CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 1. Lignocellulose Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose, hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1. Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010).
Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ khác nhau trong cùng một cây. Thành phần của lignocellulose trong các loài thực vật khác nhau được trình bày ở Bảng 1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến.
Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40–55 24–40 18–25 Thân gỗ mềm 45–50 25–35 25–35 Vỏ lạc 25–30 25–30 30–40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85–99 0 0–15 Rơm lúa mì 30 50 15 Lá cây 15–20 80–85 0 Hạt bông 80–95 5–20 0 Cỏ ven biển Bermuda 25 35. Cellulose Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật và là một trong những hợp chất hữu cơ phổ biến nhất trong sinh quyển. Cellulose là polyme mạch thẳng có công thức hóa học (C6H10O5)n (trong đó n khoảng 10 000 - 15 000 tùy thuộc từng loại vật liệu). Một đơn vị lặp lại bao gồm 2 phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị giữa C1 của một phân tử glucose với C4 của phân tử glucose kế tiếp, được gọi là liên kết -1,4 glycoside [63], [59].
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der Waals và liên kết hydro. Các liên kết hydro nội bộ và liên chuỗi mạng làm cho cellulose trở thành một polymer tương đối ổn định, và mang lại độ cứng cho các sợi cellulose. Cấu trúc phân tử cellulose (Christiane Laine 2005). Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Trong hệ sợi cellulose hình thành hai vùng: vùng tinh thể và vùng vô định hình.
Trong vùng tinh thể các sợi cellulose kết hợp với nhau theo một trật tự nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch kế tiếp. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài. Ngược lại các sợi cellulose trong vùng vô định hình liên kết với nhau khá lỏng lẻo bởi lực Van der Waals do đó dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài [2]. Vùng vô định hình cũng dễ bị tác nhân thủy phân tấn công hơn so với vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết -1,4-glycoside làm giảm độ bền của liên kết đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro.
Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose tinh thể. Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose tinh thể nhiều và ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều cellulose vô định hình. Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc -OCH COOH [1].
Hemicellulose Hemicellulose là polyme sinh học phong phú thứ hai trên trái đất, là heteropolymer của đường 5 carbon (xylose và arabinose), đường 6 carbon (glucose, galactose, mannose) và các acid (acetic). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung như mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-1,4, xylose là thành phần chủ yếu, nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3, mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D- Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ xylopyranoside. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên.
Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucoronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác. Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử tùy thuộc vào loại thực vật, vị trí của nó ở các mô, tế bào. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Christiane Laine 2005).
Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Christiane Laine 2005). Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Xylan tồn tại ở dạng arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Hình 1.3) hay ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Hình 1.4), hay thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc. Lignin Lignin là một trong những thành phần của tế bào thực vật bao bọc xung quanh các sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose. Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loại cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý.
Trong thực vật lignin đóng vai trò chất kết nối, liên kết các tế bào làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn độc tố đồng thời giúp thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn [1]. Lignin được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, và một vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol [63]. Cấu trúc của lignin rất đa dạng tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ.
Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân loại thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringy lignin. Lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc, bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô dịnh hình. Các vòng phenyl trong lignin gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào.
Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200˚C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Trong dinh dưỡng động vật lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ.
Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các cacbonhydrate khác bị bẻ gẫy. Enzyme thủy phân lignocellulose Để phân hủy một hợp chất polymer phức tạp như lignocellulose cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme ngoại bào của vi sinh vật. Các enzyme này được phân loại là enzyme phân hủy carbohydrate (CAZymes) và enzyme oxy hóa lignin (FOLymes) [6], [18].
Cellulase và hầu hết hemicellulase thuộc về một họ các enzyme được gọi là Glycoside Hydrolase (GH). Sự phân loại Glycoside Hydrolase vào các họ khác nhau dựa trên cơ sở tương đồng về trình tự axit, các protein trong một họ nhất định sẽ có nếp gấp tương tự nhau cho phép mô hình hóa tương đồng [10], [11], [12]. Vì vậy các enzyme đặc trưng với các cơ chất khác nhau đôi khi được tìm thấy trong cùng một họ, cho thấy một sự phân kỳ tiến hóa để có được đặc trưng mới. Hiện nay hơn 2500 GH đã được xác định và phân thành 133 họ bao gồm các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật với các cơ chất khác nhau [9], [53], [61].
Cellullase Cellulase là hệ enzym xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vị glucose. Cellulase từ nấm mốc chủ yếu được tìm thấy trong một vài họ GH bao gồm GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 44, 45, 48, 61 và 74. Cellulase sử dụng hai cơ chế xúc tác khác nhau để thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong cellulose là cơ chế giữ và nghịch đảo. Hầu như tất cả các cellulase GH thủy phân liên kết glycoside bởi cơ chế giữ trừ GH 6 sử dụng cơ chế nghịch đảo.
Hầu hết các cellulase có một mô-đun liên kết carbohydrate (CBM), các CBM có trách nhiệm liên kết các enzyme với vùng cellulose tinh thể để tăng cường hoạt động của enzyme. Hiện nay nhiều CBM đã được xác định và phân loại thành 54 họ, tuy nhiên chỉ có một số họ (1, 13, 14, 18- 21, 24, 29, 32, 35, 38, 39, 40, 42, 43, 47, 48, 50 và 52) được tìm thấy trong nấm mốc [9], [18], [61]. Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên gồm 3 nhóm chủ yếu: Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase. Mặc dù β-glucosidase không phân hủy trực tiếp cellulose, nhưng nó vẫn được coi là một thành phần của hệ thống cellulase vì nó kích thích quá trình thủy phân cellulose.
Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng. Trọng lượng Nhiệt Cơ chất tối pH tối Glycosyl Enzyme phân tử độ tối ưu ưu hóa (kDa) ưu Endo-1,4-β- Cellulose vô Monomer Chủ yếu Không có 50-70 glucanase định hình (22-45) 4-5 hoặc rất thấp Cellobiohydrola Cellulose tinh Monomer Chủ yếu Không có 37-60 se thể (50-65) 4-5 hoặc rất thấp Monomer, Cellobiose, Khác Thường rất β-glucosidase dimer, trimer 45-75 cellodextrin nhau cao (35-450) Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.