CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) 1. Giới thiệu chung Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng.
Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người. Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà,.), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic.
Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người.
Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,. có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3]. 6 Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển.
Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) [4]. Đă ̣c điểm hình thái của vi khuẩ n lactic. Các tế bào có hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn cong, thường tạo thành chuỗi.
Không có khả năng di động (ngoại trừ một số chủng có tiên mao hoặc lông roi trên bề mặt cơ thể), không sinh bào tử, gram dương. Một số chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue. [51] Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề mă ̣t bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Còn với trực khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.
Đặc điểm hình thái giống vi khuẩ n lactic điể n hin ̀ h: Trong số các vi khuẩ n lactic, giố ng Lactobacillus đươ ̣c xem là đa ̣i diê ̣n cho chủng vi khuẩ n này. 7 Đồ án tốt nghiệp Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng : hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài. _ Giống Lactobacillus Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillacea Giống: Lactobacillus a) c) b) d) Hình 1.
Mô ̣t số vi khuẩ n lactic điể n hình a) Lactobacillus casei b) Latobacillus brevis c) Lactobacillus bulgaricus d) Lactobacillus plantarum 8 Đồ án tốt nghiệp Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. bulgaricus … Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao.
Ngoại trừ loài L. plantarum thì những loài khác không có khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định. Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum.
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau: - Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium, có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC. Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic.
9 Đồ án tốt nghiệp - Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 1. Đặc điể m sinh lý, sinh trưởng Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt môi trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2.
Có thể bị ức chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số loài thuộc nhóm sinh vật kỵ khí bắt buộc. Có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid nucleic, vitamin, khoáng, acid béo, ester acid béo và carbohydrate. Các yêu cầu dinh dưỡng đặc trưng cho từng loài, thường là các chủng đặc biệt. Nhiệt độ tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40oC.
Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.2, thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH môi trường trung tính hoặc kiềm. 10 Đồ án tốt nghiệp Bảng 1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic Nhiệt Khả năng Hình Lên độ tăng pH tăng chịu Lactic aicd Chi thái tế men trưởng, trưởng muối,% isomer o bào lactic C 10 45 6,5 18 4,4 9,6 Lactobacillus que đh/dh ± ± ± - ± - D,L,DL Lactococcus Cầu đh + - - - ± - L Leuconostoc Cầu dh + - ± - ± - D Oenococcus Cầu dh + + ± - ± - D Pediococcus Tứ cầu đh ± ± ± - + - D,L,DL Streptococcus Cầu đh - + - - - - L Tetragenococcu Tứ cầu đh + - + + - + L s Aerococcus Tứ cầu đh + - + - - + L Carnobacterium Que dh + - - - - - L Enterococcus Cầu đh + + + - + + L Vagococcus Cầu đh + - - - ± - L Weissella Cầu dh + - ± - ± - D,L,DL (đh: đồng hình ; dh: dị hình) 1. Đặc điể m sinh hoá Vi khuẩ n lactic là vi khuẩ n gram (+), oxidase âm tính, không có khả năng di đô ̣ng đồ ng thời không sinh bào tử, có khả năng lên men carbonhydrate.
Hiếm khi khử nitrate, chỉ khi pH cuối cùng từ 6.0 trở lên hoặc có bổ sung vào môi trường tăng trưởng. Không thủy phân gelatine (làm gelatine hóa lỏng), không phân giải 11 Đồ án tốt nghiệp casein nhưng một lượng nhỏ nitơ hòa tan được sản xuất ra bởi hầu hết các chủng. Thử nghiệm Indole âm tính và không sản xuất H2S. Catalase và cytochrome âm tính (không có prophyrin), tuy nhiên, một vài chủng của một số loài phân hủy H2O2 bằng pseudocatalase hoặc bằng chính catalase của heme có mặt trong môi trường.
Phản ứng Benzidine âm tính. Hiếm có trường hợp hình thành sắc tố, nếu có sẽ xuất hiện màu cam, vàng, đỏ gạch. Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan.
Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình. Lên men đồng hình gồm con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic.
Trong khi đó ở lên men lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO 2, acetaldehyde, ethanol. 12 Đồ án tốt nghiệp Hình 1. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic A) Lên men đồng hình. B) Lên men dị hình 13 Đồ án tốt nghiệp Lên men lactic đồng hình Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, diacetyl.