis, tuy nhiên đó chỉ là một chỉ tiêu dùng trong mục đích phân loại bào tử tinh thể. Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus Đặc điểm Bc Bt Bmy Ba Bme LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 Nhuộm Gram + (a) + + + + Phản ứng catalase + + + + + Khả năng chuyển động +/- (b) +/- - (c) - +/- Phản ứng khử nitrate + +/- + + - (d) Phân hủy tyrosine + + +/- - (d) +/- Kháng lysozyme + + + + - Phản ứng với lòng đỏ + + + + - trứng Lên men glucose kị khí + + + + - Phản ứng V-P + + + + - Sinh Axít từ mannitol - - - - + Làm tan huyết + + + - (d) - Sinh protein tinh thể - + - - - Chú thích: + (a): 90-100% số chủng phản ứng dương tính +/- (b): 50-50% số chủng phản ứng dương tính - (c): 90-100% số chủng phản ứng âm tính - (d): hầu hết các chủng phản ứng âm tính 1. Đặc điểm sinh hóa Bt không lên men trên môi trường arrabinoza, xylose, manitol nhưng tạo axit trong môi trường có chứa glucose, có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, phát triển được ở môi trường có chứa 0,001 % lysozyme, 7 % NaCl với pH = 5.7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Không sử dụng axit citric, không khử muối sunphat.

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ dao động từ 15 – 45ºC. Nhiệt độ tối ưu là 20-30°C. Bt không mẫn cảm đặc biệt với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của là pH = 7. Bt có khả năng oxy hóa hydrocacbon đến axit hữu cơ và dioxit cacbon theo chu trình Embden – Meyerhoff – Panas [3].

LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phân loại Bt Bt được chia làm nhiều loại phụ dựa trên các đặc điểm sau:  Khả năng hình thành enzyme leucitinase  Cấu trúc tinh thể và khả năng gây bệnh cho côn trùng  Đặc tính huyết thanh học  Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các huyết thanh tương ứng Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh được De Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2], [3]. Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường.

Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3], [13]. Tuy nhiên việc phân loại chỉ dựa trên typ huyết thanh vẫn chưa phản ánh được mối liên hệ giữa chủng giống và hoạt lực diệt côn trùng. Việc phân lập và tuyển chọn các chủng Bt có giá trị vẫn gặp khó khăn.

Chính vì vậy, gần đây một số nhà khoa học đã đề nghị đưa ra phương pháp phân loại mới dựa trên kết quả xác định typ huyết thanh, hình dạng tinh thể, hoạt lực diệt côn trùng, gen Cry và thành phần protein tinh thể, hình dạng tinh thể và hoạt lực diệt côn trùng. LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 11 Tế bào vi khuẩn với Phân tử kháng thể kháng nguyên bề mặt với 2 vị trí liên kết đặc hiệu. Phản ứng ngưng kết. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H 1.

Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki Bacillus thuringiensis var. kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm 1901, Tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm 1951. Trong các thập kỷ gần đây, Bt var.

kurstaki đã trở thành phương tiện chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada. Đến năm 1986, việc sử dụng Bt var. kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối với sâu hại cây vân sam. Ở các nước khác, Bt var.

kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao. Bacillus thuringiensis var. kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao nhất.

Theo các tài liệu công bố, thì trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết với các typ huyết thanh đã có thì Bacillus thuringiensis var. kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%, sau là B.