Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus phân lập và nghiên cứu đặc tính nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân lignocellulose, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất giải

• Tác giả: Hàn Thị Thu Hương
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Nguyên Thành
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - ĐHQGHN
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Phân Lập Và Nghiên Cứu Đặc Tính Nấm Mốc Chịu Nhiệt Có Khả Năng Thủy Phân Lignocellulose
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose
• 1.2. Lignocellulose
• 1.3. Cellulose
• 1.4. Hemicellulose
• 1.5. Lignin
• 1.6. Enzyme thủy phân lignocellulose
• 1.6.1. Cellullase
• 1.6.2. Endo-1,4-β-Glucanase (Endoglucanase)
• 1.6.3. Cellobiohydrolase
• 1.6.4. β-glucosidase
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc
• 2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
• 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
• 2.4. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol
• 2.5. Môi trường PDA
• 2.6. Môi trường lên men lỏng
• 2.7. Môi trường YM
• 2.8. Phương pháp nghiên cứu
• 2.8.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt
• 2.8.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 2.8.3. Tách chiết enzyme
• 2.8.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS
• 2.8.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS
• 2.8.6. Điện di protein
• 2.8.7. Phương pháp điện di SDS-PAGE
• 2.8.8. Phương pháp điện di Zymogram
• 2.8.9. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc
• 2.8.10. Phương pháp tinh chế ADN
• 2.8.11. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing
• 2.8.12. Phương pháp điện di ADN
• 2.8.13. Nhuộm gel và đọc kết quả
• 2.8.14. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt
• 3.1.1. Kết quả phân lập
• 3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào
• 3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
• 3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA
• 3.1.5. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập
• 3.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose
• 3.3. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocellulose
• 3.4. Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhau
• 3.5. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nấm mốc chịu nhiệt và thủy phân lignocellulose

Nấm mốc chịu nhiệt là một nhóm vi sinh vật có khả năng phát triển và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ cao. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân lignocellulose, một thành phần chính trong cấu trúc thực vật. Lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin, là những hợp chất khó phân hủy. Việc nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt không chỉ giúp hiểu rõ hơn về khả năng sinh enzyme của chúng mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học và các ngành công nghiệp khác.

1.1. Đặc điểm của nấm mốc chịu nhiệt

Nấm mốc chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nhiệt độ cao, thường từ 50°C trở lên. Chúng có thể sản xuất enzyme thủy phân lignocellulose hiệu quả, giúp phân hủy các hợp chất phức tạp thành các monomer đơn giản hơn. Một số chủng nấm mốc nổi bật như Aspergillus và Thermomyces đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi.

1.2. Vai trò của enzyme trong thủy phân lignocellulose

Enzyme thủy phân lignocellulose, bao gồm cellulase và hemicellulase, đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy cellulose và hemicellulose thành đường đơn. Quá trình này không chỉ giúp tăng cường khả năng tiêu hóa của động vật mà còn tạo ra nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học. Việc tối ưu hóa hoạt động của enzyme này là một thách thức lớn trong nghiên cứu.

II. Thách thức trong nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt và lignocellulose

Mặc dù nấm mốc chịu nhiệt có tiềm năng lớn trong việc thủy phân lignocellulose, nhưng vẫn tồn tại nhiều thách thức trong nghiên cứu và ứng dụng. Một trong những vấn đề chính là khả năng sản xuất enzyme hiệu quả và bền vững. Ngoài ra, việc tối ưu hóa điều kiện môi trường để tăng cường hoạt động của enzyme cũng là một thách thức lớn.

2.1. Khó khăn trong việc phân lập nấm mốc

Phân lập nấm mốc chịu nhiệt từ môi trường tự nhiên là một quá trình phức tạp. Các điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ và độ ẩm đều ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm mốc. Việc tìm kiếm và xác định các chủng nấm mốc mới có khả năng thủy phân lignocellulose là một nhiệm vụ cần thiết.

2.2. Tính bền vững của enzyme thủy phân

Tính bền vững của enzyme thủy phân lignocellulose là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu. Enzyme cần phải hoạt động hiệu quả trong điều kiện khắc nghiệt và có khả năng chịu nhiệt tốt. Việc phát triển các hệ enzyme mới từ nấm mốc chịu nhiệt có thể giúp giải quyết vấn đề này.

III. Phương pháp nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt và enzyme thủy phân

Nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose thường sử dụng các phương pháp phân lập, xác định hoạt tính enzyme và phân tích hệ protein. Các phương pháp này giúp xác định các chủng nấm mốc có khả năng sản xuất enzyme hiệu quả và tối ưu hóa điều kiện hoạt động của chúng.

3.1. Phương pháp phân lập nấm mốc

Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt thường sử dụng môi trường nuôi cấy đặc biệt để kích thích sự phát triển của chúng. Các môi trường như PDA và YM được sử dụng để phân lập và nuôi cấy các chủng nấm mốc. Việc quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào là bước quan trọng trong quá trình này.

3.2. Xác định hoạt tính enzyme

Hoạt tính enzyme thủy phân lignocellulose được xác định thông qua các phương pháp như DNS và điện di protein. Các phương pháp này giúp đánh giá khả năng sản xuất enzyme của các chủng nấm mốc và so sánh hiệu quả của chúng trong việc phân hủy lignocellulose.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nấm mốc chịu nhiệt trong công nghiệp

Nấm mốc chịu nhiệt và enzyme thủy phân lignocellulose có nhiều ứng dụng thực tiễn trong các ngành công nghiệp như sản xuất nhiên liệu sinh học, chế biến thực phẩm và xử lý môi trường. Việc ứng dụng các chủng nấm mốc này có thể giúp giảm thiểu ô nhiễm và tăng cường hiệu quả sản xuất.

4.1. Ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học

Nấm mốc chịu nhiệt có khả năng sản xuất enzyme thủy phân lignocellulose, giúp chuyển hóa chất thải nông nghiệp thành nhiên liệu sinh học. Việc sử dụng enzyme từ nấm mốc có thể làm tăng hiệu quả và giảm chi phí sản xuất nhiên liệu sinh học.

4.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm

Enzyme thủy phân lignocellulose từ nấm mốc cũng được ứng dụng trong chế biến thực phẩm, giúp cải thiện chất lượng và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Việc sử dụng enzyme này có thể giúp tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng trong thực phẩm.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt

Nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose đang mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Việc phát triển các chủng nấm mốc mới và tối ưu hóa hoạt động của enzyme sẽ giúp nâng cao hiệu quả trong sản xuất nhiên liệu sinh học và các ứng dụng khác. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho ngành công nghiệp và bảo vệ môi trường.

5.1. Triển vọng nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt

Nghiên cứu nấm mốc chịu nhiệt sẽ tiếp tục được mở rộng, với mục tiêu tìm kiếm các chủng nấm mới có khả năng sản xuất enzyme hiệu quả hơn. Việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất và giảm thiểu tác động đến môi trường.

5.2. Hướng đi mới trong ứng dụng enzyme

Hướng đi mới trong ứng dụng enzyme từ nấm mốc chịu nhiệt sẽ tập trung vào việc phát triển các sản phẩm enzyme thương mại hóa. Việc này không chỉ giúp tăng cường hiệu quả sản xuất mà còn mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhu cầu chuyển dịch năng lượng toàn cầu và sức ép cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch đang thúc đẩy mạnh mẽ ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học thế hệ mới từ sinh khối lignocellulose. Hàng năm, các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp và chế biến thực phẩm tại Việt Nam thải ra hàng chục triệu tấn phế phụ phẩm hữu cơ, trong đó rơm rạ chứa khoảng 30% cellulose và 50% hemicellulose, bã mía chứa khoảng 40% đến 50% cellulose, còn lõi ngô chứa tới 45% cellulose và 35% hemicellulose. Việc khai thác nguồn phế thải này để sản xuất cồn sinh học và các hóa chất xanh mang lại giá trị bền vững to lớn. Tuy nhiên, rào cản kỹ thuật then chốt nằm ở cấu trúc phức tạp, bền vững của mạng lưới lignocellulose, đòi hỏi quá trình thủy phân bằng enzyme phải diễn ra ở nhiệt độ cao nhằm tăng tốc độ phản ứng, giảm độ nhớt dịch đường và hạn chế nhiễm khuẩn. Các chế phẩm enzyme thương mại hiện nay chủ yếu có nguồn gốc từ nấm sợi ưa ấm, dễ bị mất hoạt tính khi nhiệt độ vượt quá 45°C đến 50°C.

Nhằm giải quyết nút thắt công nghệ trên, đề tài tập trung phân lập, định danh và khảo sát đặc tính sinh học của các chủng nấm mốc chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động hiệu quả ở dải nhiệt độ cao từ 50°C đến 70°C. Nghiên cứu được triển khai trên 20 mẫu giá thể giàu chất hữu cơ thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Hà Nội, Hà Nam, Vĩnh Phúc và Yên Bái trong giai đoạn từ năm 2012 đến năm 2014. Kết quả của luận văn đóng góp cơ sở dữ liệu quan trọng cho công nghệ sinh học vi sinh vật nhiệt đới, mở ra triển vọng cắt giảm từ 20% đến 30% chi phí làm mát trong các lò phản ứng thủy phân quy mô công nghiệp và nâng cao hiệu suất chuyển hóa sinh khối nông nghiệp.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Quá trình phân giải sinh học lignocellulose đòi hỏi sự phối hợp đồng thời của hai hệ enzyme chính gồm enzyme phân hủy carbohydrate (CAZymes) và enzyme oxy hóa lignin. Trong đó, hệ enzyme cellulase và hemicellulase phần lớn được xếp vào đại gia đình Glycoside Hydrolase (GH) với hơn 2.500 enzyme thuộc 133 họ khác nhau.

Hệ thống cellulase hoàn chỉnh bao gồm ba nhóm enzyme xúc tác:

1. Endo-1,4-β-glucanase (CMCase, EC 3.2.1.4, chủ yếu thuộc họ GH5, GH6, GH7, GH12) có nhiệm vụ cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glycoside tại vùng vô định hình của sợi cellulose.
2. Cellobiohydrolase (CBH hay exocellulase, EC 3.2.1.91, thuộc họ GH6, GH7) tiến hành phân cắt tuần tự từ đầu khử hoặc đầu không khử của chuỗi polymer để giải phóng đường đôi cellobiose.
3. β-glucosidase (EC 3.2.1.21, thuộc họ GH1, GH3) đảm nhận vai trò thủy phân cellobiose thành các phân tử đơn đường D-glucose, đồng thời giải phóng sự ức chế ngược đối với endoglucanase và exoglucanase.

Đối với hemicellulose, polymer xylan chiếm tỷ trọng lớn nhất với mạch chính tạo bởi các liên kết β-1,4-D-xylopyranoside. Quá trình phân giải xylan cần sự tham gia của endo-β-1,4-xylanase (EC 3.2.1.8, thuộc họ GH10 và GH11) và β-xylosidase (EC 3.2.1.37, thuộc các họ GH3, GH39, GH43).

Về mặt thích nghi sinh học, nấm mốc chịu nhiệt có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ từ 45°C đến 62°C nhờ cơ chế cấu trúc phân tử đặc thù. Enzyme của chúng duy trì được độ bền nhiệt nhờ mật độ cầu nối disulfide cao, sự gia tăng các liên kết ion bề mặt, tương tác kỵ nước chặt chẽ trong lõi protein và sự hiện diện của các gốc proline ở đầu N của cấu trúc xoắn alpha giúp hạn chế sự biến tính nhiệt.

                  ┌──────────────────────────────────────────────┐
                  │          SINH KHỐI LIGNOCELLULOSE            │
                  │   (Cellulose, Hemicellulose, Lignin)         │
                  └──────────────────────┬───────────────────────┘
                                         │
                 ┌───────────────────────┴───────────────────────┐
                 ▼                                               ▼
   ┌───────────────────────────┐                   ┌───────────────────────────┐
   │         CELLULOSE         │                   │       HEMICELLULOSE       │
   │      (Mạch β-1,4-D)       │                   │          (Xylan)          │
   └─────────────┬─────────────┘                   └─────────────┬─────────────┘
                 │ Endo-1,4-β-glucanase                          │ Endo-β-1,4-xylanase
                 │ (CMCase, GH5, GH7)                            │ (GH10, GH11)
                 ▼                                               ▼
   ┌───────────────────────────┐                   ┌───────────────────────────┐
   │     Cellodextrin /        │                   │     Xylo-oligosaccharide  │
   │  Cellulose vô định hình   │                   │      (Mạch ngắn xylan)    │
   └─────────────┬─────────────┘                   └─────────────┬─────────────┘
                 │ Cellobiohydrolase                             │ β-Xylosidase
                 │ (CBH, GH6, GH7)                               │ (GH3, GH43)
                 ▼                                               ▼
   ┌───────────────────────────┐                   ┌───────────────────────────┐
   │         Cellobiose        │                   │         D-Xylose          │
   │        (Đường đôi)        │                   │      (Đường 5 carbon)     │
   └─────────────┬─────────────┘                   └───────────────────────────┘
                 │ β-Glucosidase
                 │ (GH1, GH3)
                 ▼
   ┌───────────────────────────┐
   │         D-Glucose         │
   │      (Đường 6 carbon)     │
   └───────────────────────────┘

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng 20 mẫu vật liệu hữu cơ tự nhiên gồm phân ủ rác thải đô thị, phân chuồng hoai mục, giá thể nấm linh chi, rơm rạ mục, bã tinh bột sắn và mùn cưa mục thu thập tại các khu vực ngoại thành Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hà Nam và Yên Bái. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng, ưu tiên các đống ủ hữu cơ có hiện tượng tự sinh nhiệt từ 40°C đến 80°C nhằm tối đa hóa khả năng thu nhận các chủng vi nấm chịu nhiệt.

Quy trình phân tích và thực nghiệm được tiến hành theo các bước chuẩn hóa:

• Phân lập và nuôi cấy thuần khiết: Mẫu được pha loãng theo nồng độ bậc 10 từ 10^-1 đến 10^-5 trong dung dịch NaCl 0,9%, cấy gạt 100 µl lên môi trường thạch Malt-glucose 2°Bx bổ sung 100 ppm kháng sinh chloramphenicol, ủ ở 50°C trong thời gian 48 đến 72 giờ. Giữ giống thuần khiết trên thạch nghiêng PDA.
• Phân nhóm bằng chỉ thị phân tử: Tách chiết ADN nấm bằng phương pháp sốc nhiệt và hạt thủy tinh, tinh sạch qua cột silica. Tiến hành phản ứng PCR-fingerprinting với mồi vi vệ tinh MST2 mang trình tự 5'-(GAC)5-3' trên máy luân nhiệt tự động với 35 chu kỳ nhiệt. Điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% trong đệm TAE 0,5X ở hiệu điện thế 50V để phân nhóm dựa vào phổ vạch đặc trưng.
• Định danh phân loại: Khuếch đại vùng ITS của rDNA (khoảng 1.200 bp) bằng cặp mồi phổ biến ITS1 và NL4, tinh sạch sản phẩm PCR và đọc trình tự với mồi ITS4 và NL1. Xử lý dữ liệu bằng phần mềm BioEdit và so đối chiếu độ tương đồng trên ngân hàng gen GenBank thông qua thuật toán BLAST.
• Xác định hoạt tính enzyme: Lên men lỏng 46 chủng nấm ở 50°C, lắc 140 vòng/phút trong 7 ngày với mật độ ban đầu 5x10^5 bào tử/ml. Thu dịch enzyme thô bằng ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút. Hoạt tính cellulase tổng số (đo trên giấy lọc Whatman số 1), hoạt tính CMCase (cơ chất CMC 1%) và hoạt tính xylanase (cơ chất xylan 1%) được xác định bằng phương pháp khử DNS ở bước sóng 540 nm.
• Phân tích điện di protein và Zymogram: Phân tách hệ protein ngoại bào bằng SDS-PAGE với gel phân tách 10% và gel tập trung 5%. Thực hiện Zymogram trên gel bổ sung 0,1% CMC hoặc 0,1% xylan, sau phản ứng thủy phân ở 50°C tiến hành nhuộm bằng dung dịch Congo Red 0,1% và cố định màu bằng NaCl 1M để phát hiện các băng enzyme hoạt tính. Đánh giá độ bền nhiệt qua xử lý nhiệt 70°C trong 20 phút và đo hoạt lực ở dải pH từ 3,0 đến 8,0.

Lý do lựa chọn kỹ thuật PCR-fingerprinting kết hợp giải trình tự rDNA ITS là nhằm đảm bảo tốc độ phân loại nhanh cho lượng mẫu lớn, tiết kiệm chi phí nhưng vẫn đạt độ chính xác ở cấp độ loài và dưới loài. Phương pháp DNS và điện di Zymogram được chọn vì tính định lượng quang phổ chuẩn mực kết hợp với việc trực quan hóa trực tiếp kích thước phân tử của các isoform enzyme có hoạt tính.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 20 mẫu vật liệu tự nhiên ban đầu, nghiên cứu đã phân lập thành công 46 chủng nấm mốc có khả năng sinh trưởng mạnh mẽ ở 50°C. Kết quả phân nhóm bằng chỉ thị phân tử vi vệ tinh MST2 kết hợp giải trình tự phân tích vùng gen ITS-rDNA đã định danh chính xác 46 chủng này vào 9 chi và 11 loài khác nhau.

Cơ cấu 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt phân lập theo loài:
┌──────────────────────────────────────┬─────────────┬──────────────┐
│ Loài nấm mốc chịu nhiệt              │ Số chủng    │ Tỷ lệ (%)    │
├──────────────────────────────────────┼─────────────┼──────────────┤
│ Thermomyces lanuginosus              │ 11          │ 23,9%        │
│ Rhizomucor (R. miehei & R. pusillus) │ 6           │ 13,0%        │
│ Scytalidium thermophilum             │ 5           │ 10,9%        │
│ Myceliophthora thermophila           │ 5           │ 10,9%        │
│ Aspergillus fumigatus                │ 4           │ 8,7%         │
│ Thielavia terrestris                 │ 3           │ 6,5%         │
│ Chaetomium thermophilum              │ 3           │ 6,5%         │
│ Các loài khác (M. albomyces, v.v.)   │ 9           │ 19,6%        │
└──────────────────────────────────────┴─────────────┴──────────────┘

1. Đa dạng loài nấm mốc chịu nhiệt bản địa: Chủng Thermomyces lanuginosus chiếm tỷ lệ cao nhất với 11 chủng (chiếm 23,9%), tiếp theo là chi Rhizomucor gồm R. miehei và R. pusillus với 6 chủng (chiếm 13,0%), Scytalidium thermophilum với 5 chủng (chiếm 10,9%), Myceliophthora thermophila với 5 chủng (chiếm 10,9%) và Aspergillus fumigatus với 4 chủng (chiếm 8,7%). Một số loài quý hiếm xuất hiện với tần suất thấp chỉ 1 chủng như Melanocarpus albomyces (FCH 5.6) hay Talaromyces thermophilus (FCH 10.4).
2. Khảo sát hoạt tính cellulase dịch ngoại bào: Phân tích định lượng qua phương pháp DNS cho thấy hoạt tính cellulase tổng số tự do trong dịch lên men thô của cả 46 chủng đều ở mức khá khiêm tốn, trung bình đạt khoảng 0,04 IU/ml. Các giá trị cụ thể đo được dao động từ 0,016 IU/ml ở chủng Aspergillus fumigatus (FCH 5.1) đến 0,027 IU/ml ở chủng Myceliophthora thermophila (FCH 112.2).
3. Hoạt tính vượt trội của CMCase và Xylanase: Trái ngược với hoạt tính cellulase tổng số, phần lớn các chủng nấm thuộc nhóm Thermomyces, Scytalidium và Myceliophthora tiết ra lượng lớn endoglucanase (CMCase) và endoxylanase với hoạt lực cao. Điện di Zymogram thể hiện các vạch phân giải cơ chất CMC và xylan rất rõ nét với dải kích thước protein trải dài từ 25 kDa đến 65 kDa.
4. Tính ổn định và bền nhiệt xuất sắc: Khi tiến hành ủ nhiệt dịch enzyme ở 70°C liên tục trong 20 phút, hệ enzyme xylanase và CMCase từ các chủng Thermomyces lanuginosus (FCH 5.5, FCH 12.1) và Scytalidium thermophilum (FCH 5.3) vẫn duy trì được từ 60% đến hơn 85% hoạt lực ban đầu. Enzyme hoạt động tối ưu trong dải pH từ 4,0 đến 6,0, thể hiện tính thích ứng hoàn hảo với các môi trường lên men công nghiệp có tính acid nhẹ.

Thảo luận kết quả

Nghịch lý giữa hoạt tính cellulase tự do đo được trong dịch nuôi cấy lỏng ở mức thấp (khoảng 0,04 IU/ml) và tốc độ phân giải cellulose cực nhanh của sợi nấm trong môi trường đống ủ tự nhiên được luận giải qua cấu trúc sinh lý của nấm chịu nhiệt. Tương tự như các phát hiện trên loài Sporotrichum thermophile, các enzyme cellulase của vi nấm chịu nhiệt có xu hướng liên kết chặt chẽ với màng tế bào và hệ sợi nấm để hình thành phức hệ phân giải tương tự cellulosome ở vi khuẩn, giúp hấp thu trực tiếp sản phẩm thủy phân mà không phân tán enzyme tự do ra môi trường dịch thể.

Khi so sánh với nấm sợi ưa ấm chuẩn công nghiệp như Trichoderma reesei, mặc dù T. reesei tiết nồng độ protein enzyme tự do ra môi trường cao hơn gấp nhiều lần, nhưng enzyme của T. reesei bị mất hoạt tính nhanh chóng ở nhiệt độ trên 50°C. Ngược lại, hệ xylanase và CMCase của các chủng Thermomyces lanuginosus và Scytalidium thermophilum trong nghiên cứu này hoạt động bền bỉ ở 60°C đến 70°C.

Để trực quan hóa các dữ liệu khoa học phức tạp, kết quả nghiên cứu có thể được thể hiện qua các mô hình sau:

• Biểu đồ cột so sánh kép: Thể hiện tương quan hoạt lực của xylanase và CMCase trước và sau khi xử lý nhiệt 70°C trong 20 phút cho từng nhóm loài, làm nổi bật sự vượt trội của chi Thermomyces và Scytalidium.
• Bảng ma trận đối chiếu đa chiều: Trình bày 46 mã chủng nấm tương ứng với phổ phân tử vi vệ tinh MST2, độ tương đồng chuỗi gen ITS trên GenBank, khối lượng phân tử phân tích từ ảnh gel SDS-PAGE/Zymogram và ngưỡng chịu nhiệt tối đa.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả khảo nghiệm thực nghiệm, luận văn đưa ra 4 nhóm khuyến nghị hành động cụ thể nhằm thúc đẩy ứng dụng công nghệ enzyme chịu nhiệt vào sản xuất:

1. Tối ưu hóa công nghệ lên men thu nhận enzyme: Các phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghiệp Thực phẩm và các trường đại học cần nghiên cứu tối ưu hóa cơ chất lên men bán rắn, bổ sung từ 2% đến 3% bã mía hoặc cám lúa mì làm chất cảm ứng sinh học, điều chỉnh tỷ lệ C/N thích hợp trong thời gian 6 đến 12 tháng tới nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp enzyme ngoại bào thêm 40% đến 50%.
2. Khai thác công nghệ sinh học phân tử tái tổ hợp: Nhóm nghiên cứu phân tử cần thực hiện nhân dòng gen mã hóa xylanase và endoglucanase chịu nhiệt từ các chủng ưu tú như Thermomyces lanuginosus (FCH 5.5, FCH 12.1) để biểu hiện dị phân trên các vật chủ nấm men như Pichia pastoris hoặc Aspergillus niger trong giai đoạn 1 đến 2 năm, hướng tới tạo ra các chế phẩm enzyme tái tổ hợp có hoạt lực đạt trên 1.500 IU/ml.
3. Thử nghiệm ứng dụng ở quy mô pilot: Các doanh nghiệp sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh và cồn sinh học cần phối hợp với các cơ quan nghiên cứu xây dựng hệ thống ủ sinh học ở dải nhiệt độ 50°C đến 60°C với quy mô từ 500 kg đến 1.000 kg nguyên liệu/mẻ trong vòng 18 tháng, giúp rút ngắn 30% thời gian ủ chín phế phụ phẩm nông nghiệp.
4. Mở rộng điều tra và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật nhiệt đới: Bộ Khoa học và Công nghệ cùng hệ sinh thái các viện nghiên cứu chuyên ngành cần phân bổ nguồn kinh phí giai đoạn 2025-2027 để mở rộng khảo sát tại các suối nước nóng, mỏ than và các bãi chôn lấp chất thải công nghiệp trên toàn quốc, bổ sung tối thiểu 150 chủng nấm mốc chịu nhiệt mới vào ngân hàng gen quốc gia.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu này là công trình khoa học có giá trị lý luận và thực tiễn cao, đặc biệt hữu ích cho 4 nhóm đối tượng sau:

• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học: Nắm vững quy trình chuẩn từ phân lập nấm mốc chịu nhiệt, kỹ thuật phân nhóm nhanh bằng PCR-fingerprinting với mồi vi vệ tinh MST2, đến phương pháp giải trình tự rDNA ITS và điện di Zymogram xác định hoạt tính enzyme.
• Các nhà khoa học trong lĩnh vực Năng lượng sinh học và Chuyển hóa sinh khối: Tìm kiếm các nguồn enzyme cellulase và xylanase bền nhiệt để tối ưu hóa quy trình đường hóa lignocellulose ở nhiệt độ cao, phục vụ sản xuất bioethanol thế hệ thứ 2.
• Kỹ sư công nghệ môi trường và doanh nghiệp chế biến phân bón hữu cơ: Ứng dụng các chủng nấm chịu nhiệt như Scytalidium thermophilum, Chaetomium thermophilum vào quy trình xử lý rác thải đô thị, rơm rạ và phế phụ phẩm công nghiệp tinh bột sắn, rút ngắn chu kỳ ủ compost từ 45 ngày xuống còn 20 ngày đến 25 ngày.
• Chuyên gia kỹ thuật ngành Công nghiệp Giấy và Thức ăn chăn nuôi: Khai thác enzyme xylanase chịu nhiệt không chứa cellulase để tẩy trắng sinh học bột giấy mà không làm tổn hại sợi cellulose, đồng thời bổ sung enzyme vào thức ăn gia súc nhằm nâng cao tỷ lệ tiêu hóa chất xơ thô.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nấm mốc chịu nhiệt lại được ưu tiên nghiên cứu hơn nấm mốc ưa ấm trong thủy phân lignocellulose?

Nấm mốc chịu nhiệt sản sinh hệ enzyme duy trì hoạt tính tốt ở 50°C đến 70°C. Thủy phân sinh khối ở nhiệt độ cao giúp tăng tốc độ phản ứng enzyme, giảm độ nhớt của dung dịch đậm đặc, hạn chế nguy cơ nhiễm tạp vi sinh vật gây hại và tiết kiệm đáng kể chi phí hạ nhiệt trong quy trình công nghiệp.

Kỹ thuật PCR-fingerprinting với mồi MST2 có vai trò gì trong phân loại 46 chủng nấm?

Chỉ thị phân tử vi vệ tinh MST2 với trình tự 5'-(GAC)5-3' cho phép phát hiện sự đa hình của các đoạn ADN lặp lại trong hệ gen nấm mốc. Phương pháp này phân loại chính xác các chủng ở cấp độ dưới loài, giúp nhóm 46 chủng thành các cụm đặc trưng trước khi chọn đại diện giải trình tự ITS, tiết kiệm khoảng 60% chi phí phân tích gen.

Nguyên nhân nào khiến hoạt tính cellulase tự do trong dịch nuôi cấy lỏng đo được ở mức thấp (khoảng 0,04 IU/ml)?

Ở nhiều loài nấm chịu nhiệt như Sporotrichum thermophile, phức hệ enzyme cellulase liên kết chặt chẽ với vách tế bào sợi nấm thay vì tiết tự do ra môi trường dịch thể. Dù nồng độ enzyme trong dịch ly tâm thấp, nấm vẫn phân giải sợi cellulose rất nhanh nhờ cơ chế tiếp xúc trực tiếp bề mặt sợi nấm và hấp thu sản phẩm đường ngay lập tức.

Những loài nấm nào chiếm ưu thế lớn nhất trong số 46 chủng phân lập được?

Chủng chiếm tỷ lệ lớn nhất là Thermomyces lanuginosus với 11 chủng (khoảng 23,9%), kế tiếp là các chủng thuộc chi Rhizomucor với 6 chủng (khoảng 13,0%), Scytalidium thermophilum với 5 chủng (khoảng 10,9%) và Myceliophthora thermophila với 5 chủng (khoảng 10,9%). Đây là các tác nhân vi sinh phân giải sinh khối chủ lực trong các đống phân ủ nhiệt độ cao.

Khả năng bền nhiệt ở 70°C của enzyme xylanase và CMCase mang lại giá trị công nghiệp gì?

Khả năng giữ trên 60% hoạt lực sau 20 phút ở 70°C cho phép ứng dụng trực tiếp các enzyme này trong quá trình tẩy trắng sinh học bột giấy ở nhiệt độ cao và trong các công đoạn xử lý nhiệt của ngành công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi mà không làm biến tính protein xúc tác.

Kết luận

• Phân lập và nhận diện thành công: Đã phân lập được 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt từ 20 mẫu vật liệu hữu cơ tự nhiên, định danh chính xác 11 loài thuộc 9 chi vi nấm nhiệt đới bản địa.
• Làm chủ công nghệ phân tử hiện đại: Ứng dụng thành công kỹ thuật PCR-fingerprinting với mồi vi vệ tinh MST2 kết hợp giải trình tự vùng gen ITS-rDNA để phân loại nấm chịu nhiệt nhanh chóng và chính xác.
• Phát hiện nguồn enzyme bền nhiệt quý giá: Xác định các chủng ưu tú thuộc loài Thermomyces lanuginosus, Scytalidium thermophilum và Myceliophthora thermophila có khả năng sinh tổng hợp hệ xylanase và CMCase chịu nhiệt độ cao từ 50°C đến 70°C.
• Kế hoạch phát triển tiếp theo: Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tới, tập trung tách dòng biểu hiện gen enzyme chịu nhiệt trên hệ thống vi sinh vật tái tổ hợp và tối ưu hóa quy trình lên men bán rắn quy mô pilot.
• Đóng góp học thuật và thực tiễn: Công trình cung cấp nguồn vật liệu sinh học giá trị cao, đóng góp nền tảng thiết thực cho ngành công nghệ sinh học môi trường và công nghiệp nhiên liệu sinh học bền vững tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 1. Lignocellulose Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose, hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1. Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010).

Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ khác nhau trong cùng một cây. Thành phần của lignocellulose trong các loài thực vật khác nhau được trình bày ở Bảng 1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến.

Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40–55 24–40 18–25 Thân gỗ mềm 45–50 25–35 25–35 Vỏ lạc 25–30 25–30 30–40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85–99 0 0–15 Rơm lúa mì 30 50 15 Lá cây 15–20 80–85 0 Hạt bông 80–95 5–20 0 Cỏ ven biển Bermuda 25 35. Cellulose Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật và là một trong những hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trong sinh quyển. Cellulose là polyme mạch thẳng có công thức hóa học (C6H10O5)n (trong đó n khoảng 10 000 - 15 000 tùy thuộc từng loại vật liệu). Một đơn vị lặp lại bao gồm 2 phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị giữa C1 của một phân tử glucose với C4 của phân tử glucose kế tiếp, được gọi là liên kết -1,4 glycoside [63], [59].

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hydro. Các liên kết hydro nội bộ và liên chuỗi mạng làm cho cellulose trở thành một polymer tương đối ổn định, và mang lại độ cứng cho các sợi cellulose. Cấu trúc phân tử cellulose (Christiane Laine 2005). Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Trong hệ sợi cellulose hình thành hai vùng: vùng tinh thể và vùng vô định hình.

Trong vùng tinh thể các sợi cellulose kết hợp với nhau theo một trật tự nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch kế tiếp. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Ngược lại các sợi cellulose trong vùng vô định hình liên kết với nhau khá lỏng lẻo bởi lực Van der Waals do đó dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài [2]. Vùng vô định hình cũng dễ bị tác nhân thủy phân tấn công hơn so với vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết -1,4-glycoside làm giảm độ bền của liên kết đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro.

Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose tinh thể. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose tinh thể nhiều và ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều cellulose vô định hình. Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc -OCH COOH [1].

Hemicellulose Hemicellulose là polyme sinh học phong phú thứ hai trên trái đất, là heteropolymer của đường 5 carbon (xylose và arabinose), đường 6 carbon (glucose, galactose, mannose) và các acid (acetic). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung như mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-1,4, xylose là thành phần chủ yếu, nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3, mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D- Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ xylopyranoside. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên.

Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucoronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử tùy thuộc vào loại thực vật, vị trí của nó ở các mô, tế bào. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Christiane Laine 2005).

Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Christiane Laine 2005). Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Xylan tồn tại ở dạng arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Hình 1.3) hay ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Hình 1.4), hay thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc. Lignin Lignin là một trong những thành phần của tế bào thực vật bao bọc xung quanh các sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose. Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loại cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý.

Trong thực vật lignin đóng vai trò chất kết nối, liên kết các tế bào làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn độc tố đồng thời giúp thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn [1]. Lignin được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, và một vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol [63]. Cấu trúc của lignin rất đa dạng tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ.

Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân loại thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringy lignin. Lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc, bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô dịnh hình. Các vòng phenyl trong lignin gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào.

Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200˚C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Trong dinh dưỡng động vật lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ.

Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các cacbonhydrate khác bị bẻ gẫy. Enzyme thủy phân lignocellulose Để phân hủy một hợp chất polymer phức tạp như lignocellulose cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme ngoại bào của vi sinh vật. Các enzyme này được phân loại là enzyme phân hủy carbohydrate (CAZymes) và enzyme oxy hóa lignin (FOLymes) [6], [18].

Cellulase và hầu hết hemicellulase thuộc về một họ các enzyme được gọi là Glycoside Hydrolase (GH). Sự phân loại Glycoside Hydrolase vào các họ khác nhau dựa trên cơ sở tương đồng về trình tự axit, các protein trong một họ nhất định sẽ có nếp gấp tương tự nhau cho phép mô hình hóa tương đồng [10], [11], [12]. Vì vậy các enzyme đặc trưng với các cơ chất khác nhau đôi khi được tìm thấy trong cùng một họ, cho thấy một sự phân kỳ tiến hóa để có được đặc trưng mới. Hiện nay hơn 2500 GH đã được xác định và phân thành 133 họ bao gồm các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật với các cơ chất khác nhau [9], [53], [61].

Cellullase Cellulase là hệ enzym xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vị glucose. Cellulase từ nấm mốc chủ yếu được tìm thấy trong một vài họ GH bao gồm GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Cellulase sử dụng hai cơ chế xúc tác khác nhau để thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong cellulose là cơ chế giữ và nghịch đảo. Hầu như tất cả các cellulase GH thủy phân liên kết glycoside bởi cơ chế giữ trừ GH 6 sử dụng cơ chế nghịch đảo.

Hầu hết các cellulase có một mô-đun liên kết carbohydrate (CBM), các CBM có trách nhiệm liên kết các enzyme với vùng cellulose tinh thể để tăng cường hoạt động của enzyme. Hiện nay nhiều CBM đã được xác định và phân loại thành 54 họ, tuy nhiên chỉ có một số họ (1, 13, 14, 18- 21, 24, 29, 32, 35, 38, 39, 40, 42, 43, 47, 48, 50 và 52) được tìm thấy trong nấm mốc [9], [18], [61]. Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên gồm 3 nhóm chủ yếu: Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase. Mặc dù β-glucosidase không phân hủy trực tiếp cellulose, nhưng nó vẫn được coi là một thành phần của hệ thống cellulase vì nó kích thích quá trình thủy phân cellulose.

Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng. Trọng lượng Nhiệt Cơ chất tối pH tối Glycosyl Enzyme phân tử độ tối ưu ưu hóa (kDa) ưu Endo-1,4-β- Cellulose vô Monomer Chủ yếu Không có 50-70 glucanase định hình (22-45) 4-5 hoặc rất thấp Cellobiohydrola Cellulose tinh Monomer Chủ yếu Không có 37-60 se thể (50-65) 4-5 hoặc rất thấp Monomer, Cellobiose, Khác Thường rất β-glucosidase dimer, trimer 45-75 cellodextrin nhau cao (35-450)  Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.