Tổng quan luận án

Bệnh lý ác tính ung thư đặc trưng bởi sự phân chia tế bào không kiểm soát, có khả năng xâm lấn các mô lân cận và di căn đến nhiều cơ quan khác nhau trong cơ thể. Theo số liệu thống kê từ tổ chức Ung thư toàn cầu GLOBOCAN năm 2018 được tác giả trích dẫn, Việt Nam ghi nhận hơn 300.000 người đang sống chung với bệnh ung thư và 164.871 trường hợp tử vong. Trên phạm vi toàn cầu, có khoảng 23 triệu người mắc bệnh, với hơn 14 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu người tử vong mỗi năm. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) xếp Việt Nam vào nhóm 50 quốc gia thuộc phân vùng thứ hai của bản đồ ung thư thế giới. Phần lớn các dược chất chống ung thư hiện đang áp dụng trong điều trị lâm sàng hoạt động theo cơ chế đơn đích, gây nhiều tác dụng không mong muốn và đối mặt với hiện tượng kháng thuốc gia tăng. Do đó, xu hướng phát triển các phân tử thuốc đa đích sinh học (multi-target drugs) thông qua chiến lược lai hóa phân tử (molecular hybridization) đang trở thành giải pháp thu hút nhiều sự quan tâm. Chiến lược này kết hợp các đơn vị dược lý của hai hay nhiều phân tử thuốc có cơ chế tác dụng khác nhau vào một cấu trúc thống nhất nhằm khuếch đại hoạt tính điều trị và hạn chế độc tính phụ.

Xuất phát từ bối cảnh đó, luận án tập trung tích hợp hai nhóm hoạt chất: combretastatin A-4 (chất ức chế sự trùng hợp vi ống tubulin mạnh) và celecoxib (thuốc kháng viêm ức chế chọn lọc cyclooxygenase-2, đồng thời có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào độc lập với COX-2). Luận án được thực hiện với tiêu đề: "Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib – combretastatin".

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 5 nội dung đánh số cụ thể:

  1. Thiết kế được cấu trúc các hợp chất lai coxib - combretastatin.
  2. Tổng hợp được các hợp chất lai coxib - combretastatin.
  3. Sàng lọc được các hoạt tính kháng ung thư và kháng viêm của các hợp chất lai.
  4. Xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các hợp chất lai.
  5. Tiến hành docking phân tử hợp chất lai coxib - combretastatin với hai đích tác dụng COX2 và tubulin.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là các phân tử lai coxib – combretastatin, bao gồm dãy dẫn chất este (hợp chất 79–98), dẫn chất chứa nhóm trifluoromethyl CF3 (hợp chất 102) và dãy dẫn chất axit carboxylic (hợp chất 103–122). Phạm vi nghiên cứu về không gian thực nghiệm bao gồm: quá trình tổng hợp hóa học, phân tích cấu trúc phổ nghiệm và thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro tại Viện Hóa học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hợp chất thiên nhiên (thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) cùng Khoa Dược tại Trường Đại học Perugia (Cộng hòa Liên bang Đức/Italy). Phạm vi đánh giá hoạt tính sinh học tập trung vào 3 dòng tế bào ung thư người (MCF-7, HT-29, HepG2), dòng đại thực bào chuột RAW 264.7 kích thích bởi LPS và mô phỏng phân tử trên hai cấu trúc tinh thể protein COX-2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các thành tựu nghiên cứu về hợp chất lai hóa phân tử định hướng kháng ung thư và kháng viêm, đặc biệt là các hợp chất nhắm vào protein vi ống tubulin và enzyme COX-2:

  • Các chất lai chống ung thư dựa trên chất ức chế tubulin: Tác giả điểm lại các nhóm chất ức chế vi ống tự nhiên và bán tổng hợp được sử dụng làm khung cấu trúc dẫn đường, bao gồm combretastatin A-4 (1), colchicin (2), podophyllotoxin (3), chalcon (4), taxol (5) và vinca alkaloid (6). Tubulin cấu tạo từ các dị phân tử α- và β-tubulin với 3 vị trí gắn kết chính: trung tâm colchicin, trung tâm vinca alkaloid và trung tâm taxoid. Các chất làm mất ổn định vi ống gắn vào vị trí colchicin (như combretastatin) ngăn chặn quá trình kéo dài polymer vi ống, làm dừng chu kỳ tế bào ở pha G2/M và kích nổ chu trình chết theo chương trình apoptosis.
  • Các chất lai combretastatin tiêu biểu: Combretastatin phân lập từ vỏ rễ cây Combretum caffrum Nam Phi từ năm 1982. Tác giả dẫn chứng các công trình lai hóa combretastatin:
    • Parihar và cộng sự tổng hợp chất lai combretastatin – estradiol (28), thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 với giá trị IC50 đạt 7,5 µM cùng khả năng ức chế tubulin.
    • Banwell và cộng sự (2006) thiết kế dãy hợp chất lai combretastatin với alkaloid lamellarin (59) dạng 4,5-diaryl-1H-pyrrole-2-carboxylate, chứng minh nhóm trimethoxyaryl (ở các dẫn xuất 29, 60) giữ vai trò quyết định, nếu mất đi (như dẫn xuất 61) hoạt tính ức chế tubulin suy giảm từ 3 đến 5 lần.
    • Shen và cộng sự (2010) tổng hợp hợp chất lai combretastatin A-4 (1) và lamellarin D (62) tạo dẫn chất 63 có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào K-562, A-549, SMMC-7721, SGC-7901 và HCT-116.
    • Rasolofonjatovo và cộng sự (2010) tổng hợp các hợp chất lai triarylolefin mang cấu trúc CA4 - isoCA4 (30) ức chế tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT-116.
    • Các dạng tiền dược combretastatin A-4 phosphate (CA4P, fosbretabulin / ZYBRESTAT do hãng Oxigene thử nghiệm lâm sàng) và combretastatin A-1 phosphate (CA1P) cũng được phân tích về khả năng cải thiện độ tan trong nước.
  • Các hệ chất lai khác trong y văn:
    • Dựa trên isatin (7): dẫn chất uracil – isatin (8) và isatin – triazol (9).
    • Dựa trên coumarin (10): phân lập từ năm 1820 từ đậu tonka; các sản phẩm lai coumarin – pyrazolin (11) và coumarin – stilben (12).
    • Dựa trên steroid: estradiol (13) lai với chlorambucil (14) và geldanamycin – estradiol (15).
    • Dựa trên pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin (PBD - 16) từ vi khuẩn Streptomyces: các chất lai benzothiazol – PBD (17) và bisindol – PBD (18).
    • Dựa trên colchicin: colchicin – caulerpenyn (31), colchicin – tubulizin (32), colchicin – adamantan (33).
    • Dựa trên podophyllotoxin (3) (phân lập bởi Podwyssotzki năm 1880): các chất lai bisepipodophyllotoxin (34) và acrylamidopodophyllotoxin (35).
    • Dựa trên chalcon (4): các dẫn chất chalcon – dihydrobenzofuran (36) và chalcon – biscoumarin (37).
    • Dựa trên taxol (5): Wittman và cộng sự (2001) với chất lai paclitaxel – cisplatin (38); dẫn xuất discodermolid – paclitaxel (39) thể hiện hoạt tính vượt trội gấp 2 đến 8 lần trên dòng A549 và MCF-7.
    • Dựa trên vinca alkaloid (6): vinca alkaloid – phomopsin (40) và vindolin – thiocolchicin (41).
    • Các chất lai khác: psorospermin/quinobenzoxazin (19), norindenoisoquinolin – camptothecin, benzofuran – imidazol (20).
  • Tổng quan về cơ chế COX-2 và pyrazol: Enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) tham gia tổng hợp prostaglandin (PGE2) trong phản ứng viêm và sự tiến triển của khối u ác tính. Celecoxib (65) (Celebrex, Onsenal) là thuốc ức chế chọn lọc COX-2 chứa nhân pyrazol, vừa có tác dụng giảm đau kháng viêm vừa có khả năng bắt giữ chu kỳ tế bào G0/G1 và kích ứng apoptosis độc lập với COX-2. Các nghiên cứu lai hóa pyrazol được điểm lại gồm: Chiara Brullo và cộng sự (2020) với các chất lai pyrazol – imidazopyrazol (67, 68, 69) ức chế sản sinh ROS với IC50 khoảng 10 µM; Surendra R và cộng sự (2018) tổng hợp KSS-19 (72) là phân tử lai celecoxib – combretastatin ức chế COX-2 và tubulin, chống dòng ung thư HT29; Nagabhushana Nayak và cộng sự (2016) tổng hợp quinolin – pyrazol (73) có MIC đạt 12,5 µg/mL; chất lai pyrazol – thiadiazol (74) ức chế chọn lọc COX-2.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định: Dù cấu trúc lai KSS-19 đã bước đầu chứng minh tiềm năng của việc kết hợp celecoxib và combretastatin, việc thiết kế một thư viện hoàn chỉnh các dẫn chất lai hóa coxib – combretastatin ở các dạng este, dạng chứa nhóm thế trifluoromethyl và dạng axit carboxylic, đồng thời khảo sát đối chiếu mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) trên cả tác dụng gây độc tế bào và ức chế các chất trung gian gây viêm (NO, PGE2) vẫn chưa được thực hiện đầy đủ. Luận án giải quyết khoảng trống này bằng cách tổng hợp hệ thống 41 hợp chất mới, kiểm tra hoạt tính sinh học đa diện và mô hình hóa tương tác phân tử trên cả hai đích COX-2 và tubulin.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án xây dựng trên nền tảng lý thuyết thiết kế thuốc đa đích (multi-target directed ligands), phối hợp hai cơ chế dược lý:

  1. Cơ chế ức chế trùng hợp vi ống tubulin tại vị trí gắn kết colchicin, phá vỡ mạng lưới thoi phân bào, bắt giữ chu kỳ tế bào và kích hoạt con đường chết theo chương trình qua caspase.
  2. Cơ chế ức chế chọn lọc enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2), ngăn cản sự chuyển đổi axit arachidonic thành prostaglandin PGE2, làm giảm các phản ứng viêm và ức chế các tín hiệu sinh tồn của tế bào ung thư.

Mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) của combretastatin đóng vai trò khung phân tích: vòng A cần duy trì nhóm 3,4,5-trimethoxybenzen để đảm bảo liên kết với tubulin; vòng B có thể biến đổi linh hoạt với các nhóm thế halogen, methoxy, hydroxy hoặc sulfonamid; liên kết đôi cis-stilben (cầu C) dễ bị đồng phân hóa thành dạng trans mất hoạt tính được cố định hóa bằng cách thay thế bởi dị vòng pyrazol năm cạnh của celecoxib.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai chi tiết:

  • Phương pháp tổng hợp hữu cơ: Sử dụng phản ứng ngưng tụ Claisen giữa các dẫn xuất ketone (deoxybenzoin, desoxyanisoin...) với ethyl chlorooxoacetat (hoặc etyl trifluoroacetat) dưới tác dụng của tác nhân kiềm (t-BuOLi hoặc NaH) trong dung môi THF khan, tiếp theo là phản ứng ngưng tụ đóng vòng pyrazol với các dẫn xuất arylhydrazin hydrochlorid trong môi trường cồn khan có xúc tác axit HCl ở nhiệt độ hồi lưu. Dãy axit carboxylic được tổng hợp tiếp tục qua phản ứng thủy phân nhóm chức este bằng NaH trong hệ dung môi THF/MeOH/H2O (tỷ lệ thể tích 3:1:1).
  • Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Silica gel 60 F254 trên tấm nhôm của Merck, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm.
    • Sắc ký cột (CC): Silica gel cỡ hạt 0,063–0,2 mm / 70–230 mesh ASTM của Macherey-Nagel, hệ dung môi rửa giải ethyl acetate : n-hexan.
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Đo trên thiết bị Bruker Avance 500 (CHLB Đức) gồm phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và các phổ tương quan hai chiều HSQC, HMBC.
    • Phổ khối lượng: Thiết bị X500R-QTOF MS của hãng SCIEX để ghi nhận phổ khối ion hóa phun điện ESI-MS và phổ khối lượng phân giải cao HRMS.
  • Phương pháp thử hoạt tính sinh học in vitro:
    • Thử nghiệm gây độc tế bào (cytotoxicity assay): Sử dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) theo quy trình của Monks (1991) để xác định giá trị nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh tế bào (IC50) trên ba dòng tế bào ung thư người: ung thư vú MCF-7, ung thư đại trực tràng HT-29 và ung thư gan HepG2.
    • Thử nghiệm ức chế sản sinh Nitric Oxide (NO): Đánh giá khả năng ức chế sản xuất NO trên đại thực bào RAW 264.7 sau khi kích thích viêm bằng lipopolysaccharide (LPS).
    • Thử nghiệm ức chế sản sinh Prostaglandin E2 (PGE2): Định lượng nồng độ PGE2 trong môi trường nuôi cấy đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS sau 48 giờ xử lý chất thử nghiệm ở nồng độ 20 µM.
    • Thử nghiệm cảm ứng apoptosis: Nhuộm huỳnh quang nhân tế bào bằng thuốc nhuộm Hoechst 33342 để quan sát hiện tượng ngưng tụ và phân mảnh chất nhiễm sắc; phân tích chu kỳ tế bào và tỷ lệ tế bào apoptosis bằng hệ thống Flow cytometry với bộ kit Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis (kết hợp FITC-Annexin V và Propidium Iodide - PI); đo lường mức độ hoạt hóa enzyme caspase-3.
  • Phương pháp mô phỏng gắn kết phân tử (Molecular Docking): Thực hiện tính toán in silico trên hai mô hình cấu trúc tinh thể protein phân giải cao tải từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB): enzyme COX-2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B) nhằm xác định điểm số liên kết năng lượng tự do (kcal/mol) và kiểu tương tác hydro/kỵ nước.

Bảng tổng hợp các hóa chất, dòng tế bào và hệ thiết bị chính được sử dụng trong luận án:

Hạng mục Tên chi tiết / Ký hiệu Đơn vị cung cấp / Xuất xứ
Thiết bị đo phổ NMR Avance 500 (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz) Bruker, CHLB Đức
Thiết bị đo khối phổ X500R-QTOF MS (ESI-MS, HRMS) SCIEX
Hóa chất tổng hợp Deoxybenzoin, Desoxyanisoin, Ethyl chlorooxoacetat, Etyl trifluoroacetat, t-BuOLi, NaH Merck, Sigma Aldrich, Chemleader Biomedical
Dung môi tinh chế THF khan (chưng cất với Na/Benzophenone), Dioxane, EtOAc, Hexan Merck, Xilong Scientific, Trung Quốc
Dòng tế bào ung thư MCF-7 (vú), HT-29 (đại tràng), HepG2 (gan) ATCC / Viện Công nghệ sinh học
Dòng tế bào miễn dịch RAW 264.7 (đại thực bào chuột kích thích bằng LPS) Viện Công nghệ sinh học
Kit và thuốc nhuộm SRB, Hoechst 33342, Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis, Caspase-3 Sigma Aldrich, Invitrogen
Mô hình protein docking COX-2 (PDB ID: 3LN1), Tubulin (PDB ID: 1Z2B) Protein Data Bank (PDB)

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương 1 trình bày tổng quan lý thuyết về hợp chất lai đa đích trong điều trị ung thư. Khởi đầu từ khái niệm hợp chất lai phân tử, tác giả phân tích các hạn chế của liệu pháp hóa trị đơn mục tiêu do tính không đồng nhất của khối u và áp lực kháng thuốc. Chương này hệ thống hóa các nhóm chất lai theo các khung cấu trúc nền: isatin (uracil – isatin 8, isatin – triazol 9), coumarin (coumarin – pyrazolin 11, coumarin – stilben 12), steroid (estradiol – chlorambucil 14, geldanamycin – estradiol 15), pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin (benzothiazol – PBD 17, bisindol – PBD 18) và các nhóm chất khác như quinobenzoxazin, norindenoisoquinolin, benzofuran.

Nội dung trọng tâm của chương tập trung vào cơ chế tác động lên tubulin và các phân tử lai dựa trên chất ức chế tubulin. Tác giả mô tả chi tiết quá trình trùng hợp và phân rã của vi ống, đồng thời phân tích 3 vị trí gắn kết trên tubulin. Combretastatin A-4 (CA4) được phân tích sâu về nguồn gốc từ cây Combretum caffrum, tính chất cấu hình cis-stilben kém bền hơn dạng trans-stilben (nhiệt độ nóng chảy của (E)-stilben là 125°C, trong khi (Z)-stilben là 6°C), và các dẫn chất tan trong nước như CA4P, CA1P đang thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III (fosbretabulin / ZYBRESTAT của Oxigene). Phân tích tương quan cấu trúc - hoạt tính (SAR) chỉ ra rằng:

  • Vòng A: Bắt buộc phải duy trì cụm 3,4,5-trimethoxybenzen; mọi thay đổi lớn về kích thước nhóm ether hay thay thế nhóm 4-methoxy đều làm suy giảm hoạt tính độc tế bào và ức chế tubulin.
  • Vòng B: Có thể mang các nhóm thế halogen, amino, nitro, methoxy hoặc các nhân dị vòng (pyridin, indol, quinolin). Sự đảo ngược nhóm chức tạo isocombretastatin (56) giúp tăng độ tan lên 30 lần.
  • Cầu nối C: Liên kết đôi cis-stilben có thể thay thế bằng các dị vòng năm cạnh như pyrazol, thiazol, triazol, imidazol để cố định cấu dạng hoạt động.

Tiếp đó, tác giả phân tích cơ chế COX-2 trong việc gia tăng sản xuất prostaglandin, thúc đẩy tạo mạch máu, ức chế apoptosis và làm tăng khả năng xâm lấn khối u. Dẫn chất pyrazol celecoxib (65) được phân tích như một phân tử mẫu mực có khả năng ức chế chọn lọc COX-2 và ức chế khối u độc lập với COX-2. Các nghiên cứu tiền lệ về chất lai pyrazol như KSS-19 (72) (Surendra R và cộng sự, 2018), quinolin – pyrazol (73) (Nayak và cộng sự, 2016) và pyrazol – thiadiazol (74) được trích dẫn để củng cố giả thuyết khoa học. Chương 1 khép lại bằng việc xác lập 5 mục tiêu cụ thể của luận án.

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Chương 2 mô tả chi tiết các hóa chất, dung môi, thông số thiết bị phân tích và các quy trình tổng hợp hóa học, tinh chế cũng như thử nghiệm sinh học:

  1. Tổng hợp 20 dẫn chất este coxib – combretastatin (hợp chất 79–98):

    • Giai đoạn 1: Phản ứng giữa ketone ban đầu 76 (1 mmol) với ethyl chlorooxoacetat (1,2 mmol) dưới xúc tác t-BuOLi (3 mmol, 240 mg) trong 5 mL THF khan, đun hồi lưu trong 6 giờ để tạo muối lithium trung gian. Kiểm tra tiến trình bằng sắc ký lớp mỏng và cô loại bỏ dung môi.
    • Giai đoạn 2: Hòa tan muối lithium trong 5 mL EtOH khan, thêm 0,34 mL dung dịch HCl (4 mmol), khuấy ở nhiệt độ phòng 10 phút. Tiếp tục thêm 1 mmol dẫn xuất arylhydrazin hydrochlorid 78 (chứa các nhóm thế -OCH3, -CF3, -CN, -NO2, -SO2NH2), khuấy 10 phút ở nhiệt độ thường rồi đun hồi lưu trong 6 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng được chiết bằng CH2Cl2, làm khan, lọc qua bột celite, cô quay ở 20°C và tinh chế bằng sắc ký cột (silica gel, pha động ethyl acetate : n-hexan).

  2. Tổng hợp hợp chất lai chứa nhóm trifluoromethyl CF3 (hợp chất 102):

    • Phản ứng giữa dẫn xuất ketone 100 (1,0 mmol) với etyl trifluoroacetat 99 (1,2 đương lượng) và NaH (2,5 đương lượng) trong 5 mL THF khan trong 6 giờ. Sau đó thêm cặn phản ứng vào 5 mL EtOH, thêm 1,0 đương lượng axit và 1,0 mmol arylhydrazin hydrochlorid 78 (mang nhóm 4-sulfonamid), đun hồi lưu 6 giờ. Sản phẩm 102 được phân lập tinh khiết qua sắc ký cột.

  3. Tổng hợp 20 dẫn chất axit coxib – combretastatin (hợp chất 103–122):

    • Sản phẩm este tương ứng sau khi phân lập được hòa tan trong hỗn hợp dung môi THF : MeOH : H2O (tỷ lệ thể tích 3:1:1), bổ sung 1,2 đương lượng NaH. Phản ứng thủy phân diễn ra trong 3 giờ ở nhiệt độ thích hợp tạo ra dãy dẫn chất axit carboxylic 103–122.

Bảng tổng hợp vị trí nhóm thế của các dãy chất lai được trình bày trong Chương 2:

STT Dẫn chất este (79–98) Dẫn chất axit (103–122) Nhóm thế R' Nhóm thế R'' Nhóm thế R
1 79 103 H H OCH3
2 80 104 H H CF3
3 81 105 H H CN
4 82 106 H H NO2
5 83 107 H H SO2NH2
6 84 108 OCH3 OCH3 OCH3
7 85 109 OCH3 OCH3 CF3
8 86 110 OCH3 OCH3 CN
9 87 111 OCH3 OCH3 NO2
10 88 112 OCH3 OCH3 SO2NH2
11 89 113 H Br OCH3
12 90 114 H Br CF3
13 91 115 H Br CN
14 92 116 H Br NO2
15 93 117 H Br SO2NH2
16 94 118 H OH SO2NH2
17 95 119 H 2-OH SO2NH2
18 96 120 H F SO2NH2
19 97 121 H Cl SO2NH2
20 98 122 H 2-OCH3 SO2NH2

Ghi chú thêm từ Bảng 2 của luận án: Dẫn chất trifluoromethyl 102 mang các nhóm thế R1 = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OCH3 và R = SO2NH2, đối chiếu với cấu trúc chuẩn của celecoxib (65) có R1 = H, R2 = CH3, R3 = H và R = SO2NH2.

Chương 2 cũng quy định chi tiết quy trình thử độc tính tế bào SRB, định lượng NO bằng thuốc thử Griess, định lượng PGE2 bằng ELISA trên tế bào RAW 264.7 sau xử lý LPS, nhuộm huỳnh quang nhân Hoechst 33342, đo đạc phân tích chu kỳ tế bào và apoptosis bằng Flow cytometry, đo hoạt độ enzyme caspase-3 và giao thức docking phân tử trên Autodock/mô hình phân tử tương thích.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được và các biện giải khoa học tương ứng:

  • Thiết kế và tổng hợp hóa học: Phân tích cấu trúc phân tử lai cho thấy nhân pyrazol đóng vai trò thay thế cầu nối cis-olefin không bền của combretastatin A-4, đồng thời liên kết với nhóm phenyl mang đầu thế sulfonamid (-SO2NH2) hoặc các nhóm hút/đẩy điện tử khác để duy trì ái lực với COX-2. Tác giả đã tổng hợp thành công 41 hợp chất lai, cấu trúc hóa học của toàn bộ các sản phẩm từ 79 đến 122 cùng chất 102 được xác nhận đầy đủ qua phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC và HRMS.
  • Sàng lọc hoạt tính độc tế bào và ức chế NO:
    • Thử nghiệm tác dụng gây độc tế bào của 20 dẫn chất este (79–98) trên ba dòng tế bào HT-29, Hep-G2, MCF-7 và khả năng ức chế NO cho thấy nhiều chất có hoạt tính rõ rệt. Khi so sánh giữa dạng este (79–98) và dạng axit carboxylic (103–122) trên tế bào ung thư vú MCF-7 và ức chế NO, kết quả khẳng định các dẫn chất dạng este có hoạt tính sinh học vượt trội hơn hẳn so với dạng axit tương ứng.
    • Các chất lai thể hiện hoạt tính nổi trội nhất trên dòng tế bào ung thư MCF-7 là hợp chất 82 (dẫn chất este mang nhóm nitro -NO2) và hợp chất 102 (dẫn chất mang nhóm -CF3 và -SO2NH2).
  • Hoạt tính ức chế sản sinh PGE2: Đánh giá mức độ biểu hiện PGE2 trên đại thực bào RAW 264.7 kích thích bằng LPS sau 48 giờ xử lý ở nồng độ 20 µM cho các hợp chất nổi bật gồm 102, 96, 81, 82, 94 và chất đối chứng celecoxib (65). Các hợp chất này đều ức chế mạnh sự sản sinh PGE2, chứng minh khả năng kháng viêm thông qua con đường COX-2.
  • Phân tích chu kỳ tế bào: Xử lý tế bào MCF-7 với các chất 102, 96, 81, 82, 94 ở nồng độ 10 µM và celecoxib (65) ở nồng độ 30 µM. Kết quả phân tích chu kỳ tế bào cho thấy sự thay đổi rõ rệt tỷ lệ phần trăm tế bào ở các pha, ghi nhận sự tích lũy tế bào và bắt giữ chu kỳ tế bào dưới tác động của chất lai.
  • Nghiên cứu cơ chế apoptosis của hai chất dẫn đầu 82 và 102:
    • Nhuộm nhân Hoechst 33342: Hình ảnh huỳnh quang cho thấy sự xuất hiện rõ rệt của hiện tượng ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân tế bào MCF-7, tỷ lệ tế bào bị tổn thương nhân tăng thuận theo nồng độ chất xử lý.
    • Flow cytometry (FITC-Annexin V/PI): Định lượng tỷ lệ tế bào đi vào chu trình chết theo chương trình apoptosis (cả pha sớm và pha muộn) tăng lên rõ rệt so với nhóm đối chứng không xử lý.
    • Hoạt tính caspase-3: Cả hai hợp chất 102 và 82 đều gây tăng sinh mạnh hoạt tính của enzyme caspase-3 trong tế bào MCF-7, khẳng định cơ chế kích hoạt apoptosis phụ thuộc caspase.
  • Mô phỏng gắn kết phân tử (Molecular Docking):
    • Tác giả lựa chọn mô hình protein COX-2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B).
    • Toàn bộ tập hợp hợp chất thiết kế được tính toán điểm kết nối năng lượng tự do liên kết (kcal/mol) trên cả hai mô hình protein.
    • Phân tích tương tác 2D và 3D cho thấy các hợp chất 102 và 82 có khả năng tạo liên kết hydro bền vững với các axit amin chủ chốt tại vị trí gắn kết chọn lọc của COX-2 cũng như tại hốc liên kết colchicin trên dị phân tử tubulin, giải thích cơ sở ái lực đa đích ở mức độ phân tử.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án tự xác định các đóng góp mới về mặt học thuật và thực tiễn như sau:

  • Về mặt lý thuyết và khoa học:
    • Đã chứng minh tính khả thi của chiến lược lai hóa phân tử giữa khung combretastatin A-4 và dẫn chất pyrazol kháng viêm (coxib), tạo ra cấu trúc phân tử có khả năng tương tác đồng thời trên hai đích sinh học là tubulin và COX-2.
    • Làm sáng tỏ mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính (SAR) của dãy chất lai: dạng este và dẫn chất chứa nhóm trifluoromethyl CF3 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm vượt trội so với dạng axit carboxylic; nhóm thế hút điện tử mạnh như -NO2 (chất 82) hoặc sự kết hợp giữa -CF3 và -SO2NH2 (chất 102) đóng vai trò then chốt đối với hoạt tính kháng ung thư.
  • Về mặt thực nghiệm và thực tiễn:
    • Xây dựng quy trình tổng hợp hóa học hiệu quả và đã tổng hợp thành công 41 hợp chất lai coxib – combretastatin mới chưa từng được công bố trong y văn (gồm 20 dẫn chất este 79–98, 1 dẫn chất trifluoromethyl 102 và 20 dẫn chất axit 103–122). Toàn bộ cấu trúc được minh chứng sáng tỏ bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ phân giải cao HRMS.
    • Phát hiện được hai hợp chất dẫn đầu có tiềm năng cao nhất là chất 82 và chất 102, thể hiện hoạt tính độc tế bào mạnh nhất trên dòng ung thư vú MCF-7, đồng thời ức chế mạnh sản sinh chất trung gian gây viêm NO và PGE2 trên đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS.
    • Xác định được cơ chế gây độc tế bào ung thư của hai chất 82 và 102 là thông qua việc bắt giữ chu kỳ tế bào, kích thích ngưng tụ/phân mảnh nhân tế bào và kích nổ con đường apoptosis phụ thuộc vào sự hoạt hóa enzyme caspase-3.
    • Cung cấp dữ liệu tính toán mô phỏng docking phân tử trên hai mô hình cấu trúc tinh thể protein COX-2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B), xác lập cơ sở tương tác không gian và năng lượng liên kết của các phân tử lai.
  • Kiến nghị: Tiếp tục triển khai các nghiên cứu sâu hơn về độc tính bán trường diễn, dược động học in vivo và thử nghiệm hoạt tính kháng u trên mô hình động vật thực nghiệm đối với hai hợp chất tiềm năng 82 và 102.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của luận án: Căn cứ theo phạm vi thực nghiệm được trình bày trong toàn văn, các khảo sát hoạt tính sinh học và cơ chế tác dụng mới dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào nuôi cấy (MCF-7, HT-29, HepG2, RAW 264.7) và mô phỏng in silico thông qua docking phân tử. Luận án chưa tiến hành đánh giá dược động học (hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ - ADME), độ tan sinh học thực tế trong huyết tương cũng như chưa có dữ liệu thử nghiệm in vivo trên động vật mang khối u thực nghiệm.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:
    • Đánh giá hiệu quả ức chế khối u và tính an toàn trên mô hình động vật thí nghiệm (in vivo).
    • Khảo sát các thông số dược động học, độ ổn định trao đổi chất và nghiên cứu cải thiện độ tan trong nước của các chất tiềm năng (ví dụ chuyển hóa sang dạng muối photphat tương tự mô hình CA4P).
    • Tiến hành các thử nghiệm hóa sinh phân lập trực tiếp để đo lường động học ức chế trùng hợp tubulin (tubulin polymerization assay) và ái lực enzyme COX-2 phân lập.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo thiết thực cho nhiều đối tượng trong nghiên cứu học thuật và phát triển dược phẩm:

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa dược, Hóa hữu cơ: Luận án cung cấp các quy trình tổng hợp chi tiết cho hệ dị vòng pyrazol đa thế thông qua phản ứng ngưng tụ Claisen và đóng vòng hydrazin, kèm theo bộ dữ liệu phổ nghiệm chuẩn mực (1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, HRMS) của 41 hợp chất lai mới để đối chiếu cấu trúc.
  • Đối với các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Dược lý và Sinh học ung thư: Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị về phương pháp luận sàng lọc hoạt tính kết hợp: từ thử nghiệm độc tế bào (SRB), đánh giá kháng viêm (NO, PGE2), khảo sát chu kỳ tế bào và apoptosis qua Flow cytometry, caspase-3 đến mô phỏng gắn kết phân tử docking trên nhiều đích protein đồng thời.
  • Đối với các đơn vị định hướng phát triển thuốc mới: Các dữ liệu thực nghiệm về hai hợp chất tiềm năng 82 và 102 đóng vai trò là tiền đề cấu trúc quan trọng phục vụ việc tối ưu hóa phân tử thuốc chống ung thư đa cơ chế trong các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.

Câu hỏi thường gặp

1. Khung cấu trúc phân tử lai trong luận án được kết hợp từ những tiền chất nào?

Các hợp chất lai trong luận án được thiết kế dựa trên sự tích hợp cấu trúc của combretastatin A-4 (một chất ức chế sự trùng hợp vi ống tubulin tự nhiên từ cây Combretum caffrum) và celecoxib (thuốc kháng viêm ức chế chọn lọc COX-2 chứa nhân dị vòng pyrazol). Dị vòng pyrazol được sử dụng để thay thế cầu nối cis-stilben kém bền của combretastatin, kết hợp cùng nhóm trimethoxyaryl và nhân phenyl mang các nhóm thế chức năng khác nhau.

2. Những hợp chất nào trong luận án thể hiện hoạt tính sinh học nổi bật nhất?

Trong tổng số các chất được tổng hợp, hợp chất 82 (dẫn chất este mang nhóm nitro -NO2) và hợp chất 102 (dẫn chất mang nhóm trifluoromethyl -CF3 và nhóm sulfonamid -SO2NH2) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất trên dòng ung thư vú MCF-7, đồng thời có khả năng ức chế mạnh sản sinh chất trung gian gây viêm PGE2 và NO trên đại thực bào RAW 264.7.

3. Quy trình tổng hợp các dẫn chất este coxib – combretastatin (79–98) gồm những phản ứng cơ bản nào?

Quy trình gồm hai giai đoạn phản ứng chính:

  • Giai đoạn 1: Phản ứng ngưng tụ Claisen giữa dẫn xuất ketone 76 với ethyl chlorooxoacetat có mặt chất kiềm t-BuOLi trong dung môi THF khan, đun hồi lưu 6 giờ tạo muối lithium trung gian.
  • Giai đoạn 2: Phản ứng ngưng tụ đóng vòng pyrazol giữa muối lithium với các dẫn xuất phenylhydrazin hydrochlorid 78 khác nhau trong môi trường ethanol khan có mặt xúc tác axit HCl, đun hồi lưu 6 giờ, sau đó phân lập và tinh chế bằng sắc ký cột.

4. Nghiên cứu docking phân tử trong luận án được thực hiện trên những mô hình cấu trúc nào và cho kết quả gì?

Nghiên cứu docking phân tử được thực hiện trên hai mô hình tinh thể protein từ ngân hàng dữ liệu PDB: enzyme cyclooxygenase-2 (PDB ID: 3LN1) và protein vi ống tubulin (PDB ID: 1Z2B). Kết quả cho thấy các chất thiết kế (đặc biệt là 82 và 102) đạt điểm năng lượng liên kết thuận lợi (kcal/mol), tạo được các liên kết hydro và tương tác kỵ nước đặc hiệu tại vị trí hoạt động của COX-2 và hốc gắn kết colchicin trên tubulin.

5. Cơ chế gây chết tế bào ung thư của hai hợp chất dẫn đầu 82 và 102 được chứng minh qua những thử nghiệm nào?

Cơ chế gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trên dòng tế bào MCF-7 được chứng minh thông qua 4 thử nghiệm thực nghiệm:

  1. Thử nghiệm nhuộm huỳnh quang nhân Hoechst 33342 xác nhận hiện tượng ngưng tụ và phân mảnh nhân.
  2. Phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow cytometry ghi nhận sự dừng chu kỳ tế bào.
  3. Phân tích Flow cytometry với bộ kit nhuộm kép FITC-Annexin V/PI xác định tỷ lệ tế bào apoptosis sớm và muộn.
  4. Đo lường hoạt độ enzyme caspase-3 ghi nhận sự gia tăng biểu hiện caspase-3 rõ rệt so với đối chứng.

Kết luận

Luận án "Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib – combretastatin" đã hoàn thành trọn vẹn 5 mục tiêu nghiên cứu đề ra thông qua việc thiết kế, tổng hợp và làm sáng tỏ cấu trúc của 41 dẫn chất lai mới thuộc ba nhóm este, trifluoromethyl và axit carboxylic. Các kết quả đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và phân tích cơ chế tế bào đã phát hiện hai phân tử tiềm năng hàng đầu là hợp chất 82 và 102 có khả năng gây độc mạnh đối với dòng tế bào ung thư vú MCF-7, ức chế các chất trung gian gây viêm NO và PGE2, kích hoạt con đường apoptosis qua caspase-3 và bắt giữ chu kỳ tế bào. Kết hợp với dữ liệu mô phỏng docking phân tử trên COX-2 (PDB ID: 3LN1) và tubulin (PDB ID: 1Z2B), công trình cung cấp các dẫn liệu khoa học thực nghiệm có hệ thống, phục vụ thiết thực cho định hướng phát triển các tác nhân hóa trị liệu ung thư đa đích tác dụng.