Đánh Giá Khả Năng Ức Chế Sự Phát Triển Của Vi Khuẩn Từ Dịch Chiết Một Số Thực Vật Tại Lào

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hus đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn từ dịch chiết một số thực vật thu thập tại, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Kitsamone Sihavong
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Quang Huy
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Đánh Giá Khả Năng Ức Chế Sự Phát Triển Của Vi Khuẩn Từ Dịch Chiết Một Số Thực Vật Thu Thập Tại Lào
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Vi sinh vật gây bệnh đối với con ngƣời
• 1.1.1. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn
• 1.1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh ở người
• 1.1.2.1. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
• 1.1.2.2. Vi khuẩn Bacillus cereus (B. cereus)
• 1.1.2.3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus)
• 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Chủng vi sinh vật
• 2.2. Mẫu thực vật trong nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị thí nghiệm
• 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.5. Nuôi cấy vi khuẩn
• 2.6. Tách chiết các hợp chất thực vật thứ sinh trong dịch chiết
• 2.7. Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
• 2.8. Nghiên cứu định tính các thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực vật
• 2.9. Định lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết các mẫu thực vật
• 2.10. Định lượng Flavonoids tổng số trong dịch chiết các mẫu thực vật
• 2.11. Phân tách các thành phần các chất thực vật thứ sinh trong mẫu
• 2.12. Phương pháp xác định khả năng quét gốc tự do DPPH
• 2.13. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ mẫu thực vật
• 3.2. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và cao chiết các mẫu thực vật
• 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các mẫu trong n-Hexan
• 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết mẫu thực vật trong Ethanol 80%
• 3.5. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và cao chiết Ethyl acetat
• 3.6. Kết quả định tính các loại hợp chất trong các mẫu thực vật
• 3.7. Cây Sầu đâu (Azadirachta indica)
• 3.8. Kết quả định lượng flavonoid tổng số trong các mẫu thực vật
• 3.9. Kết quả định lượng polyphenol tổng số
• 3.10. Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết Sầu đâu
• 3.11. Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết Núc nác
• 3.12. Phân tách các chất trong Sầu đâu và núc nắc bằng sắc ký bản mỏng
• 3.13. Kết quả xác định khả năng quét gốc tự do DPPH
• MỘT SỐ KÝ HIỆU VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khả Năng Ức Chế Vi Khuẩn Từ Dịch Chiết Thực Vật

Khả năng ức chế vi khuẩn từ dịch chiết thực vật là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong y học hiện đại. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất tự nhiên có trong thực vật có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Việc tìm kiếm và đánh giá khả năng kháng khuẩn từ các loài thực vật tại Lào không chỉ giúp bảo vệ sức khỏe mà còn góp phần bảo vệ môi trường.

1.1. Tình Hình Nghiên Cứu Về Vi Khuẩn Gây Bệnh

Vi khuẩn gây bệnh là nguyên nhân chính dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng ở con người. Các vi khuẩn như Escherichia coli, Staphylococcus aureus và Bacillus cereus thường gặp trong môi trường sống và thực phẩm. Nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của thực vật có thể giúp tìm ra các giải pháp điều trị hiệu quả hơn.

1.2. Tác Dụng Của Các Hợp Chất Từ Thực Vật

Nhiều hợp chất tự nhiên như flavonoids và polyphenols có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất này không chỉ có tác dụng kháng khuẩn mà còn có khả năng chống oxi hóa, bảo vệ tế bào khỏi tổn thương.

II. Vấn Đề Kháng Kháng Sinh Trong Điều Trị Vi Khuẩn

Sự gia tăng khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn đang trở thành một thách thức lớn trong y học. Việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp đã dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị mới từ thiên nhiên là cần thiết.

2.1. Nguyên Nhân Dẫn Đến Kháng Kháng Sinh

Kháng kháng sinh xảy ra khi vi khuẩn phát triển khả năng chống lại các loại thuốc kháng sinh. Nguyên nhân chính bao gồm việc sử dụng kháng sinh không đúng cách và lạm dụng trong nông nghiệp.

2.2. Hệ Lụy Của Kháng Kháng Sinh

Kháng kháng sinh không chỉ làm giảm hiệu quả điều trị mà còn dẫn đến tăng chi phí y tế và tỷ lệ tử vong cao hơn. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị thay thế từ thiên nhiên là rất cần thiết.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Từ Dịch Chiết

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ dịch chiết thực vật được thực hiện thông qua nhiều phương pháp khác nhau. Các phương pháp này bao gồm tách chiết hợp chất, nuôi cấy vi khuẩn và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn.

3.1. Tách Chiết Hợp Chất Từ Thực Vật

Quá trình tách chiết hợp chất từ thực vật thường sử dụng các dung môi như ethanol, methanol hoặc nước. Các hợp chất sau khi tách chiết sẽ được phân tích để xác định hoạt tính kháng khuẩn.

3.2. Phương Pháp Thử Nghiệm Hoạt Tính Kháng Khuẩn

Phương pháp khuếch tán đĩa thạch là một trong những phương pháp phổ biến để đánh giá khả năng kháng khuẩn. Kết quả thử nghiệm sẽ cho thấy đường kính vòng ức chế vi khuẩn, từ đó đánh giá được hiệu quả của dịch chiết.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Từ Dịch Chiết

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều mẫu dịch chiết từ thực vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Các mẫu dịch chiết từ cây Sầu đâu và Núc nác cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ.

4.1. Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Dịch Chiết Sầu Đâu

Dịch chiết từ cây Sầu đâu cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ đối với các chủng vi khuẩn như E. coli và S. aureus. Kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển thuốc kháng khuẩn từ thiên nhiên.

4.2. Kết Quả Thử Nghiệm Với Dịch Chiết Núc Nác

Dịch chiết từ cây Núc nác cũng cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để xác định các hợp chất chính có trong dịch chiết này.

V. Kết Luận Về Khả Năng Ức Chế Vi Khuẩn Từ Dịch Chiết Thực Vật

Nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn từ dịch chiết thực vật tại Lào đã chỉ ra rằng nhiều loài thực vật có khả năng kháng khuẩn đáng kể. Việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên không chỉ giúp điều trị bệnh mà còn bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Kháng Khuẩn Từ Thực Vật

Nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn từ thực vật sẽ tiếp tục được mở rộng. Các hợp chất tự nhiên có thể trở thành nguồn dược liệu quý giá trong điều trị bệnh.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong sản xuất thuốc kháng khuẩn từ thiên nhiên, góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Tình trạng gia tăng đề kháng kháng sinh đang là mối đe dọa nghiêm trọng đối với hệ thống y tế toàn cầu, khi tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc tại các cơ sở điều trị lâm sàng ở nhiều khu vực đã vượt mức 50% đến 70%. Trong bối cảnh số lượng kháng sinh tổng hợp mới được cấp phép ngày càng khan hiếm, việc tìm kiếm và phát triển các hoạt chất sinh học tự nhiên từ thảo mộc trở thành hướng tiếp cận chiến lược. Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc trưng của Đông Nam Á, Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào sở hữu hệ sinh thái thực vật phong phú với hàng ngàn loài cây thuốc cổ truyền có giá trị dược tính cao nhưng chưa được khảo sát hệ thống dưới góc độ hóa sinh hiện đại.

Đề tài tập trung giải quyết bài toán sàng lọc và đánh giá thực nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của 9 loài thực vật phổ biến tại Lào đối với 4 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh phổ biến ở người. Mục tiêu cụ thể là xác định dung môi chiết xuất tối ưu, lượng hóa hoạt tính ức chế vi khuẩn thông qua đường kính vòng kháng khuẩn, đồng thời phân tích định tính và định lượng các nhóm chất thứ sinh chủ chốt như polyphenol và flavonoid. Nghiên cứu được triển khai thực nghiệm trong giai đoạn năm 2015 đến năm 2016 tại Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Kết quả không chỉ cung cấp bộ số liệu khoa học với hiệu suất chiết xuất đạt tới 29% và đường kính ức chế vi khuẩn đạt đỉnh 18 mm, mà còn tạo nền tảng vững chắc cho việc bảo tồn nguồn tài nguyên dược liệu và phát triển các chế phẩm kháng khuẩn sinh học an toàn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh hóa thực vật về các hợp chất trao đổi chất thứ cấp (Secondary Plant Metabolites). Khác với các chất trao đổi bậc một thiết yếu cho sự sinh trưởng, các chất thứ sinh như phenolic, flavonoid, tannin và alkaloid đóng vai trò là hệ thống phòng thủ tự nhiên giúp thực vật ức chế sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây hại. Hiện nay, khoa học đã nhận diện hơn 8000 hợp chất phenolic và hơn 4500 loại flavonoid tự nhiên mang hoạt tính sinh học đa dạng.

Cơ chế kháng khuẩn của các hoạt chất thực vật vận hành theo các mô hình tác động chính:

• Phá vỡ tính toàn vẹn và ức chế sinh tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.
• Làm rối loạn chức năng thẩm thấu chọn lọc của màng sinh chất, khiến các ion nội bào thoát ra ngoài.
• Gắn kết với các thụ thể trên tiểu phân ribosome 30S hoặc 50S để ức chế quá trình dịch mã tổng hợp protein.
• Tác động lên enzyme DNA gyrase hoặc RNA polymerase nhằm ngăn cản quá trình nhân đôi và phiên mã của acid nucleic.

Ba khái niệm trung tâm được vận dụng xuyên suốt gồm: nhóm Polyphenol (hợp chất có chứa ít nhất một vòng thơm gắn các nhóm hydroxyl), nhóm Flavonoid (cấu trúc khung carbon C6-C3-C6 với khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn mạnh), và Khả năng quét gốc tự do DPPH (đo lường hoạt tính chống oxy hóa thông qua độ hấp thụ quang phổ).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn mẫu thực vật gồm 9 loài thu hái trực tiếp tại Lào: Sương sâm, Tầm gửi, Sầu đâu, Cù đèn (Croton), Trinh nữ, Nhàu, Muồng đen, Keo dậu và Núc nác. Mẫu lá được sơ chế, sấy khô ở nhiệt độ 40-50°C và nghiền nhỏ qua rây đường kính 0,8 mm. Bốn chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn bao gồm Bacillus cereus ATCC 14579, Bacillus subtilis ATCC 23857, Escherichia coli ATCC 25922 và Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Quy trình chiết xuất áp dụng kỹ thuật siêu âm phân đoạn với 3 hệ dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-Hexan, Ethyl acetate và Ethanol 80% từ 5 g bột mẫu. Khả năng kháng khuẩn được lượng hóa bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (đục lỗ thạch đường kính 6 mm, nạp 50 µl dịch chiết, giữ lạnh ở 4°C trong 2 giờ để khuếch tán và nuôi ủ ở 37°C trong 16-20 giờ). Định lượng polyphenol tổng số thực hiện bằng phương pháp Folin-Ciocalteu đo quang ở bước sóng 765 nm với chất chuẩn acid gallic. Định lượng flavonoid tổng số theo phương pháp tạo phức với nhôm clorua AlCl3 đo ở bước sóng 415 nm theo chất chuẩn quercetin. Thành phần hóa học được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản silicagel F254 với hệ dung môi Toluen : Ethyl acetate : Axeton : Acid formic (tỷ lệ 5:3:1:1).

Lý do lựa chọn phương pháp: Kỹ thuật đục lỗ thạch đảm bảo độ ổn định và lặp lại cao; phép đo quang phổ UV-Vis cho độ nhạy vượt trội trong phân tích lượng vết; và phương pháp sắc ký lớp mỏng giúp nhận diện nhanh phổ chất đặc trưng của từng phân đoạn dịch chiết.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Hiệu suất chiết xuất phụ thuộc chặt chẽ vào độ phân cực của dung môi. Dung môi Ethanol 80% thể hiện khả năng hòa tan hoạt chất cao nhất trên tất cả 9 mẫu nghiên cứu, đạt hiệu suất dao động từ 2,8% đến 29%. Cụ thể, mẫu Cù đèn (Croton) cho hiệu suất cao nhất đạt 29% (tương đương 1,45 g cao khô từ 5 g bột lá), tiếp theo là Keo dậu đạt 9,4% (0,47 g) và Tầm gửi đạt 5,8% (0,29 g). Ngược lại, dung môi kém phân cực n-Hexan cho hiệu suất rất thấp và hầu như không hòa tan được các chất thứ sinh có hoạt tính. Đối với dung môi bán phân cực Ethyl acetate, hiệu suất đạt từ 1,8% đến 9,2%, trong đó Keo dậu dẫn đầu với 9,2% (0,36 g) và Núc nác đạt 4,8% (0,24 g).

Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết và cao chiết phân cực thể hiện ưu thế rõ nét. Cao chiết Ethanol 80% của cây Núc nác và Sầu đâu thể hiện phổ kháng khuẩn rộng nhất, ức chế đồng thời cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định. Đường kính vòng vô khuẩn của Núc nác đối với trực khuẩn Gram âm E. coli đạt 12 mm ở dạng dịch chiết và mở rộng lên tới 18 mm ở dạng cao chiết cô đặc. Mẫu Sầu đâu thể hiện hoạt tính kháng E. coli vượt trội với vòng kháng khuẩn từ 14 mm đến 16 mm, đồng thời ức chế tốt B. subtilis (9 mm) và S. aureus (8 mm).

Phổ ức chế trên các nhóm vi khuẩn cho thấy 77,8% số mẫu cao chiết (7/9 loài) có khả năng ức chế tụ cầu vàng Staphylococcus aureus và 66,7% (6/9 loài) ức chế được trực khuẩn E. coli cũng như Bacillus cereus. Đặc biệt, cao chiết Ethyl acetate từ lá Keo dậu thể hiện hoạt tính đặc hiệu rất mạnh đối với S. aureus với đường kính vòng kháng khuẩn đạt mức kỷ lục 18 mm.

Thảo luận kết quả

Khả năng kháng khuẩn vượt trội của các phân đoạn chiết Ethanol 80% và Ethyl acetate bắt nguồn từ sự hiện diện phong phú của các hợp chất phenolic, flavonoid và tannin. Những phân tử này có cấu trúc hydroxyl tự do dễ dàng tạo liên kết hydro với protein màng tế bào vi khuẩn, làm biến tính enzyme hô hấp và gây ly giải vách tế bào.

So sánh với các công bố quốc tế về dược liệu Azadirachta indica (Sầu đâu) và Oroxylum indicum (Núc nác), hoạt tính kháng E. coli và S. aureus ghi nhận trong nghiên cứu này có sự tương đồng cao, đồng thời chứng minh chất lượng nguồn dược liệu thu thập tại Lào có hàm lượng hoạt chất thứ sinh rất dồi dào. Toàn bộ dữ liệu thực nghiệm được trực quan hóa qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ thu hồi cao chiết (%) và bảng ma trận đường kính vòng vô khuẩn (D - d, mm), giúp lượng hóa chính xác mối tương quan giữa nồng độ phân đoạn chiết và mức độ ức chế vi sinh vật.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phân lập và tinh chế sâu các hoạt chất đơn lẻ từ dịch chiết cây Núc nác, Sầu đâu và Keo dậu: Đạt mục tiêu độ tinh khiết hóa học trên 95% bằng phương pháp sắc ký cột kết hợp HPLC và xác định cấu trúc phân tử qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) trong thời hạn 12 tháng, do các Viện nghiên cứu Hóa thực vật và Khoa Sinh học chủ trì.
2. Xác định chính xác nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC): Thiết lập ngưỡng MIC dưới 100 µg/ml trên các chủng vi khuẩn phân lập lâm sàng kháng đa thuốc (MDR) trong vòng 6 đến 9 tháng, thực hiện bởi các phòng thí nghiệm vi sinh y học.
3. Ứng dụng công nghệ nano hóa để phát triển chế phẩm kháng khuẩn sinh học: Tăng sinh khả dụng và độ bền hóa học của dịch chiết Núc nác và Sầu đâu lên 30% đến 40%, hoàn thành giai đoạn thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật trong thời gian 18 đến 24 tháng do các đơn vị công nghệ sinh học và dược phẩm đảm trách.
4. Xây dựng quy chuẩn kỹ thuật thu hái và chế biến dược liệu hữu cơ tại các vùng sinh thái ở Lào: Đảm bảo hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng số dao động ổn định trong khoảng 15-25 mg/g dược liệu khô, triển khai thí điểm trong 24 tháng dưới sự điều phối của Bộ Khoa học và Công nghệ Lào.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Nhà nghiên cứu và giảng viên chuyên ngành Sinh học, Dược học, Hóa hợp chất tự nhiên: Tiếp cận hệ thống dữ liệu thực nghiệm toàn diện về hiệu suất chiết xuất phân đoạn, cơ chế ức chế vi sinh vật và phương pháp định tính, định lượng các hợp chất thứ sinh từ thực vật nhiệt đới.
• Học viên cao học và sinh viên các ngành Khoa học Sự sống: Nắm vững phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm, từ kỹ thuật xử lý mẫu thực vật, quy trình siêu âm phân đoạn dung môi, kỹ thuật khuếch tán đĩa thạch đến phân tích sắc ký lớp mỏng TLC và đo quang phổ UV-Vis.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm, mỹ phẩm và chế phẩm sát khuẩn: Ứng dụng kết quả kháng khuẩn mạnh của Núc nác, Sầu đâu và Keo dậu để nghiên cứu công thức sản xuất dung dịch rửa tay, gel bôi ngoài da, xà phòng y tế và thực phẩm chức năng bảo vệ sức khỏe.
• Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách khoa học công nghệ tại Lào và Việt Nam: Sử dụng luận văn làm cơ sở dữ liệu khoa học phục vụ công tác quy hoạch, bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý và thúc đẩy các dự án hợp tác nghiên cứu phát triển dược liệu xuyên biên giới.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao dịch chiết Ethanol 80% lại đạt hiệu suất chiết và hoạt tính kháng khuẩn cao hơn n-Hexan?

Dung môi Ethanol 80% có độ phân cực cao, cho phép hòa tan tối đa các hợp chất thứ sinh phân cực như flavonoid, polyphenol và alkaloid. Thực nghiệm chứng minh hiệu suất chiết Ethanol 80% đạt tới 29% ở cây Cù đèn, trong khi n-Hexan kém phân cực chỉ hòa tan được một lượng nhỏ chất béo và sáp, dẫn đến đường kính kháng khuẩn không đáng kể.

Những loài thực vật nào trong số 9 mẫu khảo sát có hoạt tính kháng khuẩn mạnh mẽ nhất?

Cây Núc nác (Oroxylum indicum) và Sầu đâu (Azadirachta indica) thể hiện phổ ức chế rộng nhất trên cả 4 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Trong đó, cao chiết Núc nác tạo vòng kháng khuẩn với trực khuẩn E. coli đạt đường kính tới 18 mm, còn dịch chiết Sầu đâu đạt đường kính từ 14 mm đến 16 mm.

Phương pháp khuếch tán đĩa thạch được thực hiện với các thông số kỹ thuật nào?

Phương pháp tiến hành trên môi trường thạch LB, tạo các giếng đục có đường kính chính xác 6 mm và nạp 50 µl dịch chiết thử nghiệm. Các đĩa thạch được ủ lạnh ở 4°C trong 2 giờ để hoạt chất khuếch tán đều vào thạch trước khi chuyển sang tủ ấm 37°C nuôi cấy trong 16-20 giờ.

Cao chiết cây Keo dậu có đặc điểm kháng khuẩn nổi bật nào?

Trong dung môi Ethyl acetate, cao chiết lá Keo dậu (Leucaena leucocephala) đạt hiệu suất chiết 9,2% và thể hiện hoạt tính ức chế đặc hiệu cực mạnh đối với tụ cầu vàng Staphylococcus aureus với đường kính vòng vô khuẩn lên đến 18 mm, mở ra tiềm năng lớn trong bào chế thuốc trị nhiễm khuẩn da.

Luận văn đã sử dụng những kỹ thuật phân tích hóa sinh nào để định lượng hoạt chất?

Tác giả đã áp dụng phương pháp Folin-Ciocalteu đo quang ở bước sóng 765 nm đối chiếu đường chuẩn acid gallic để xác định polyphenol tổng số, phương pháp tạo phức với AlCl3 đo ở bước sóng 415 nm đối chiếu quercetin để định lượng flavonoid, cùng sắc ký lớp mỏng TLC với hệ dung môi TEAF tỷ lệ 5:3:1:1.

Kết luận

• Luận văn đã hoàn thành sàng lọc thực nghiệm 9 loài thực vật thu thập tại Lào, xác định Ethanol 80% là dung môi tối ưu với hiệu suất chiết cao vượt trội (đạt đỉnh 29% ở Cù đèn và 9,4% ở Keo dậu).
• Khẳng định Núc nác và Sầu đâu là hai nguồn dược liệu tiềm năng nhất, có khả năng ức chế đồng thời 4 chủng vi khuẩn gây bệnh với đường kính vòng kháng khuẩn lên đến 18 mm.
• Ghi nhận 77,8% số loài nghiên cứu có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và 66,7% kháng Escherichia coli, chứng minh triển vọng thay thế kháng sinh tổng hợp.
• Chuẩn hóa thành công quy trình chiết tách siêu âm kết hợp định tính, định lượng polyphenol, flavonoid và phân tách thành phần qua sắc ký lớp mỏng TLC.
• Đóng góp luận cứ khoa học quan trọng cho việc bảo tồn đa dạng sinh học và phát triển chuỗi giá trị dược liệu bản địa tại Lào.

Trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới, các hướng nghiên cứu tiếp theo cần tập trung phân lập cấu trúc đơn chất và đánh giá độc tính tế bào in vitro. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác chi tiết số liệu toàn văn luận văn để cùng hợp tác phát triển các ứng dụng sinh dược học thực tiễn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, khi đời sống kinh tế xã hội của con ngƣời ngày càng đƣợc nâng cao vấn đề chăm sóc sức khoẻ con ngƣời ngày càng đƣợc quan tâm chú ý. Các ứng dụng khoa học hiện đại trong y học đã giúp sàng lọc nhiều loại thuốc đặc trị những căn bệnh trƣớc kia đƣợc xem là bệnh nan y. Không chỉ dừng lại ở chữa trị, các nhà khoa học còn đi sâu tìm hiểu nguyên nhân, cơ chế của bệnh để đƣa ra phƣơng pháp điều trị tối ƣu. Hiện nay, rất nhiều loại kháng sinh tổng hợp có hiệu quả cao trong việc chữa trị đối với các bệnh do vi sinh vật gây ra đã và đang đƣợc sản xuất với quy môi công nghiệp.

Tuy nhiên việc lạm dụng sử dụng kháng sinh tổng hợp đã làm gia tăng khả năng kháng kháng sinh của vi sinh vật trong khi số kháng sinh tổng hợp mới còn chƣa nhiều. Do đó, việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn mới có nguồn gốc từ tự nhiên trở thành một hƣớng nghiên cứu đã và đang đƣợc quan tâm ứng dụng trong điều trị bảo vệ sức khỏe [1]. Việc sử dụng các loại thuốc nguồn gốc tự nhiên này không chỉ giúp cho việc bảo vệ chăm sóc sức khỏe mà còn có tác dụng về bảo vệ môi trƣờng. Trong số các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, các hợp chất tách chiết từ thực vật luôn đƣợc quan tâm đặc biệt cả về số lƣợng và chất lƣợng.

Từ lâu, nhiều hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật nhƣ gừng, bạc hà… đã đƣợc sử dụng trong các bài thuốc dân gian để điều trị. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học việc xác định các hoạt chất trong thực vật dùng làm thuốc đã chứng minh hiệu quả từ những kinh nghiệm chữa bệnh dân gian. Bằng kết quả thực nghiệm, các nhà khoa học đã chỉ ra rằng một số hợp chất trong cây đặc biệt là các chất thứ sinh có giá trị trong chữa bệnh, ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh. Quercetin trong chè xanh, măng cụt,.có tác dụng diệt khuẩn, chữa sâu răng mà không độc với con ngƣời.

Silymarin trong cây kê có tác dụng chống oxi hoá và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thƣ. Catechin có trong nhiều loài thực vật ngăn chặn và làm chậm sự phát triển của tế bào khối u. Lào là quốc gia ở Đông Nam Á có khí hậu và thảm thực vật phong phú và đa dạng, dân tộc Lào có truyền thống lâu đời về sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh. Để góp phần nghiên cứu tách chiết và xác định bƣớc đầu thử hoạt tính Luận văn thạc sĩ 1 Kisamone SIHAVONG LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] kháng lại một số vi sinh vật gây bệnh của các chất thứ sinh có trong một số loài thực vật phổ biến ở Lào, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn từ dịch chiết một số thực vật thu thập tại Lào” với mục đích tách chiết và bƣớc đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết đến khả năng phát triển của một số chủng vi sinh vật gây bệnh.

Luận văn thạc sĩ 2 Kisamone SIHAVONG LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi sinh vật gây bệnh đối với con ngƣời 1. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn Vi khuẩn là các sinh vật đơn bào có hình dạng và hoạt động đơn giản do chúng chƣa có màng nhân. Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp mọi nơi, sống trong mọi khí hậu và vị trí trên trái đất, trong không khí, nƣớc hoặc đất.

Nhiều vi sinh vật gây hại cho sức khỏe, chúng là tác nhân gây nên các bệnh nhƣ viêm da, viêm màng não hay các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Nhiều loại vi sinh vật hay vi khuẩn có hại cho con ngƣời nhƣng một số lại có lợi nhƣ các loại vi khuẩn có trong đƣờng tiêu hóa chúng giúp hỗ trợ quá trình hấp thu thức ăn, sản xuất vitamin và tăng cƣờng miễn dịch [1]. Độc tính với các tính chất như kết dính, nhân lên và phát triển Kết dính: bƣớc quan trọng đầu tiên trong quá trình tƣơng tác giữa vi khuẩn và vật chủ là sự bám dính của chúng lên bề mặt vật chủ bao gồm da, niêm mạc (khoang miệng, mũi hầu, đƣờng tiết niệu) và các tổ chức sâu hơn nhƣ biểu mô dạ dày, ruột, bề mặt phế nang, tổ chức nội mô. Cơ thể tạo ra nhiều lực cơ học khác nhau nhằm loại bỏ các vi khuẩn ra khỏi các bề mặt này nhƣ bài tiết nƣớc bọt, tiết dịch niêm mạc, ho, nhu động ruột, dòng máu chảy…Đặc điểm chung của các vi khuẩn gây bệnh là chúng có khả năng hình thành các yếu tố giúp chúng chống chịu đƣợc các lực cơ học đó.

Các yếu tố bám dính của vi khuẩn chúng có bản chất là polypeptide hoặc polysaccharide. Khi đã bám dính vào bề mặt tế bào vật chủ, vi khuẩn có khả năng khởi động các quá trình sinh hóa đặc hiệu nhƣ tăng sinh, tiết độc tố, xâm nhập và hoạt hóa các tín hiệu của tế bào vật chủ [26]. Nhân lên và phát triển: sau khi xâm nhập vào vật chủ vi sinh vật gây bệnh có thể sống ký sinh nội bào hoặc ký sinh ngoại bào, và chúng sử dụng dinh dƣỡng của cơ thể vật chủ để tạo năng lƣợng phục vụ cho các hoạt động sống. Vi khuẩn sinh sản vô tính chủ yếu bằng nhân đôi, tùy thuộc điều kiện môi trƣờng mà thời gian nhân lên của chúng khác nhau.

Luận văn thạc sĩ 3 Kisamone SIHAVONG LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Kháng lại thực bào: tùy vào đặc tính của từng loài vi sinh vật, từng loại kháng nguyên của chúng mà các chủng vi sinh vật có thể chống lại sự thực bào của hệ thống miễn dịch trong cơ thể vật chủ [26]. Tạo độc tố Độc tố vi khuẩn là những chất của vi khuẩn tạo ra có tác dụng gây độc đối với cơ thể con ngƣời. Độc tố vi khuẩn có hai loại: nội độc tố và ngoại độc tố [26]. Nội độc tố: là những chất mà vi khuẩn sinh ra nằm bên trong tế bào của chúng, không đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng.

Khi tế bào vi khuẩn vào trong tế bào vật chủ, nó tạo ra độc tố đƣợc giải phóng ra ngoài và gây độc. Ngoại độc tố là những độc tố do vi khuẩn tạo ra, chúng đƣợc vi khuẩn tiết ra ngoài môi trƣờng gây độc cho cơ thể vật chủ. Tạo ra các enzym Vi khuẩn có khả năng tạo ra các enzym gây hại cho tế bào vật chủ nhƣ: - Hemolysine: có tác dụng làm tan tế bào. - Streptokinase: làm tan fibrin.

- Hyluronidase: gây tan mô liên kết giúp vi khuẩn có thể lây lan khắp cơ thể. - Steptolysin: làm vỡ màng bạch cầu, chống lại hệ miễn dịch của cơ thể. Ngoài ra vi khuẩn còn có khả năng tiết một số enzyme đề kháng kháng sinh nhƣ lactamase, acetylase… [26]. Một số vi khuẩn gây bệnh ở người 1.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E.

coli) Là một nhóm vi khuẩn sống trong đƣờng tiêu hóa (ruột) của ngƣời và động vật (hình 1. Trong đƣờng tiêu hoá E. coli chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%), hầu hết các chủng E. coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đƣờng ruột.

Tuy nhiên có 4 nhóm vi khuẩn E. coli có khả năng gây bệnh cho ngƣời và động vật gồm Enteropathogenic E.coli (EIEC) và Enterohaemorrhagic E. coli hiện diện rộng rãi trong các môi trƣờng ô nhiễm (phân, chất thải hữu cơ). coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đƣờng tiêu hóa, biểu hiện lâm sàng thay đổi từ nhẹ đến rất nặng, có thể dẫn đến tử vong tùy thuộc vào mức độ nhiễm [9].

Luận văn thạc sĩ 4 Kisamone SIHAVONG LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Về đặc điểm hình thái: E. coli là trực khuẩn ngắn có 2 đầu tròn, kích thƣớc từ 2-3 µm (đôi khi 4-8 µm trong môi trƣờng ô nhiễm). Chúng có thể đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn vi khuẩn E.

coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, nhƣng cũng một số chủng không có khả năng di động. coli là vi khuẩn Gram âm. Dƣới kính hiển vi điện tử ngƣời ta phát hiện đƣợc cấu trúc pilli-yếu tố mang kháng nguyên bám dính của E. Về đặc điểm cấu trúc: E.

coli đƣợc chia làm các dạng khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên than O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên bám dính F. Bằng phản ứng ngƣng kết, các nhà khoa học đã tìm ra đƣợc 250 serotype O, 89 serotpe K, 56 serotype H và môt số serotype F [4]. Khi xác định serotype đầy đủ của một chủng vi khuẩn E. coli thì phải xác định ở cả 3 loại kháng nguyên trên.

Kháng nguyên O đƣợc coi nhƣ là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết. Ngƣng kết kháng ngyên O tạo thành những hạt nhỏ khó tan. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông – Hauch) là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O.

Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhƣng có khả năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhƣng có ý nghĩa rất lớn trong xác định tên loài của vi khuẩn [25].

Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc – Capsular), còn đƣợc gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP- Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular). Vai trò kháng nguyên K chƣa đƣợc rõ ràng. Có nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về mặt độc lực của vi khuẩn [25]. Tuy nhiên, một số ý kiến khác cho rằng nó có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trƣớc nhƣng yếu tố phòng vệ của vật chủ.

Các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ sau: Luận văn thạc sĩ 5 Kisamone SIHAVONG LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.