Luận án tiến sĩ tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất chứa n hydroxyheptanamid n hydroxypropenamid và n hydroxybenzamid mới hướng ức chế histon deacetylase

Luận án tiến sĩ phân tích tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất chứa n hydroxyheptanamid n, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng góp tri

• Tác giả: Dương Tiến Anh
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Hải Nam
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa Dược
• Đề tài: Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng Ung Thư Của Dẫn Chất Mới Chứa N-Hydroxyheptanamid, N-Hydroxypropenamid Và N-Hydroxybenzamid
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU VỀ HISTON DEACETYLASE
• 1.1. Cơ chế xúc tác của các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV
• 1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym histon deacetylase
• 1.3. Các HDAC nhóm II
• 1.4. Các HDAC nhóm IV
• 1.5. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE
• 1.5.1. Tổng quan các chất ức chế histon deacetylase
• 1.5.2. Các dẫn chất N-hydroxyheptanamid
• 1.5.3. Các dẫn chất N-hydroxypropenamid
• 1.5.4. Các dẫn chất N-hydroxybenzamid
• 1.6. PHẢN ỨNG HECK
• 1.6.1. Đặc điểm của phản ứng Heck. Cơ chế phản ứng Heck
• 1.6.2. Xúc tác palladi và phối tử trong phản ứng Heck
• 1.7. INDIRUBIN VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ
• 1.7.1. Hoạt tính kháng ung thư của indirubin và dẫn chất
• 1.8. ĐỊNH HƯỚNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC
• 1.9. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3. DỰ ĐOÁN TƯƠNG TÁC CỦA CÁC DẪN CHẤT VỚI HDAC2
• 3.1. Tổng hợp hóa học
• 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
• 3.3. Xác định cấu trúc
• 3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 3.4.1. Hoạt tính ức chế histon deacetylase
• 3.4.2. Hoạt tính kháng tế bào ung thư
• 3.4.3. Đánh giá ảnh hưởng chu kỳ tế bào và apoptosis
• 3.4.4. Dự đoán một số thông số dược động học
• 3.5. BÀN LUẬN VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC
• 3.5.1. Phản ứng N-acyl hóa
• 3.5.2. Phản ứng O-alkyl hóa
• 3.5.3. Phản ứng N-alkyl hóa
• 3.5.4. Phản ứng Heck
• 3.5.5. Phản ứng ngưng tụ tạo khung indirubin
• 3.5.6. Phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)-on
• 4. BÀN LUẬN VỀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
• 4.1. Phổ hồng ngoại
• 4.2. Phổ khối lượng
• 4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
• 4.4. BÀN LUẬN VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
• 4.4.1. Hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất I, II, III, IV
• 4.4.2. Hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất V, VI
• 4.4.3. Hoạt tính sinh học của các dãy dẫn chất VII, VIII, IX
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu về tác dụng kháng ung thư

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá tác dụng kháng ung thư của các dẫn chất mới như n-hydroxyheptanamid, n-hydroxypropenamid và n-hydroxybenzamid. Các dẫn chất này được thiết kế nhằm ức chế enzym histon deacetylase (HDAC), một mục tiêu quan trọng trong điều trị ung thư. Việc ức chế HDAC có thể dẫn đến sự gia tăng acetyl hóa histon, từ đó ảnh hưởng đến sự biểu hiện gen và quá trình phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dẫn chất này có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mở ra hướng đi mới trong việc phát triển thuốc điều trị ung thư.

1.1. Cơ chế tác động của các dẫn chất

Các dẫn chất n-hydroxyheptanamid, n-hydroxypropenamid và n-hydroxybenzamid hoạt động thông qua cơ chế ức chế HDAC, làm thay đổi cấu trúc và chức năng của nucleosome. Sự ức chế này dẫn đến sự gia tăng biểu hiện của các gen ức chế khối u và giảm biểu hiện của các gen gây ung thư. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các dẫn chất này có thể làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư thông qua việc kích thích apoptosis và ức chế chu kỳ tế bào. Điều này cho thấy tiềm năng của các dẫn chất này trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua các phương pháp hóa học và sinh học để tổng hợp và đánh giá hoạt tính của các dẫn chất. Các phương pháp bao gồm tổng hợp hóa học, kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học. Các thử nghiệm được thực hiện trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau để xác định hiệu quả kháng ung thư của các dẫn chất. Kết quả cho thấy rằng các dẫn chất này có khả năng ức chế HDAC và có tác dụng kháng tế bào ung thư rõ rệt, với giá trị IC50 thấp, cho thấy tính hiệu quả cao trong việc điều trị ung thư.

2.1. Đánh giá hoạt tính sinh học

Hoạt tính sinh học của các dẫn chất được đánh giá thông qua các thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy rằng các dẫn chất mới có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, với các chỉ số như IC50 cho thấy nồng độ cần thiết để ức chế 50% sự phát triển của tế bào. Các thử nghiệm cũng chỉ ra rằng các dẫn chất này có thể gây ra apoptosis, một quá trình quan trọng trong việc loại bỏ tế bào ung thư. Điều này chứng tỏ rằng các dẫn chất này không chỉ có tác dụng ức chế HDAC mà còn có khả năng tác động trực tiếp đến sự sống còn của tế bào ung thư.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng các dẫn chất n-hydroxyheptanamid, n-hydroxypropenamid và n-hydroxybenzamid có tác dụng kháng ung thư mạnh mẽ. Các dẫn chất này không chỉ ức chế HDAC mà còn làm giảm sự phát triển của tế bào ung thư thông qua các cơ chế sinh học phức tạp. Việc phát hiện ra các dẫn chất này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả hơn. Nghiên cứu cũng nhấn mạnh tầm quan trọng của việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các dẫn chất mới nhằm cải thiện hiệu quả điều trị ung thư.

3.1. Ứng dụng thực tiễn

Các dẫn chất mới này có thể được phát triển thành các loại thuốc điều trị ung thư trong tương lai. Việc ức chế HDAC đã được chứng minh là một chiến lược hiệu quả trong điều trị ung thư, và các dẫn chất này có thể cung cấp một lựa chọn mới cho các bệnh nhân. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng mở ra cơ hội cho việc phát triển các liệu pháp kết hợp, sử dụng các dẫn chất này cùng với các phương pháp điều trị hiện có để tăng cường hiệu quả điều trị. Điều này có thể giúp cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân ung thư và giảm thiểu tác dụng phụ của các liệu pháp điều trị hiện tại.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Công trình "Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng ung thư của một số dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid mới hướng ức chế histon deacetylase" là luận án tiến sĩ dược học, chuyên ngành Hóa dược (mã số: 9720203), do nghiên cứu sinh Dương Tiến Anh thực hiện tại Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của GS. Nguyễn Hải Nam, bảo vệ năm 2021. Đề tài được thực hiện với sự tài trợ của Quỹ Đổi mới sáng tạo Vingroup (VINIF) thuộc Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn (VinBigdata) và có sự phối hợp thực nghiệm từ Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội cùng Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk (Hàn Quốc).

Về tính cấp thiết, ung thư là bệnh lý có tỷ lệ tử vong cao. Các thuốc hóa trị liệu cổ điển (như doxorubicin, 5-fluorouracil, busulfan, methotrexat) thường gây độc tính cao trên các tế bào lành. Sự phát triển của sinh học phân tử đã chuyển hướng nghiên cứu sang các thuốc tác động vào các đích phân tử đặc hiệu (như protein kinase, Bcl-2, HAT, HDAC) nhằm tăng hiệu quả và giảm độc tính. Trong đó, histon deacetylase (HDAC) là đích tác dụng nhận được nhiều quan tâm vì sự huy động quá mức của các enzym này gây sai lệch phiên mã gen, kích thích tế bào ung thư tăng sinh.

Khoảng trống nghiên cứu được tác giả xác định xuất phát từ thực trạng các chất ức chế HDAC (HDACi) nhóm acid hydroxamic. Dù Vorinostat (SAHA, dẫn chất N-hydroxyheptanamid) đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép năm 2006 để điều trị u lympho tế bào T ở da (CTCL), tiếp sau đó là Belinostat và Panobinostat (dẫn chất N-hydroxypropenamid), nhưng Vorinostat là chất ức chế không chọn lọc (pan-HDACi), gây nhiều tác dụng phụ lâm sàng như giảm tiểu cầu, mất nước, chán ăn và rối loạn nhịp tim. Các dẫn chất N-hydroxybenzamid khác (như givinostat, abexinostat, tubastatin A, nexturastat A) đang ở các pha thử nghiệm lâm sàng khác nhau. Do đó, nhu cầu thiết kế các dẫn chất mới mang nhóm nhận diện bề mặt dị vòng nhằm thăm dò hoạt tính ức chế enzym và cải thiện tính chọn lọc là vấn đề thời sự của hóa dược ung thư.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 nội dung chính:

1. Tổng hợp được khoảng từ 40 đến 50 dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid mới hướng ức chế histon deacetylase.
2. Đánh giá được tác dụng ức chế HDAC và tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Các dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid gắn các dị vòng (isatin, indirubin, quinazolin-4(3H)-on); enzym histon deacetylase (HDAC tổng số, HDAC2 và HDAC6); 3 dòng tế bào ung thư người thử nghiệm in vitro.
• Phạm vi không gian: Thực nghiệm tổng hợp hóa học và phân tích cấu trúc được triển khai tại Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội; các thử nghiệm sinh học in vitro được thực hiện tại Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk (Hàn Quốc).
• Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành thực nghiệm vào tháng 10 năm 2020 và bảo vệ chính thức trong năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan, tác giả hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cấu trúc enzym HDAC và các chất ức chế:

• Về mô hình dược lực học (pharmacophore): Finnin và cộng sự (1999) xác định cấu trúc tinh thể của protein tương tự HDAC (HDLP) phức hợp với TSA và SAHA, thiết lập mô hình pharmacophore 3 vùng gồm: vùng gắn kẽm (Zinc Binding Group - ZBG), vùng cầu nối (Linker) và vùng nhận diện bề mặt (Cap-group). Sau đó, mô hình được mở rộng thêm nhóm liên kết (Connecting Unit - CU) tương tác với aspartat ở lối vào kênh enzym.
• Về cơ chế xúc tác: Gantt và cộng sự (2016), Vanommeslaeghe và cộng sự (2005), Corminboeuf và cộng sự (2006) làm rõ vai trò của ion Zn2+ dưới đáy túi xúc tác cùng hai cặp acid amin bảo tồn His143-Asp183 và His142-Asp176 (đánh số theo HDAC8) cùng Tyr306 trong việc ổn định trạng thái chuyển tiếp tứ diện của phản ứng thủy phân liên kết amid.
• Về chiều dài và cấu trúc cầu nối: Andrianov và cộng sự (TopoTarget) chứng minh cầu nối hydrocarbon 5-6 carbon mang lại hoạt tính tối ưu; Di Micco (2013) chỉ ra cầu nối chứa vòng thơm giúp tăng cường tương tác π-π với các gốc phenylalanin trên thành kênh enzym.
• Về biến đổi cấu trúc nhóm CU và Cap-group: C. Charrier và cộng sự khảo sát nhóm CU dạng indanon; A. Mai và cộng sự sử dụng hợp phần uracil; Chen và cộng sự thay thế amid bằng vòng triazol thông qua phản ứng Click và phối hợp với các hệ đa vòng thơm tương tác với Tyr91.
• Về cấu trúc các isoform HDAC: Zhou và cộng sự (2008) chỉ ra HDAC1 gắn với ion K+ trong khi HDAC2 gắn với Ca2+; Vannini và cộng sự (2004, 2007) xác định "túi chân" (foot pocket) tại HDAC8 với acid amin gác cổng Trp141 và Lys33 nhô vào lòng kênh, phân biệt với Leu139 (HDAC1), Leu144 (HDAC2) và Leu133 (HDAC3); cấu trúc vùng xúc tác CD1 và CD2 của HDAC6 được làm rõ với đặc điểm kênh nông và rộng hơn, mở ra hướng phát triển các chất ức chế chọn lọc cồng kềnh như Nexturastat A, Tubastatin A và Ricolinostat (ACY-1215).
• Về hóa học và dược lý: Gediya và cộng sự tổng hợp SAHA qua 2 giai đoạn đạt hiệu suất 80%; Remiszewski và cộng sự tổng hợp Pyroxamid (hiệu suất 56%), chứng minh tác dụng ức chế HDAC1 và ức chế khối u ghép ngoại lai CWR22 trên chuột; Steven và cộng sự tổng hợp ACY-1215 qua phản ứng Ullmann (hiệu suất 51%); Jinlin Cao và cộng sự (2018) chứng minh ACY-1215 ức chế ung thư biểu mô tế bào vảy thực quản (ESCC) qua con đường miR-30d/PI3K/AKT/mTOR và ERK; khung indirubin từ bài thuốc cổ truyền Đương quy Long hội hoàn (Danggui Longhui Wan gồm 11 vị dược liệu) được ghi nhận có hoạt tính kháng u qua ức chế CDK và GSK-3β.

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết là: Tập trung phát triển các phân tử lai hóa mới kết hợp ZBG là acid hydroxamic với 3 dạng cầu nối đại diện (mạch thẳng no heptanamid, mạch không no propenamid và vòng thơm benzamid), đồng thời đưa các khung dị vòng cồng kềnh như quinazolin-4(3H)-on, isatin và indirubin vào vùng nhận diện bề mặt (Cap-group). Nghiên cứu giải quyết bài toán tổng hợp hóa học các dẫn chất này và đánh giá thực nghiệm tính chọn lọc trên hai enzym đại diện là HDAC2 (nhóm I) và HDAC6 (nhóm IIb).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên mô hình pharmacophore mở rộng bốn thành phần của chất ức chế HDAC:

1. Nhóm gắn kẽm (ZBG): Tạo phức chelat hai càng hoặc đơn càng với ion Zn2+ tại đáy trung tâm hoạt động.
2. Cầu nối (Linker): Chiều dài 5-6 carbon hoặc vòng thơm, chiếm giữ kênh kỵ nước hình ống dài khoảng 11 Å.
3. Nhóm liên kết (CU): Hợp phần lai hóa sp2 (như carbonyl, amid) tạo liên kết hydro hoặc tương tác với acid amin ở miệng kênh.
4. Nhóm nhận diện bề mặt (Cap-group): Hệ dị vòng thơm kỵ nước tương tác với bề mặt ngoài của protein.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai đồng bộ qua ba nhóm kỹ thuật:

• Phương pháp in silico: Mô phỏng docking phân tử trên phần mềm chuyên dụng sử dụng cấu trúc tinh thể HDAC2 và HDAC6 từ Ngân hàng Dữ liệu Protein (PDB); dự đoán các thông số dược động học và an toàn ADMET (diện tích bề mặt phân cực TPSA, tỷ lệ liên kết protein PB, thể tích phân bố Vd, khả năng qua hàng rào máu não BBB).
• Phương pháp thực nghiệm hóa học:
  • Tổng hợp hữu cơ đa bước áp dụng phản ứng N-acyl hóa với xúc tác nucleophil 4-dimethylaminopyridin (DMAP); phản ứng alkyl hóa (O-alkyl hóa phenol, N-alkyl hóa isatin và quinazolin-4(3H)-on); phản ứng ngưng tụ Niementowski tạo khung quinazolin-4(3H)-on; phản ứng ngưng tụ tạo khung indirubin; phản ứng ghép cặp Heck tạo liên kết C=C có xúc tác hệ palladi Pd(0)/Pd(II); phản ứng hydroxamic hóa este/acid carboxylic bằng hydroxylamin hydroclorid trong môi trường kiềm KOH/MeOH.
  • Tinh chế và kiểm tra độ tinh khiết: Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn silica gel, đo nhiệt độ nóng chảy (tnc).
  • Phân tích cấu trúc: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và hai chiều (HSQC, HMBC) để xác định độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) và hằng số tương tác J (Hz).
• Phương pháp đánh giá sinh học in vitro:
  • Định lượng tác dụng ức chế enzym HDAC tổng số, HDAC2 và HDAC6 bằng phương pháp huỳnh quang vi đĩa, tính toán nồng độ ức chế 50% (IC50).
  • Đánh giá độc tính tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư người (xác định IC50 hoặc GI50).
  • Phân tích chu kỳ tế bào và tỷ lệ chết theo chương trình (apoptosis) bằng phương pháp đo dòng tế bào chảy (flow cytometry) kết hợp nhuộm huỳnh quang kép Annexin V-FITC/Propidium Iodid (PI) ở hai nồng độ thử nghiệm 1 µM và 10 µM.

Nguồn tư liệu, hóa chất và thiết bị: Sử dụng các hóa chất, dung môi tổng hợp theo Bảng 2.1 của luận án; các kit thử nghiệm enzym theo Bảng 2.2; phổ NMR đo trên máy đo cộng hưởng từ hạt nhân trường cao; phổ MS đo trên hệ thống khối phổ phân giải cao.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Giới thiệu về histon deacetylase

Nội dung chương 1 hệ thống hóa cơ sở sinh học và hóa dược của enzym HDAC:

• Phân loại 18 enzym HDAC ở người thành 4 nhóm: Nhóm I (HDAC1, 2, 3, 8 phụ thuộc kẽm, nằm ở nhân; là lõi xúc tác của các phức hợp Sin3, NuRD, CoREST, SMRT, N-CoR, MiDAC, SHIP); Nhóm IIa (HDAC4, 5, 7, 9 có hoạt tính deacetylase yếu do thay đổi tyrosin thành histidin, tạo khoang dưới lower-pocket); Nhóm IIb (HDAC6, HDAC10 nằm ở tế bào chất; HDAC6 có hai vùng xúc tác CD1 và CD2 cùng vùng ZnF-UBP; HDAC10 là polyamin deacetylase mang acid amin gác cổng Glu274); Nhóm III (Sirtuin 1-7 phụ thuộc NAD+); Nhóm IV (HDAC11 có chiều dài ngắn nhất gồm 347 acid amin, chuyên biệt deacetyl hóa acid béo chuỗi dài).
• Cơ chế xúc tác của HDAC phụ thuộc Zn2+: Quá trình tấn công ái nhân của phân tử nước phối trí kẽm vào nhóm carbonyl của cơ chất, tạo trung gian tứ diện được phối trí bởi ion Zn2+ và Tyr306; vai trò của cặp His-Asp trong vận chuyển proton và giải phóng acid acetic qua khoang phụ.
• Cơ chế tác dụng sinh học của các chất ức chế HDAC:
  • Bắt giữ chu kỳ tế bào: Tăng biểu hiện gen CDKN1A (p21), ức chế phức hợp cyclin-CDK, gây dừng chu kỳ tế bào ở pha G1 hoặc G2/M; thoái hóa kinase Aurora A và B; tác động chức năng protein tâm động (BubR1, CENP-E).
  • Thay đổi cấu trúc chromatin: Gây hyperacetylation histon, nới lỏng chất nhiễm sắc, làm biến đổi các protein cấu trúc (SMC, HP1, DNMT1).
  • Tác động cơ chế sửa chữa ADN: Ức chế RAD51, tích lũy đứt gãy mạch kép ADN (DSB).
  • Kiểm soát chất lượng protein: HDAC6 phối hợp motor protein dynein gom tụ protein sai hỏng gắn chuỗi polyubiquitin K63 về aggresome tại MTOC; SAHA gây tự thực bào (autophagy) dẫn đến apoptosis.
  • Thúc đẩy apoptosis: Hoạt hóa cả con đường nội sinh ty thể (giải phóng cytochrom C, SMAC, hoạt hóa caspase-3, 6, 7; giảm Bcl-2, Bcl-XL, XIAP; tăng Bim) và con đường thụ thể gây chết ngoại sinh (TRAIL, FASL).
  • Ức chế tạo mạch và chống di căn: Giảm HIF-1α, VEGF, eNOS; điều hòa tăng gen ức chế di căn (KAI1, RhoB, RECK, TIMP-1) và điều hòa giảm MMP.
• Phân loại các nhóm HDACi theo cấu trúc ZBG và tổng quan các chất đã lưu hành (Vorinostat, Romidepsin, Belinostat, Panobinostat, Chidamide) hoặc đang thử nghiệm lâm sàng (Pracinostat, Givinostat, Mocetinostat, Entinostat, Abexinostat). Điểm luận chi tiết phản ứng Heck dựa trên chu trình Pd(0)/Pd(II) và tiềm năng kháng ung thư của khung indirubin.

Chương 2. Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết điều kiện thực nghiệm:

• Nguyên liệu, hóa chất: Liệt kê đầy đủ các tiền chất, dung môi, tác nhân xúc tác (Bảng 2.1) như isatin, phenylendiamin, acid suberic monomethyl este, methyl acrylat, Pd(OAc)2, PPh3, DMAP, hydroxylamin hydroclorid.
• Thiết bị nghiên cứu: Máy đo điểm nóng chảy Buchi, máy quang phổ hồng ngoại FTIR, hệ thống phổ khối lượng MS, máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC), máy đo huỳnh quang đa giếng, hệ thống đo dòng tế bào chảy (flow cytometer).
• Nội dung nghiên cứu gồm 3 phần:
  1. Thiết kế và dự đoán docking phân tử với HDAC2 và HDAC6; dự đoán thông số ADMET.
  2. Thực hiện tổng hợp hóa học 9 dãy dẫn chất; tinh chế, xác định nhiệt độ nóng chảy và hằng số Rf; phân tích cấu trúc hóa học bằng IR, MS, NMR.
  3. Đánh giá tác dụng sinh học in vitro gồm ức chế enzym HDAC tổng số, HDAC2, HDAC6 (theo tỷ lệ thành phần dung dịch Bảng 2.2); độc tính tế bào trên 3 dòng ung thư; đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ tế bào và apoptosis.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được:

• Kết quả docking sơ bộ trên HDAC2 (Bảng 3.1): Cung cấp các giá trị năng lượng liên kết dự đoán của các dẫn chất thiết kế với trung tâm hoạt động HDAC2.
• Kết quả tổng hợp hóa học: Xây dựng thành công quy trình và tổng hợp 9 dãy dẫn chất (Sơ đồ 3.1 đến 3.9) thuộc 3 nhóm cấu trúc N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid:
  • Dãy I, II, III, IV: Các dẫn chất chứa khung quinazolin-4(3H)-on và các dị vòng liên quan (ký hiệu 4a-e, 6a-e, 10a-e, 12a-e).
  • Dãy V và Dãy VI: Các dẫn chất chứa khung isatin và dẫn chất N-hydroxypropenamid/benzamid (gồm các chất 22a-m).
  • Dãy VII, VIII, IX: Các dẫn chất lai ghép khung indirubin (gồm các chất 26a-g, 29a, 32a).
• Độ tinh khiết và hằng số vật lý (Bảng 3.2): Báo cáo đầy đủ giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (tnc) của tất cả các chất tổng hợp.
• Dữ liệu cấu trúc: Toàn bộ các dẫn chất được khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR và các phổ tương tác 2D-NMR (HSQC, HMBC).
• Kết quả hoạt tính sinh học (Bảng 3.3):
  • Số liệu IC50 ức chế HDAC tổng số và IC50 trên 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm của các dẫn chất.
  • Phân tích chu kỳ tế bào và apoptosis: Dữ liệu đo dòng tế bào chảy của các chất tiêu biểu 26a, 29a và 32a ở hai nồng độ 1 µM và 10 µM cho thấy sự tích lũy tế bào tại pha G1 hoặc G2/M và gia tăng tỷ lệ tế bào apoptotic.

Chương 4. Bàn luận

Chương 4 tập trung biện giải các phát hiện thực nghiệm:

• Bàn luận về tổng hợp hóa học:
  • Phân tích cơ chế phản ứng N-acyl hóa có xúc tác DMAP (Sơ đồ 4.1), vai trò của DMAP trong việc tạo phức trung gian acylpyridinium hoạt hóa.
  • Phân tích cơ chế phản ứng hydroxamic hóa (Sơ đồ 4.2) chuyển hóa este/acid thành acid hydroxamic trong môi trường kiềm.
  • Cơ chế phản ứng O-alkyl hóa phenol (Sơ đồ 4.3) và N-alkyl hóa các dị vòng isatin, quinazolin-4(3H)-on (Sơ đồ 4.4) sử dụng base K2CO3 trong dung môi phân cực phi proton DMF.
  • Cơ chế chu trình xúc tác phản ứng Heck (Sơ đồ 4.5) gồm các giai đoạn: khử Pd(II) về Pd(0), cộng oxy hóa, phối trí và chèn alken, tách loại beta-hydrid, và hoàn nguyên xúc tác Pd(0).
  • Cơ chế phản ứng ngưng tụ aldol tạo khung indirubin (Sơ đồ 4.6) và phản ứng Niementowski tạo khung quinazolin-4(3H)-on (Sơ đồ 4.7).
• Bàn luận về khẳng định cấu trúc: Biện giải các dải hấp thụ hồng ngoại đặc trưng (dao động hóa trị của C=O amid, nhóm hydroxamic NH-OH); phân tích pic ion phân tử trên phổ khối lượng MS; phân tích độ dịch chuyển hóa học δ, độ bội và hằng số tương tác J của các tín hiệu proton và carbon trên phổ 1H-NMR, 13C-NMR; đối chiếu các tương tác qua một liên kết trên phổ HSQC và tương tác xa qua 2-3 liên kết trên phổ HMBC để xác định vị trí thế trên khung dị vòng.
• Bàn luận về hoạt tính sinh học và mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR):
  • Dãy I, II, III, IV: Phân tích số liệu ức chế HDAC và độc tính tế bào trên 3 dòng ung thư (Bảng 4.1); kết hợp mô phỏng docking các chất 4a-e, 6a-e, 10a-e, 12a-e vào HDAC2 (Hình 4.4).
  • Dãy V, VI: Đánh giá số liệu ức chế HDAC và độc tính tế bào (Bảng 4.2). Đánh giá tính ức chế chọn lọc HDAC6 của dãy VI (22a-m) (Bảng 4.3). Kết quả docking các chất 22a-m vào HDAC6 (Bảng 4.4, Hình 4.5, 4.6) chỉ ra sự tương quan giữa điểm số docking và giá trị IC50 thực nghiệm (Hình 4.7), so sánh với Vorinostat và Belinostat.
  • Dãy VII, VIII, IX: Bảng 4.5 thể hiện hoạt tính ức chế HDAC và độc tính tế bào; Bảng 4.5bis thể hiện tác dụng ức chế HDAC2 và HDAC6 của các dẫn chất dãy VII (26a-g). Phân tích năng lượng liên kết docking của các chất 26a-g vào HDAC2 và HDAC6 (Bảng 4.5, Hình 4.13, 4.14) cho thấy các chất 26a, 26c, 26e liên kết tốt với trung tâm hoạt động của cả hai enzym nhưng thể hiện ưu thế ức chế trên HDAC6.
  • Đánh giá tác động tế bào: Các chất 26a, 29a, 32a ở nồng độ 1 µM và 10 µM làm biến đổi hình thái tế bào, bắt giữ chu kỳ tế bào và kích hoạt apoptosis phụ thuộc nồng độ (Hình 4.8 - 4.12).
  • Dự đoán ADMET: Phân tích các thông số hấp thu, phân bố, diện tích TPSA, gắn kết protein huyết tương và khả năng qua hàng rào máu não của các chất thử nghiệm (Bảng 4.6).

Bảng tổng hợp các dãy dẫn chất và nội dung đánh giá thực nghiệm trong luận án

Dãy dẫn chất	Khung cấu trúc đặc trưng	Hợp phần cầu nối (Linker)	Thực nghiệm cấu trúc	Đánh giá sinh học in vitro	Mô phỏng in silico
Dãy I, II, III, IV (4a-e, 6a-e, 10a-e, 12a-e)	Quinazolin-4(3H)-on và các dị vòng liên quan	Heptanamid, propenamid, benzamid	TLC, tnc, IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR	Ức chế HDAC tổng số, độc tính trên 3 dòng tế bào ung thư	Docking trên HDAC2 (Bảng 3.1, Hình 4.4)
Dãy V, VI (22a-m)	Khung isatin	Propenamid, benzamid	TLC, tnc, IR, MS, NMR, HSQC, HMBC	Ức chế HDAC, ức chế chọn lọc HDAC6, độc tính tế bào	Docking trên HDAC6 (Bảng 4.4, Hình 4.5-4.7)
Dãy VII, VIII, IX (26a-g, 29a, 32a)	Khung indirubin	Heptanamid, propenamid, benzamid	TLC, tnc, IR, MS, 1D và 2D-NMR	Ức chế HDAC2, HDAC6, độc tính tế bào, chu kỳ tế bào, apoptosis	Docking HDAC2/HDAC6 (Bảng 4.5, Hình 4.13-4.14), ADMET

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về lý luận và khoa học:

• Xây dựng hệ thống dẫn liệu thực nghiệm về mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) của 3 nhóm dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid khi kết hợp với các nhóm nhận diện bề mặt dị vòng mới (quinazolin-4(3H)-on, isatin, indirubin).
• Làm sáng tỏ vai trò của cấu trúc cầu nối đối với ái lực và tính chọn lọc enzym: Cầu nối propenamid và benzamid kết hợp nhóm nhận diện bề mặt cồng kềnh (khung indirubin, isatin thế) cho thấy sự tương thích về không gian với kênh xúc tác nông và rộng của HDAC6, giải thích tính ức chế chọn lọc HDAC6 so với HDAC2.
• Chứng minh cơ chế tác động ở mức phân tử qua docking, xác định mối tương quan giữa điểm số docking tính toán và giá trị thực nghiệm IC50.

Các đóng góp mới về thực tiễn:

• Thiết kế và tổng hợp thành công 9 dãy dẫn chất mới với số lượng chất đạt mục tiêu đề ra (từ 40 đến 50 chất), cung cấp đầy đủ hằng số vật lý (Rf, tnc) và thông số phổ (IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC).
• Phát hiện được một số dẫn chất có hoạt tính ức chế HDAC mạnh và chọn lọc trên HDAC6 (như dãy VI chất 22a-m và dãy VII chất 26a-g), đồng thời có tác dụng ức chế mạnh sự tăng sinh của 3 dòng tế bào ung thư người thử nghiệm in vitro.
• Chứng minh thực nghiệm các dẫn chất tiêu biểu (26a, 29a, 32a) có khả năng làm ngừng chu kỳ tế bào tại nồng độ 1 µM và 10 µM, gây biến đổi hình thái và kích hoạt quá trình chết tế bào ung thư theo chương trình (apoptosis).

Kiến nghị của tác giả:

• Tiếp tục lựa chọn các dẫn chất có hoạt tính in vitro và tính chọn lọc HDAC6 cao nhất để đánh giá tác dụng kháng khối u in vivo trên động vật thí nghiệm.
• Nghiên cứu sâu hơn về các thông số sinh dược học thực nghiệm để đối chiếu với kết quả dự đoán ADMET in silico.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Các đánh giá tác dụng sinh học mới dừng lại ở mức độ in vitro (trên enzym HDAC tinh khiết và 3 dòng tế bào ung thư); chưa triển khai đánh giá hiệu lực ức chế khối u trên mô hình động vật sống (như mô hình chuột mang khối u ghép ngoại lai xenograft).
• Các chỉ số dược động học, tính thấm và độ an toàn (ADMET) mới dừng lại ở kết quả dự đoán bằng mô hình tính toán in silico, chưa có dữ liệu thực nghiệm in vitro/in vivo về sinh khả dụng, chuyển hóa qua microsom gan hay độc tính cấp.
• Phạm vi sàng lọc chọn lọc isoform enzym mới tập trung khảo sát trên HDAC2 và HDAC6, chưa mở rộng đánh giá trên toàn bộ 11 isoform HDAC phụ thuộc kẽm.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư in vivo trên mô hình chuột suy giảm miễn dịch mang khối u ghép dị loài đối với các dẫn chất tiềm năng nhất (như 26a, 29a, 32a).
• Đánh giá thực nghiệm các thông số dược động học (độ tan, độ bền huyết tương, độ thanh thải, liên kết protein) và thử nghiệm độc tính cấp trên động vật.
• Mở rộng thử nghiệm ức chế trên các isoform HDAC khác thuộc nhóm I (HDAC1, HDAC3, HDAC8) và nhóm IIa để thiết lập đầy đủ phổ ức chế của các dẫn chất.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên môn cho các đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, giảng viên chuyên ngành Hóa dược và Hóa học hữu cơ: Tham khảo các quy trình tổng hợp hóa học dị vòng đa bước, quy trình thực hiện phản ứng Heck xúc tác palladi, phản ứng Niementowski và phản ứng ngưng tụ aldol tạo khung indirubin.
• Các nhà nghiên cứu sàng lọc thuốc ung thư trúng đích: Tham khảo phương pháp kết hợp mô phỏng docking phân tử trên HDAC2/HDAC6 với định lượng enzym in vitro và phân tích tế bào (chu kỳ tế bào, apoptosis qua đo dòng tế bào chảy).
• Phần có giá trị tham khảo cao:
  • Hệ thống dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR (HSQC, HMBC) của các dẫn chất acid hydroxamic mang khung dị vòng phức tạp.
  • Phân tích mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) và các tương tác lập thể tại kênh xúc tác của HDAC2 và HDAC6.

Câu hỏi thường gặp

1. Ba nhóm khung cấu trúc chính được thiết kế trong luận án là gì?
   Luận án tập trung vào 3 nhóm cấu trúc gồm dẫn chất N-hydroxyheptanamid (cầu nối mạch no thẳng 6 carbon), dẫn chất N-hydroxypropenamid (cầu nối mạch không no chứa liên kết đôi liên hợp) và dẫn chất N-hydroxybenzamid (cầu nối mang vòng benzen), tất cả đều mang nhóm gắn kẽm (ZBG) là acid hydroxamic và nhóm nhận diện bề mặt dị vòng (quinazolin-4(3H)-on, isatin, indirubin).

2. Vì sao luận án lựa chọn HDAC2 và HDAC6 để khảo sát tính chọn lọc?
   HDAC2 đại diện cho HDAC nhóm I (nằm trong nhân, liên quan trực tiếp đến sự sống còn tế bào và biến đổi biểu sinh), trong khi HDAC6 đại diện cho HDAC nhóm IIb (nằm ở bào tương, điều hòa vi ống α-tubulin, cortactin và xử lý protein sai hỏng qua aggresome). Kênh xúc tác của HDAC6 nông và rộng hơn HDAC2, phù hợp để đánh giá khả năng ức chế chọn lọc của các chất mang nhóm nhận diện bề mặt cồng kềnh.

3. Phản ứng Heck được sử dụng trong luận án nhằm mục đích gì và có cơ chế như thế nào?
   Phản ứng Heck được sử dụng để tạo liên kết C=C giữa aryl halogenid và methyl acrylat nhằm tạo dựng cầu nối propenamid. Quá trình diễn ra theo chu trình xúc tác Pd(0)/Pd(II) gồm: khử muối Pd(II) về Pd(0) hoạt động, cộng oxy hóa aryl halogenid vào Pd(0), phối trí và chèn alken vào liên kết Pd-C, tách loại beta-hydrid tạo sản phẩm liên hợp và tái sinh xúc tác Pd(0) nhờ base.

4. Các dẫn chất tiêu biểu như 26a, 29a và 32a thể hiện tác động sinh học nào trên tế bào ung thư?
   Ngoài tác dụng ức chế enzym HDAC, các dẫn chất 26a, 29a và 32a ở nồng độ 1 µM và 10 µM làm thay đổi hình thái tế bào ung thư, gây tích lũy và bắt giữ chu kỳ tế bào tại pha G1 hoặc G2/M, đồng thời thúc đẩy rõ rệt tế bào đi vào quá trình chết theo chương trình (apoptosis) được định lượng qua nhuộm kép Annexin V-FITC/PI trên flow cytometry.

5. Vai trò của DMAP trong phản ứng N-acyl hóa của luận án là gì?
   DMAP (4-dimethylaminopyridin) đóng vai trò chất xúc tác ái nhân. DMAP tấn công vào benzoyl clorid tạo thành muối acylpyridinium trung gian có tính hoạt hóa cao, làm tăng tốc độ phản ứng acyl hóa với các amin thơm có tính ái nhân yếu.

Kết luận

Luận án của nghiên cứu sinh Dương Tiến Anh đã giải quyết hoàn chỉnh hai mục tiêu nghiên cứu thông qua việc thiết kế, tổng hợp 9 dãy dẫn chất N-hydroxyheptanamid, N-hydroxypropenamid và N-hydroxybenzamid mới gắn các khung dị vòng quinazolin-4(3H)-on, isatin và indirubin. Cấu trúc hóa học và độ tinh khiết của các hợp chất được chứng minh bằng các phương pháp hóa lý và phổ nghiệm hiện đại (IR, MS, 1D và 2D-NMR). Kết quả đánh giá sinh học in vitro đã phát hiện nhiều dẫn chất có hoạt tính ức chế mạnh trên enzym HDAC tổng số, HDAC2, HDAC6 và thể hiện độc tính tế bào cao trên 3 dòng tế bào ung thư người, trong đó các dẫn chất tiêu biểu (như 26a, 29a, 32a) thể hiện cơ chế bắt giữ chu kỳ tế bào và kích hoạt apoptosis. Công trình cung cấp các dẫn liệu khoa học về mối liên quan cấu trúc - tác dụng định hướng phát triển các chất ức chế HDAC chọn lọc trong hóa dược điều trị ung thư.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1. Giới thiệu về histon deacetylase Quá trình acetyl hóa/deacetyl hóa nhờ các enzym của histon được quan sát lần đầu tiên vào những năm 1960. Trong cùng khoảng thời gian này, vai trò của nhiễm sắc thể (NST) trong điều hòa gen, mối quan hệ giữa sự thay đổi trong quá trình acetyl hóa histon và quá trình truyền thông tin di truyền trong ADN bắt đầu được phát hiện [202]. Ngày nay, người ta đã chứng minh rằng quá trình acetyl hóa thuận nghịch của histon cùng với quá trình methyl hóa và phosphoryl hóa ADN là những yếu tố điều chỉnh quan trọng nhất của quá trình sao chép gen, liên quan đến khả năng tiếp cận ADN.

Do đó, đây là một cơ chế quan trọng trong di truyền học biểu sinh của phiên mã gen [154]. Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC). Quá trình acetyl hóa histon được thực hiện bởi enzym HAT. Enzym này tác động lên nhóm ε-NH2 của lysin tận cùng, có mặt trong bốn loại histon H2A, H2B, H3 và H4 [72].

Quá trình acetyl hóa dẫn đến mất điện tích dương ở chuỗi bên và do đó làm mất tương tác ion với nhóm phosphat tích điện âm trong các nucleotid của ADN. Điều này làm cho nhiễm sắc thể tháo xoắn và giúp cho quá trình phiên mã dễ dàng hơn. Hơn nữa, quá trình acetyl hóa có thể làm xáo trộn tương tác protein-protein (protein-protein interaction - PPI) giữa các histon khác nhau trong nucleosom và do đó làm thay đổi cấu trúc của vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin). HDAC, có thể được gọi là protein deacetylase (PDAC) vì một số mục tiêu của chúng là protein không chứa histon, là một nhóm gồm mười một enzym phụ thuộc kẽm đang trở thành một trong các mục tiêu điều trị trong nghiên cứu ung thư.

Biểu hiện bất thường của chúng trong nhiều tế bào ung thư làm thay đổi biểu hiện của gen ức chế khối u (TSG) và các gen liên quan đến chức năng tế bào bình thường. Việc tác động lên các tế bào ung thư bằng các chất ức chế HDAC là một điểm khởi đầu để tái chuẩn hóa biểu hiện TSG, dẫn đến quá trình apoptosis của tế bào ung thư [145]. Các HDAC chịu trách nhiệm loại bỏ nhóm acetyl của lysin từ các protein bao gồm histon và một nhóm protein lớn liên quan đến các chức năng khác nhau như các yếu tố phiên mã (p53, Rb và hơn 60 loại khác), chính các HAT và HDAC, các enzym xử lý ARN (RNA processing enzyme), EF1α tham gia vào quá trình dịch mã, các enzym chuyển hóa, protein của bộ xương tế bào (cytoskeleton) như α-tubulin, actin, cortactin, protein liên quan đến tín hiệu tế bào, apoptosis, sửa chữa ADN, tái tổ hợp và sao chép, protein chaperon và protein virus [141], [232]. Do đó, quá trình deacetyl của histon giúp ức chế biểu sinh và đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã cũng như tiến trình phát triển của chu kỳ tế bào.

Phân loại Siêu họ enzym histon deacetylase bao gồm các histon deacetylase của sinh vật nhân thực (eukaryot), protein sử dụng acetoin (acetoin utilization proteins - ACUC) ở vi khuẩn và acetylpolyamin amidohydrolase (APHA) ở vi khuẩn và một số sinh vật nhân thực (eukaryot) [117]. Cho đến thời điểm hiện tại, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người và chúng được chia thành 4 nhóm căn cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men [54], [56], [76], [145], [169]: - Nhóm I: Các HDAC nhóm này có sự tương đồng với enzym HDA của nấm men, bao gồm các HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. - Nhóm II: Các HDAC nhóm này có sự tương đồng với enzym HDB của nấm men, được chia làm hai phân nhóm nhỏ hơn: + Phân nhóm IIa: bao gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9. + Phân nhóm IIb: bao gồm HDAC6, HDAC10.

- Nhóm III: Các HDAC nhóm này có sự tương đồng với protein nấm men Sir2 còn được gọi là các sirtuin. Chúng là các HDAC hoạt động phụ thuộc vào NAD+, không 3 luan an liên quan đến cấu trúc hoặc cơ chế xúc tác với các nhóm khác và sẽ không được thảo luận trong luận án này. Chúng bao gồm các sirtuin 1-7. - Nhóm IV: Nhóm này chỉ có duy nhất một đại diện là HDAC11.

Cấu trúc của HDAC11 không có sự tương đồng với HDA hay HDB của nấm men. Các HDAC nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển”, là những enzym phụ thuộc Zn2+. Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic. Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [73].

Các HDAC khác nhau có chiều dài khác nhau, chuỗi acid amin thay đổi từ 347 ở HDAC11 (HDAC có chiều dài ngắn nhất) đến 1215 ở HDAC6 (HDAC có chiều dài lớn nhất). Tuy nhiên, cấu trúc vùng xúc tác cho quá trình deacetyl hóa được bảo tồn. Sự khác biệt giữa các HDAC được tìm thấy ở cấu trúc lối vào của trung tâm hoạt động. Các HDAC nhóm I có một khoang phụ nằm bên trong trung tâm hoạt động, có vai trò là lối vào của phân tử nước và là lối ra của phân tử acid acetic.

Khoang phụ này không được tìm thấy ở các HDAC nhóm II, phân tử nước và acid acetic có thể đi qua lối vào/lối ra khác. Đối với các HDAC nhóm III, nhóm acetyl loại bỏ được liên kết với ADP-ribose trong cuối phản ứng xúc tác. Vị trí phân bố của các HDAC cũng có sự khác biệt, HDAC nhóm I và nhóm IV chủ yếu được tìm thấy ở nhân tế bào, nhóm IIb được tìm thấy chủ yếu ở bào tương, nhóm IIa được tìm thấy ở nhân và bào tương và nhóm III được tìm thấy ở cả ở nhân, bào tương và ty thể [169]. Cơ chế xúc tác của các enzym histon deacetylase nhóm I, II và IV Đã có rất nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của các enzym histon deacetylase phụ thuộc Zn2+ như nghiên cứu của Finnin năm 1999 [67], nghiên cứu của Vanommeslaeghe năm 2005 [201], nghiên cứu của Corminboeuf năm 2006 [50] và gần đây nhất là nghiên cứu của Gantt năm 2016 [68].

Các nghiên cứu này dựa vào cấu trúc tinh thể của protein tương tự HDAC ở người (HDLP) để nghiên cứu cơ chế xúc tác cho phản ứng deacetyl hóa của chúng. Trong cấu trúc vùng xúc tác của cả HDLP và HDAC8 đều đặc trưng bởi sự bao bọc ion Zn2+ bằng 2 dipeptid His131-Asp166 và His132-Asp173. Cơ chế xúc tác ban đầu được đề xuất cho HDLP và sau đó được chứng minh là đúng cho cả HDAC8 [185]. Do cấu trúc vị trí xúc tác của HDAC có sự tương đồng với các zinc protease và serin protease nên các nhà khoa học đã đề xuất cơ chế xúc tác của HDAC dựa trên cơ chế của các enzym này.

Bước đầu tiên, tương tự như các protease 4 luan an chứa kẽm, nhóm carbonyl của N-acetyl amid của cơ chất được acetyl hóa tương tác với ion Zn2+ ở vị trí xúc tác, làm cho liên kết C=O phân cực do đó làm tăng tính ái điện tử của C nhóm carbonyl. Ngoài ra, phân tử nước được phối trí với ion Zn2+ [67], [185]. Quá trình tấn công ái nhân từ phân tử nước phối trí với Zn2+ vào carbonyl được tạo điều kiện thuận lợi bởi sự tương tác với cặp acid amin histidin-aspartat His142- Asp176 theo cách tương tự như ở serin protease. Sau quá trình này, hợp chất trung gian carbon tứ diện được hình thành và được ổn định bằng cả Tyr306 và liên kết phối trí với ion Zn2+.

Cuối cùng, liên kết C-N bị bẻ gãy và quá trình này được hỗ trợ bởi dipeptid thứ hai His143-Asp183. Cặp acid amin này còn giúp chuyển một proton lên nguyên tử N, tạo thành chức amin của sản phẩm [44], [68], [225]. Cho đến nay, các mô hình khác nhau của cơ chế xúc tác được đề xuất cho HDAC8 do isoform này dễ thao tác in vitro và trở thành một đối tượng cho nghiên cứu về HDAC xúc tác phụ thuộc Zn2+. Các mô hình này khác nhau chủ yếu ở vai trò của hai cặp His- Asp trong quá trình xúc tác acid/base [44], [68], [225].

Gần đây, Gantt và cộng sự đã đưa ra cơ chế xúc tác của HDAC dựa vào các nghiên cứu về enzym và cấu trúc tinh thể của enzym đột biến ở các điểm khác nhau ở các cặp acid amin (hình 1. Cơ chế xúc tác của HDAC8 trong nghiên cứu của Gantt 5 luan an Trong cơ chế này, His143-Asp183 (đánh số theo HDAC8) có vai trò như một chất xúc tác acid/base, trong khi vai trò của His142-Asp176 (đánh số theo HDAC8) vẫn chưa được xác định. Tác giả đưa ra giả thuyết rằng cặp acid amin thứ hai có tác dụng xúc tác tĩnh điện, giúp ổn định điện tích âm của chất trung gian tứ diện và điện tích của cặp His143-Asp183 (đánh số theo HDAC8) [68]. Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym histon deacetylase Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X, người ta xác định được cấu trúc 3D của một số HDAC và các trung tâm hoạt động, xúc tác cho phản ứng deacetyl hóa của chúng.

Nhìn chung, các HDAC đều có cấu trúc trung tâm hoạt động tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính là ion Zn2+ và kênh enzym: + Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí. Trong phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl. Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng tăng [185]. Như acid hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên tử oxy của nó.

+ Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất và tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất, được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His. Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất. Miệng túi có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDACi.