MỞ ĐẦU Ngành thuỷ sản đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển kinh tế của đất nước ta. Quy mô của ngành thuỷ sản ngày càng mở rộng và vai trò của ngành cũng tăng lên không ngừng trong nền kinh tế quốc dân. Động vật thuỷ sản là một trong những nguồn cung cấp lương thực, thực phẩm và các sản phẩm tiêu dùng phong phú cho con người. Trong đó, bao gồm các loại tôm, cua, cá,… Tuy nhiên, mỗi năm ngành thuỷ sản nước ta lại bị thiệt hại nặng nề vì dịch bệnh, chủ yếu trên tôm nước lợ, cá nước ngọt, cá biển, nhuyễn thể… Các yếu tố ngoại cảnh tác động lên động vật thuỷ sản bao gồm môi trường sống và tác nhân gây bệnh.
Trong đó, dịch bệnh trên động vật thuỷ sản gây thiệt hại lớn chủ yếu là do các tác nhân gây bệnh (vi khuẩn, virus, nấm, tác nhân gây bệnh kí sinh…). Một trong những vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản điển hình đó là các vi khuẩn thuộc chi Vibrio [2 ; 22]. Thiệt hại do bệnh thủy sản, đặc biệt là tôm lên đến 60000 ha (năm 2014) ảnh hưởng rất lớn đến người nuôi trồng thủy sản và nền kinh tế. Các vi khuẩn Vibrio sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và động vật biển.
Đối với cá, Vibrio spp. chủ yếu gây bệnh nhiễm trùng máu, đối với tôm Vibrio spp. gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin. Những vi khuẩn này thường là tác nhân gây bệnh cơ hội, khi động vật thuỷ sản chịu sự bất lợi từ yếu tố môi trường hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng.
Động vật thuỷ sản yếu không có sức đề kháng, các loài vi khuẩn Vibrio cơ hội gây bệnh nặng làm động vật này chết rải rác tới hàng loạt [2]. Nhiều giải pháp để phòng, trừ bệnh do nhóm vi khuẩn này gây ra trên động vật thuỷ sản như sử dụng kháng sinh, chế phẩm sinh học. Tuy nhiên, hiệu quả của các biện pháp này còn thấp. Hơn nữa, do sử dụng nhiều kháng sinh mà các vi khuẩn Vibrio đa phần đều kháng kháng sinh gây ảnh hưởng đến môi trường và càng làm giảm hiệu quả của thuốc kháng sinh.
Trong những năm gần đây, các nghiên cứu tập trung vào việc làm rối loạn hệ thống “quorum sensing” – một dạng “giao tiếp của vi khuẩn”. Quorum sensing (QS) là cơ chế thông tin liên lạc giữa các tế bào và đáp 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử tín hiệu. Vai trò của quorum sensing là điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như: sự phát sáng, sự tiếp hợp, sự hình thành biofilm, swarming… [1; 9]. Việc ngăn chặn hệ thống giao tiếp QS của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Vibrio nói riêng là hướng đi mới nhằm ngăn ngừa khả năng gây bệnh của chúng mà không cần đặt chúng dưới áp lực chọn lọc (chẳng hạn như dùng kháng sinh hoặc chất hoá học để tiêu diệt chúng).
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu khả năng sử dụng vi sinh vật để ức chế quá trình quorum sensing của các vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên động vật thuỷ sản”. 2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan vi khuẩn Vibrio 1. Đặc điểm chung của chi Vibrio Vibrio có vị trí phân loại như sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Vibrionales Họ: Vibrionaceae Chi: Vibrio Chi Vibrio là một nhóm vi khuẩn đa dạng bao gồm ít nhất 74 loài riêng biệt.
Vibrio thuộc lớp Gammaproteobacteria và là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước từ 0,3-0,5 x 1,4-2,6µm di động nhờ tiên mao, không hình thành bào tử. Đa số các Vibrio đều là các vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện. Hầu hết chúng đều phát triển trong môi trường nước biển (Na+ cần cho sự phát triển của chúng, là nhu cầu tuyệt đối) và không phát triển trên môi trường không có muối. Đa số các loài Vibrio sống hoại sinh, một số gây bệnh cho người và động vật; ví dụ như Vibrio cholerae gây bệnh tả trên người, Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên tôm, Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan trên cá.
Đặc trưng của các loài Vibrio là khả năng sống trong điều kiện pH cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường axít. Một số loài có thể phát triển rất nhanh (tăng gấp đôi trong 10 phút) [6; 7; 8; 40]. Môi trƣờng nuôi cấy các loài vi khuẩn Vibrio Môi trường chọn lọc để phân lập các loài vi khuẩn Vibrio là môi trường thạch TCBS (Thiosulphate citrate bile salt agar). TCBS có tính chọn lọc cao, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Vibrio.
Tuy nhiên, môi trường TCBS chỉ có thể giúp phân loại vi khuẩn Vibrio thành hai nhóm: có sử dụng và không sử dụng đường sucrose. Các vi khuẩn có khả năng lên men sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu vàng (Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus,…) và ngược lại, các vi khuẩn không có 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khả năng sử dụng sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus…) [7 ; 8.1 Hình thái một số khuẩn lạc Vibrio điển hình trên môi trƣờng thạch TCBS Hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch TCBS Loài Màu khuẩn lạc Vibrio cholera Khuẩn lạc màu vàng Vibrio parahaemolyticus Xanh Vibrio anguillarum Vàng Vibrio harveyi Màu xanh ở trung tâm, xung quanh vàng V. alginolyticus Vàng Vibrio vulnificus Vàng lục 1. Đặc điểm sinh hoá của chi Vibrio Các vi khuẩn Vibrio cho phản ứng oxidase và catalase dương tính, lên men yếm khí, các chủng vi khuẩn phát sáng đều phát triển tốt ở môi trường có 3% NaCl, sinh indole và có khả năng tạo axít từ mannitol và trehalose, không sinh H2S và Urease.
Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Hầu hết các vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio có thể tồn tại và nhân rộng ở các vùng nước bị tăng độ nhiễm mặn (nồng độ muối cao, có thể lên tới 6% NaCl) và ở nhiệt độ 10-30oC. Khi sinh trưởng trong môi trường TCBS, một số loài Vibrio có khả năng lên men đường sucrose (Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus…) nên cho khuẩn lạc màu vàng [6; 8; 45]. Một số Vibrio gây bệnh trên ngƣời và động vật thuỷ sản 1.
Lịch sử phát hiện bệnh gây ra do Vibrio Vào những năm 1970, bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện bởi Tukiash. Vào thời gian này, dịch bệnh gây chết với tỷ lệ >50% ở động vật thuỷ sản như cua xanh (Callinectes sapidus). Sau đó, năm 1977, Fisher đã công bố kết quả nghiên cứu bệnh trên các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus americarus), châu Á (Panulirus homarus) và công bố nguyên nhân bệnh là do nhiễm phải nhóm vi khuẩn Vibrio [20]. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Năm 1990, Hasawai cho rằng tác nhân gây bệnh đỏ thân ở tôm Sú (Thái Lan) là do phẩy khuẩn.
Còn ở Việt Nam, một số nhà nghiên cứu cho rằng nguyên nhân của bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo già. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Viện nuôi trồng thuỷ sản 3 thì bệnh đỏ thân ở tôm là do vi khuẩn Vibrio alginolyticus (1 loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio) [42; 43; 44]. Bệnh vibriosis (bệnh do các vi khuẩn Vibrio gây ra) có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi trồng thuỷ sản nước lợ và nước mặn. Từ mẫu tôm, cá bị mắc bệnh, thậm chí là mẫu đất nơi mà Vibrio thường có mặt, ta có thể phân lập được nhiều loài vi khuẩn Vibrio.
Vi khuẩn Vibrio harveyi Vibrio harveyi là vi khuẩn thuộc chi Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm của vi khuẩn này là: hình que, Gram âm, phát quang sinh học, di động nhờ roi cực, ưa mặn và có khả năng trao đổi chất lên men và hô hấp. Chúng không phát triển ở nhiệt độ 4°C hoặc trên 35°C. Có thể tìm thấy Vibrio harveyi sống tự do trong vùng biển nhiệt đới, trong ruột của động vật biển và là mầm bệnh cơ hội của tôm, cá bơn, tôm hùm…Chúng gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển.
Tôm khi nhiễm vi khuẩn này thường phát bệnh sau khi nuôi một tháng. Tôm nhiễm bệnh có đặc điểm là bơi lội không định hướng, phản xạ chậm, khả năng bắt mồi giảm, một số con dạt vào bờ. Quan sát vỏ và thân thấy màu cáu bẩn, cơ có màu đục, gan teo, ruột rỗng; trong bóng tối phát ánh sáng xanh. Vi khuẩn Vibrio harveyi có thể sống được ở độ mặn từ 0 - 40‰, phát triển mạnh ở độ mặn 20 - 30‰.
Khi xâm nhập cơ thể tôm, vi khuẩn tấn công tế bào gan, dẫn tới viêm loét gan, suy giảm chức năng gan [21; 27]. Vi khuẩn Vibrio cholerae Giống như Vibrio harveyi, Vibrio cholerae là vi khuẩn thuộc chi Vibrio, nhóm Gram âm. Đặc điểm của vi khuẩn này là: hình dấu phẩy, có một roi ở một cực tế bào. cholerae lần đầu tiên được phân lập từ mẫu bệnh dịch tả bởi nhà giải phẫu học người Ý Filippo Pacini năm 1854.
Vibrio cholerae thường gây bệnh tả cho người [13 ; 14] 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Vi khuẩn này có dạng hình uốn cong, Gram âm, được tìm thấy trong nước lợ và nước mặn. Vibrio parahaemolyticus bao gồm các chủng có độc tố có khả năng gây bệnh và các chủng không gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính. parahaemolyticus có khả năng chịu đựng với các độ mặn, pH, nhiệt độ và dễ dàng đeo bám trên các sinh vật phù du di chuyển theo dòng chảy.
parahaemolyticus rất phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa sông, và một số ít hiện diện trong môi trường nước ngọt. Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tuỵ trên tôm do Lightner (Đại học Arizona, Mỹ) nghiên cứu phát hiện ra. Tôm mắc bệnh này thường bị sưng gan tuỵ dẫn đến chết. Ngoài ra, vi khuẩn này còn gây bệnh phồng đuôi ở tôm, tuy không lan thành dịch lớn nhưng cũng ảnh hưởng đến năng suất nuôi [23].
Vi khuẩn Vibrio alginolyticus Vibrio alginolyticus là những vi khuẩn hình que ngắn, Gram âm, khi nuôi cấy trên TCBS cho khuẩn lạc màu vàng do có khả năng lên men sucrose. Vibrio alginolyticus thường gây bệnh đỏ thân ở tôm làm tôm và ấu trùng chết hàng loạt và bệnh xuất huyết, lở loét ở cá chẽm. Vi khuẩn gây bệnh khi môi trường sống của thuỷ sản bị ô nhiễm nặng, thức ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém [37 ; 39].