Sàng Lọc Đột Biến Gen MLH1 Liên Quan Đến Ung Thư Ruột Kết Không Polyp Di Truyền Ở Người Việt Nam

Nghiên cứu về đột biến gen mlh1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam, cung cấp thông tin và giải pháp y tế.

• Tác giả: Lê Thị Lan Anh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen MLH1 Liên Quan Đến Ung Thư Ruột Kết Không Polyp Di Truyền Ở Người Việt Nam
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Di truyền ung thư
• 1.1.1. Khái niệm ung thư
• 1.1.2. Gen ung thư và gen ức chế khối u
• 1.1.3. Hội chứng ung thư ruột kết
• 1.1.4. Hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (Hội chứng Lynch)
• 1.1.5. Đặc điểm di truyền của HNPCC
• 1.1.6. Đặc điểm lâm sàng và phổ khối u
• 1.1.7. Chẩn đoán lâm sàng
• 1.1.8. Cơ sở phân tử của HNPCC
• 1.1.9. Tính bất ổn định vi vệ tinh
• 1.1.10. Cơ chế sửa chữa ADN bắt cặp sai (MMR - Mismatch Repair)
• 1.1.11. Đột biến gen MMR và nguy cơ ung thư
• 1.1.12. Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong nghiên cứu HNPCC
• 1.1.12.1. Kỹ thuật PCR
• 1.1.12.2. Kỹ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction)
• 1.1.12.3. Kỹ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản (SSR - Simple Sequence Repeat)
• 1.1.12.4. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism)
• 1.1.12.5. Kỹ thuật phân tích đa hình sợi đơn (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism)
• 1.1.13. Phương pháp giải trình tự ADN
• 1.1.14. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
• 1.1.14.1. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.1.14.2. Nội dung nghiên cứu của đề tài
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng và địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Thu thập và bảo quản mẫu
• 2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN tổng số
• 2.3.3. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN tổng số
• 2.3.4. Kỹ thuật PCR
• 2.3.5. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism)
• 2.3.6. Phản ứng cắt bằng enzym giới hạn
• 2.3.7. Giải trình tự gen
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tách chiết ADN tổng số
• 3.2. Phản ứng PCR
• 3.2.1. Kết quả tối ưu phản ứng PCR
• 3.2.2. Nhân bản các exon quan tâm bằng kỹ thuật PCR
• 3.3. Kết quả phân tích SSCP
• 3.4. Kết quả phân tích đột biến bằng PCR – RFLP
• 3.4.1. Kết quả xử lý exon 16 bằng enzym MspI
• 3.4.2. Kết quả xử lý exon 19 bằng enzym CviQI
• 3.4.3. Kết quả xử lý exon 18 bằng enzym CviQI
• 3.5. Kết quả giải trình tự ADN và so sánh trình tự
• 3.5.1. Phân tích trình tự exon 13 của mẫu mô từ bệnh nhân số 6
• 3.5.2. Kết quả phân tích trình tự exon 14 từ mẫu T19
• 3.5.3. Phân tích trình tự exon 18 từ mẫu T20
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• I. KẾT LUẬN
• II. KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Đột Biến Gen MLH1 và Ung Thư Ruột Kết

Ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC), hay còn gọi là Hội chứng Lynch, là một hội chứng di truyền trội, gây ra bởi các đột biến gen trong hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR). Các gen MMR chính bao gồm MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2. Trong đó, đột biến gen MLH1 chiếm khoảng 50% các đột biến MMR được xác định. HNPCC làm tăng nguy cơ phát triển ung thư ruột kết và các loại ung thư khác ở độ tuổi trẻ hơn so với bình thường. Việc nghiên cứu đột biến gen MLH1 ở người Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán sớm và phòng ngừa ung thư. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số ca ung thư và 15,2% số ca tử vong do ung thư. Nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh (2012) nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phát hiện các biến đổi di truyền liên quan đến ung thư đại trực tràng di truyền.

1.1. Khái niệm về Hội chứng Lynch và Ung thư Di truyền

Hội chứng Lynch là một hội chứng di truyền trội, làm tăng đáng kể nguy cơ mắc ung thư ruột kết và các loại ung thư khác, như ung thư nội mạc tử cung, ung thư buồng trứng, ung thư dạ dày, và ung thư đường tiết niệu. Hội chứng này gây ra bởi các đột biến trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR), dẫn đến sự tích lũy các lỗi trong DNA và tăng nguy cơ phát triển ung thư. Ung thư di truyền chiếm khoảng 5-10% tổng số các trường hợp ung thư ruột kết. Việc xác định các cá nhân mang đột biến có ý nghĩa quan trọng trong việc tư vấn di truyền và sàng lọc ung thư.

1.2. Vai trò của Gen MLH1 trong Hệ Thống Sửa Chữa DNA

Gen MLH1 đóng vai trò quan trọng trong hệ thống sửa chữa bắt cặp sai (MMR), giúp duy trì tính toàn vẹn của DNA bằng cách sửa chữa các lỗi phát sinh trong quá trình sao chép DNA. Đột biến trong gen MLH1 làm suy giảm chức năng của hệ thống MMR, dẫn đến sự tích lũy các lỗi trong DNA, đặc biệt là ở các vùng vi vệ tinh (microsatellites), gây ra tình trạng bất ổn định vi vệ tinh (MSI). MSI là một dấu ấn phân tử đặc trưng của Hội chứng Lynch và được sử dụng để xác định các khối u có khả năng mang đột biến trong các gen MMR.

II. Thách Thức Chẩn Đoán Đột Biến MLH1 ở Người Việt Nam

Việc chẩn đoán đột biến gen MLH1 ở người Việt Nam còn gặp nhiều thách thức do thiếu các nghiên cứu dịch tễ học và di truyền học quy mô lớn. Tần suất đột biến MLH1 có thể khác nhau giữa các quần thể khác nhau, và việc thiếu dữ liệu đặc trưng cho người Việt Nam gây khó khăn trong việc đánh giá nguy cơ và lựa chọn phương pháp sàng lọc phù hợp. Bên cạnh đó, chi phí xét nghiệm di truyền cao và sự hạn chế về cơ sở vật chất và nhân lực cũng là những rào cản lớn trong việc triển khai rộng rãi các xét nghiệm sàng lọc đột biến gen ở Việt Nam. Nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh (2012) đã chỉ ra sự cần thiết của việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thư đại trực tràng có khuynh hướng di truyền.

2.1. Sự Khác Biệt Về Tần Suất Đột Biến MLH1 Giữa Các Quần Thể

Tần suất đột biến MLH1 có thể khác nhau đáng kể giữa các quần thể khác nhau trên thế giới. Các yếu tố như nguồn gốc dân tộc, lịch sử di cư, và các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến sự phân bố của các đột biến gen. Việc thiếu dữ liệu về tần suất đột biến MLH1 ở người Việt Nam gây khó khăn trong việc so sánh và đánh giá nguy cơ so với các quần thể khác. Các nghiên cứu dịch tễ học và di truyền học quy mô lớn là cần thiết để xác định tần suất đột biến MLH1 và các yếu tố nguy cơ liên quan ở người Việt Nam.

2.2. Hạn Chế Về Cơ Sở Vật Chất và Chi Phí Xét Nghiệm Di Truyền

Việc triển khai rộng rãi các xét nghiệm sàng lọc đột biến gen ở Việt Nam còn gặp nhiều hạn chế về cơ sở vật chất và chi phí. Các xét nghiệm di truyền, như giải trình tự gen, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất đắt tiền, và đội ngũ nhân viên được đào tạo chuyên sâu. Chi phí xét nghiệm cao có thể là một rào cản lớn đối với nhiều bệnh nhân và gia đình có nguy cơ mắc Hội chứng Lynch. Cần có sự đầu tư từ nhà nước và các tổ chức phi chính phủ để cải thiện cơ sở vật chất và giảm chi phí xét nghiệm di truyền, giúp tăng cường khả năng tiếp cận của người dân với các dịch vụ chẩn đoán và tư vấn di truyền.

III. Phương Pháp Sàng Lọc Đột Biến Gen MLH1 Hiệu Quả Hiện Nay

Hiện nay, có nhiều phương pháp sàng lọc đột biến gen MLH1 được sử dụng, bao gồm các kỹ thuật dựa trên PCR, giải trình tự gen, và phân tích đa hình sợi đơn (SSCP). Kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA chứa gen MLH1, sau đó các sản phẩm PCR được phân tích bằng các phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến. Giải trình tự gen là phương pháp chính xác nhất để xác định các đột biến trong gen MLH1, nhưng cũng là phương pháp tốn kém nhất. Phân tích SSCP là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để sàng lọc đột biến, nhưng cần được xác nhận bằng giải trình tự gen. Nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh (2012) đã sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình tự gen để phân tích đột biến gen MLH1.

3.1. Kỹ Thuật PCR và Giải Trình Tự Gen trong Phát Hiện Đột Biến

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp khuếch đại DNA được sử dụng rộng rãi trong sàng lọc đột biến gen. PCR cho phép tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn DNA cụ thể, giúp tăng cường khả năng phát hiện các đột biến. Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự nucleotide của một đoạn DNA, cho phép xác định chính xác các đột biến điểm, đột biến chèn, và đột biến mất đoạn. Giải trình tự gen là phương pháp tiêu chuẩn vàng trong phát hiện đột biến gen MLH1.

3.2. Phân Tích Đa Hình Sợi Đơn SSCP và PCR RFLP

Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP) là một kỹ thuật đơn giản và hiệu quả để sàng lọc đột biến gen. SSCP dựa trên sự khác biệt về cấu trúc không gian của các sợi DNA đơn mang các đột biến khác nhau. Các sợi DNA đơn được điện di trên gel, và các sợi có cấu trúc khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, cho phép phát hiện các đột biến. PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là một kỹ thuật sử dụng các enzyme giới hạn để cắt DNA tại các vị trí đặc hiệu. Các đột biến có thể làm thay đổi các vị trí cắt của enzyme, dẫn đến sự thay đổi về kích thước của các đoạn DNA, cho phép phát hiện các đột biến.

IV. Ứng Dụng Nghiên Cứu Đột Biến MLH1 trong Y Học Cá Nhân Hóa

Nghiên cứu đột biến gen MLH1 có ứng dụng quan trọng trong y học cá nhân hóa, giúp đưa ra các quyết định điều trị và phòng ngừa ung thư phù hợp với từng bệnh nhân. Việc xác định các cá nhân mang đột biến MLH1 cho phép thực hiện các biện pháp sàng lọc ung thư tăng cường, như nội soi đại tràng thường xuyên, giúp phát hiện sớm và điều trị kịp thời ung thư ruột kết. Ngoài ra, các cá nhân mang đột biến MLH1 cũng có thể được tư vấn về nguy cơ ung thư và các biện pháp phòng ngừa, như phẫu thuật cắt bỏ đại tràng dự phòng. Nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh (2012) góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến gen MLH1 ở người Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu về các gen MMR khác.

4.1. Tư Vấn Di Truyền và Sàng Lọc Ung Thư Tăng Cường

Tư vấn di truyền là một quá trình quan trọng giúp các cá nhân và gia đình có nguy cơ mắc Hội chứng Lynch hiểu rõ về nguy cơ ung thư, các lựa chọn sàng lọc, và các biện pháp phòng ngừa. Sàng lọc ung thư tăng cường, như nội soi đại tràng thường xuyên, giúp phát hiện sớm các polyp và ung thư ruột kết, cho phép điều trị kịp thời và cải thiện tiên lượng. Các cá nhân mang đột biến MLH1 nên được tư vấn về nguy cơ ung thư và các biện pháp sàng lọc phù hợp.

4.2. Điều Trị Ung Thư Ruột Kết Di Truyền và Các Biện Pháp Phòng Ngừa

Điều trị ung thư ruột kết di truyền có thể bao gồm phẫu thuật, hóa trị, và xạ trị. Tuy nhiên, các cá nhân mang đột biến MLH1 có thể đáp ứng khác nhau với các phương pháp điều trị này. Phẫu thuật cắt bỏ đại tràng dự phòng là một lựa chọn cho các cá nhân có nguy cơ ung thư ruột kết rất cao. Các biện pháp phòng ngừa khác có thể bao gồm sử dụng aspirin, thay đổi lối sống, và chế độ ăn uống lành mạnh. Cần có các nghiên cứu để xác định các phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả nhất cho các cá nhân mang đột biến MLH1.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Đột Biến MLH1 Tương Lai

Nghiên cứu đột biến gen MLH1 ở người Việt Nam là một lĩnh vực quan trọng và cần được đẩy mạnh trong tương lai. Việc xác định tần suất đột biến MLH1 và các yếu tố nguy cơ liên quan sẽ giúp cải thiện công tác chẩn đoán sớm và phòng ngừa ung thư ruột kết di truyền. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc phát triển các phương pháp sàng lọc đột biến gen hiệu quả và chi phí thấp, cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp sàng lọc và phòng ngừa ung thư ở người Việt Nam mang đột biến MLH1. Nghiên cứu của Lê Thị Lan Anh (2012) đã mở ra hướng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam.

5.1. Phát Triển Các Phương Pháp Sàng Lọc Đột Biến Gen Chi Phí Thấp

Việc phát triển các phương pháp sàng lọc đột biến gen hiệu quả và chi phí thấp là rất quan trọng để tăng cường khả năng tiếp cận của người dân với các dịch vụ chẩn đoán và tư vấn di truyền. Các phương pháp như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và các kỹ thuật dựa trên PCR có thể được sử dụng để sàng lọc đột biến gen với chi phí thấp hơn so với giải trình tự gen Sanger truyền thống. Cần có sự hợp tác giữa các nhà khoa học, các nhà lâm sàng, và các nhà quản lý y tế để phát triển và triển khai các phương pháp sàng lọc đột biến gen chi phí thấp.

5.2. Đánh Giá Hiệu Quả của Các Biện Pháp Sàng Lọc và Phòng Ngừa

Cần có các nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của các biện pháp sàng lọc và phòng ngừa ung thư ở người Việt Nam mang đột biến MLH1. Các nghiên cứu này nên tập trung vào việc xác định các biện pháp sàng lọc hiệu quả nhất, như nội soi đại tràng, và các biện pháp phòng ngừa hiệu quả nhất, như sử dụng aspirin và thay đổi lối sống. Kết quả của các nghiên cứu này sẽ giúp đưa ra các khuyến cáo sàng lọc và phòng ngừa ung thư dựa trên bằng chứng cho người Việt Nam mang đột biến MLH1.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư đại trực tràng là một trong những loại ung thư phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên thế giới, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trường hợp ung thư và 15,2% tổng số tử vong do ung thư. Tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện khoảng 200.000 ca ung thư mới và khoảng 75.000 người tử vong do bệnh này. Trong số các dạng ung thư đại trực tràng, hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền (HNPCC hay hội chứng Lynch) chiếm khoảng 15% các trường hợp. HNPCC là bệnh di truyền trội do đột biến ở các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR), trong đó gen MLH1 đóng vai trò chủ đạo với tỷ lệ đột biến chiếm khoảng 50% trong các gen MMR liên quan.

Mục tiêu nghiên cứu là sàng lọc các đột biến ở một số exon của gen MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền ở người Việt Nam, nhằm cung cấp dữ liệu về đột biến gen này và mở hướng nghiên cứu các gen MMR khác, góp phần ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thư đại trực tràng tại Việt Nam. Nghiên cứu được thực hiện trên mẫu máu và mô của bệnh nhân ung thư đại trực tràng và dạ dày tại các bệnh viện lớn ở Hà Nội trong giai đoạn 2009-2011. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát hiện sớm, tư vấn di truyền và quản lý bệnh nhân HNPCC, góp phần giảm tỷ lệ tử vong do ung thư đại trực tràng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Di truyền học ung thư: Ung thư phát sinh do sự tích lũy các đột biến gen, trong đó gen ung thư (oncogenes) và gen ức chế khối u đóng vai trò quan trọng. HNPCC là hội chứng ung thư di truyền trội do đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR).

• Cơ chế sửa chữa bắt cặp sai (MMR): Hệ thống MMR gồm các protein do gen MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 mã hóa, có chức năng phát hiện và sửa chữa các bazơ bắt cặp sai trong quá trình sao chép ADN. Đột biến gây bất hoạt gen MMR dẫn đến tính bất ổn vi vệ tinh (MSI), làm tăng nguy cơ ung thư.

• Tính bất ổn vi vệ tinh (MSI): MSI là hiện tượng thay đổi chiều dài các trình tự vi vệ tinh do lỗi sửa chữa ADN, được sử dụng làm dấu hiệu phân tử của HNPCC.

• Các kỹ thuật sinh học phân tử: PCR, PCR-RFLP, PCR-SSCP, giải trình tự ADN được sử dụng để phát hiện và phân tích đột biến gen MLH1.

Các khái niệm chính bao gồm: gen MLH1, đột biến gen MMR, MSI, PCR, SSCP, RFLP.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu máu và mô của 20 bệnh nhân ung thư đại trực tràng và dạ dày được thu thập tại Bệnh viện K và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Mẫu đối chứng lấy từ người không mắc bệnh.

• Phương pháp phân tích: Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu và mô theo phương pháp cải tiến của Sambrook. Xác định độ tinh sạch và hàm lượng ADN bằng đo quang phổ. Nhân bản 7 exon quan tâm (exon 8, 13, 14, 16, 17, 18, 19) của gen MLH1 bằng kỹ thuật PCR với điều kiện tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi. Phân tích đa hình sợi đơn (SSCP) và phản ứng cắt enzym giới hạn (PCR-RFLP) để phát hiện đột biến. Giải trình tự ADN các mẫu nghi ngờ đột biến để xác định chính xác vị trí và loại đột biến.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và tách chiết ADN trong năm 2009-2010; thực hiện PCR, SSCP, RFLP và giải trình tự trong năm 2010-2011; phân tích dữ liệu và hoàn thiện luận văn năm 2011-2012.

• Cỡ mẫu và chọn mẫu: 20 mẫu bệnh phẩm được lựa chọn dựa trên chẩn đoán lâm sàng ung thư đại trực tràng và dạ dày, đảm bảo đại diện cho nhóm bệnh nhân HNPCC nghi ngờ.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách chiết ADN thành công: 20 mẫu máu và 38 mẫu mô được tách chiết ADN với chất lượng cao, giá trị A260/A280 dao động từ 1,8 đến 2,0, nồng độ ADN từ 50 đến 500 µg/ml, đảm bảo cho các phản ứng PCR tiếp theo.

2. Tối ưu hóa phản ứng PCR: Nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho các exon dao động từ 51°C đến 61°C, cho sản phẩm PCR đặc hiệu, kích thước phù hợp với lý thuyết (ví dụ exon 8 ~260 bp, exon 13 ~300 bp).

3. Phát hiện đột biến bằng SSCP và RFLP: Phân tích SSCP trên các exon cho thấy sự xuất hiện các băng di chuyển khác biệt so với đối chứng, gợi ý có đột biến. Phản ứng cắt enzym giới hạn trên exon 16, 18, 19 cũng phát hiện các mẫu có mẫu cắt khác biệt, chứng tỏ sự tồn tại đột biến.

4. Giải trình tự ADN xác nhận đột biến: Giải trình tự các mẫu nghi ngờ cho thấy các đột biến thay thế nucleotit (ví dụ đột biến thay thế 203 G>A ở exon 13, 176C>G và 185T>A ở exon 14), đột biến dịch khung và mất nucleotit ở các exon khác.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các báo cáo quốc tế về tần suất và loại đột biến gen MLH1 trong HNPCC, với tỷ lệ đột biến thay thế chiếm đa số. Việc phát hiện đột biến ở các exon quan trọng của gen MLH1 khẳng định vai trò trung tâm của gen này trong cơ chế bệnh sinh của ung thư ruột kết không polyp di truyền. So sánh với các nghiên cứu ở các quần thể khác, tỷ lệ và loại đột biến tương đồng, tuy nhiên có sự khác biệt nhỏ về vị trí đột biến, phản ánh đặc điểm di truyền riêng của người Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tần suất đột biến theo exon và bảng so sánh các loại đột biến phát hiện. Kết quả này góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen MLH1 tại Việt Nam, hỗ trợ chẩn đoán phân tử và tư vấn di truyền cho bệnh nhân HNPCC.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Xây dựng chương trình sàng lọc di truyền HNPCC: Áp dụng kỹ thuật PCR-SSCP và PCR-RFLP để sàng lọc đột biến gen MLH1 cho các bệnh nhân ung thư đại trực tràng có yếu tố gia đình, nhằm phát hiện sớm và quản lý bệnh hiệu quả. Thời gian thực hiện: 1-2 năm; chủ thể: các bệnh viện chuyên khoa ung bướu.

2. Phát triển cơ sở dữ liệu đột biến gen MLH1 tại Việt Nam: Thu thập và tổng hợp dữ liệu đột biến từ các nghiên cứu và xét nghiệm lâm sàng để xây dựng cơ sở dữ liệu tham khảo, hỗ trợ chẩn đoán và nghiên cứu tiếp theo. Thời gian: 3 năm; chủ thể: các trung tâm nghiên cứu di truyền.

3. Đào tạo nhân lực kỹ thuật sinh học phân tử: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật PCR, SSCP, RFLP và giải trình tự gen cho cán bộ y tế và nghiên cứu để nâng cao năng lực chẩn đoán di truyền. Thời gian: liên tục; chủ thể: các trường đại học và viện nghiên cứu.

4. Tăng cường hợp tác quốc tế và nghiên cứu đa trung tâm: Mở rộng nghiên cứu với quy mô lớn hơn, phối hợp với các trung tâm quốc tế để so sánh đặc điểm đột biến và phát triển phương pháp chẩn đoán mới. Thời gian: 5 năm; chủ thể: các viện nghiên cứu và bệnh viện.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Bác sĩ chuyên khoa ung bướu và di truyền y học: Nắm bắt kiến thức về cơ chế di truyền và kỹ thuật sàng lọc đột biến gen MLH1 để áp dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh nhân ung thư đại trực tràng.

2. Nhà nghiên cứu di truyền học và sinh học phân tử: Tham khảo phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích đột biến và dữ liệu đột biến gen MLH1 trong quần thể người Việt Nam để phát triển các nghiên cứu tiếp theo.

3. Sinh viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành di truyền học, y học phân tử: Học tập quy trình nghiên cứu khoa học, kỹ thuật PCR, SSCP, RFLP và giải trình tự gen trong nghiên cứu ung thư di truyền.

4. Các cơ quan y tế và quản lý chính sách y tế: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng chính sách sàng lọc và quản lý ung thư đại trực tràng có yếu tố di truyền, nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh.

Câu hỏi thường gặp

1. HNPCC là gì và tại sao gen MLH1 quan trọng?
   HNPCC là hội chứng ung thư ruột kết không polyp di truyền, do đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) gây ra. Gen MLH1 chiếm khoảng 50% các đột biến trong gen MMR, đóng vai trò trung tâm trong sửa chữa ADN, nên rất quan trọng trong nghiên cứu và chẩn đoán.

2. Kỹ thuật PCR-SSCP và PCR-RFLP có ưu điểm gì trong phát hiện đột biến?
   PCR-SSCP đơn giản, chi phí thấp, phát hiện được các đột biến nhỏ trong đoạn ADN ngắn. PCR-RFLP giúp xác định đột biến dựa trên sự thay đổi vị trí cắt enzym giới hạn, có độ chính xác cao. Cả hai kỹ thuật phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam.

3. Tính bất ổn vi vệ tinh (MSI) liên quan thế nào đến ung thư?
   MSI là hiện tượng thay đổi chiều dài các trình tự vi vệ tinh do lỗi sửa chữa ADN, thường gặp trong các khối u HNPCC. MSI là dấu hiệu phân tử quan trọng giúp chẩn đoán và dự báo nguy cơ ung thư.

4. Tại sao cần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen MLH1 ở Việt Nam?
   Cơ sở dữ liệu giúp hiểu đặc điểm đột biến riêng của quần thể Việt Nam, hỗ trợ chẩn đoán chính xác, tư vấn di truyền và phát triển phương pháp điều trị phù hợp.

5. Làm thế nào để áp dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn y tế?
   Kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để thiết lập chương trình sàng lọc di truyền cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng, đào tạo nhân lực kỹ thuật sinh học phân tử và xây dựng chính sách y tế nhằm giảm tỷ lệ tử vong do ung thư.

Kết luận

• Đã thành công trong việc tách chiết ADN tổng số và nhân bản 7 exon quan trọng của gen MLH1 từ mẫu bệnh phẩm người Việt Nam.
• Phát hiện các đột biến thay thế, dịch khung và mất nucleotit ở các exon 13, 14, 16, 18, 19 của gen MLH1 liên quan đến ung thư ruột kết không polyp di truyền.
• Kỹ thuật PCR-SSCP và PCR-RFLP là phương pháp hiệu quả, phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam để sàng lọc đột biến gen MLH1.
• Nghiên cứu góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu đột biến gen MLH1, hỗ trợ chẩn đoán sớm và tư vấn di truyền cho bệnh nhân HNPCC tại Việt Nam.
• Đề xuất triển khai chương trình sàng lọc di truyền, đào tạo nhân lực và phát triển nghiên cứu đa trung tâm trong thời gian tới.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các cơ sở y tế áp dụng kỹ thuật sàng lọc đột biến gen MLH1, đồng thời mở rộng nghiên cứu các gen MMR khác để nâng cao hiệu quả phòng chống ung thư đại trực tràng di truyền.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong hơn 20 năm qua, những phát minh to lớn của di truyền học phân tử đã góp phần thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học. Các kỹ thuật mới nhƣ tách dòng gen, tạo ADN tái tổ hợp, giải trình tự gen và nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc phát hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh, trong đó có bệnh ung thƣ. Sự phát hiện ung thƣ là một bệnh di truyền đƣợc coi là một thắng lợi của sinh y học hiện đại. Nhiều nỗ lực nghiên cứu không ngừng nghỉ và hiệu quả đã giúp xác định chi tiết các biến đổi di truyền là nhân tố trực tiếp gây ung thƣ, bắt đầu từ sự hình thành các khối u, sau đó là sự tăng sinh và lan rộng của chúng.

Tỷ lệ mắc bệnh ung thƣ có xu hƣớng gia tăng ở phần lớn các nƣớc trên thế giới. Hiện tại, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 22,4 triệu ngƣời đang sống chung với bệnh ung thƣ. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính hàng năm trên thế giới có khoảng 10,1 triệu trƣờng hợp mới mắc ung thƣ. Các ung thƣ hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thƣ phổi, dạ dày, đại trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; Ở nữ giới là ung thƣ vú, đại trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi.

Cũng theo Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính mỗi năm có khoảng trên 6,7 triệu ngƣời chết do ung thƣ. Tỷ lệ chết do ung thƣ chiếm 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở ngƣời [28]. Riêng tại Việt Nam, mỗi năm phát hiện mới khoảng 200.000 ngƣời và khoảng 75.000 ngƣời chết vì bệnh ung thƣ [47]. Trong số các bệnh ung thƣ thƣờng gặp ở ngƣời, ung thƣ đại trực tràng là loại ung thƣ tƣơng đối phổ biến, chiếm khoảng 11,5% tổng số các trƣờng hợp ung thƣ và chiếm tới 15,2% tổng số các trƣờng hợp tử vong vì ung thƣ.

Loại ung thƣ này thƣờng gặp nhiều hơn ở các nƣớc phát triển và có xu hƣớng tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển. Nguy cơ ung thƣ đại trực tràng tăng cao hơn ở những Lê Thị Lan Anh 1 Cao học K18 z Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 ngƣời có tiền sử viêm đại tràng hoặc trong gia đình, dòng họ có ngƣời bị ung thƣ đại trực tràng [3]. Ung thƣ ruột kết không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), còn đƣợc gọi là hội chứng Lynch chiếm 15% các trƣờng hợp ung thƣ đại trực tràng. Đây là hội chứng di truyền trội do gen trên nhiễm sắc thể thƣờng gây ra.

Những đột biến gây bất hoạt ở tế bào mầm của một trong các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) bao gồm gen MLH1, MSH2, MSH6 và PMS2, dẫn đến sự thay đổi hoạt tính protein, làm bất hoạt hệ thống sửa chữa bắt cặp sai là nguyên nhân gây HNPCC. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các đột biến trong gen MLH1 chiếm khoảng 50% trong số các đột biến xác định đƣợc ở các gen MMR [2, 5]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gen MLH1 đƣợc thực hiện ở rất nhiều quần thể ngƣời khác nhau. Tại Việt Nam, xét nghiệm di truyền trong chẩn đoán ung thƣ nói chung và ung thu đại trực tràng nói riêng hầu nhƣ chƣa đƣợc thực hiện.

Việc phát hiện những biến đổi di truyền trong các gen MMR liên quan đến ung thƣ đại trực tràng có khuynh hƣớng di truyền, nhằm đƣa ra những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu về gen MLH1 ở bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng tại Việt Nam góp phần cung cấp dữ liệu về đột biến ở gen này và mở ra hƣớng nghiên cứu về các gen MMR khác, ứng dụng trong chẩn đoán sớm ung thƣ ruột kết không polyp di truyền tại Việt Nam là rất cần thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Sàng lọc đột biến gen sửa chữa bắt cặp sai MLH1 liên quan đến ung thƣ ruột kết không polyp di truyền ở ngƣời Việt Nam”. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Phân tích di truyền thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, Khoa Sinh học và Phòng Sinh học thụ thể và phát triển thuốc thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. Lê Thị Lan Anh 2 Cao học K18 z Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 Chƣơng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Di truyền ung thƣ 1. Khái niệm ung thư Ung thƣ không phải là bệnh mà là một tên chung cho một nhóm các bệnh phát sinh từ các tế bào có tốc độ tăng trƣởng không kiểm soát đƣợc, có đƣợc sự bất tử, xâm lấn và khả năng di căn. Thuật ngữ “ung thƣ” theo nghĩa hẹp đƣợc dùng để chỉ những khối u có khả năng xâm lấn các mô xung quanh gồm các tế bào bình thƣờng [17].

Khối u là tập hợp các tế bào có quan hệ di truyền với nhau và có khả năng phân chia một cách không kiểm soát. Sự phân biệt giữa các khối u lành và u ác tính đơn thuần dựa trên khả năng xâm lấn của chúng. Nếu một khối u ác tính sau khi xâm lấn tiếp cận đƣợc với mạch máu hoặc mạch bạch huyết, thì tế bào của nó có thể di căn và phát triển tại các mô ở xa tại nơi chúng di chuyển tới. U di căn có thể gây rối loạn chức năng của các mô khác và dẫn đến tử vong.

Quá trình tăng trƣởng của một khối u bắt đầu từ tế bào bị biến đổi di truyền bất thƣờng này đƣợc gọi là quá trình hay sự phát sinh ung thư. Vì các khối u thƣờng bắt nguồn từ những khối u nhỏ lành tính, rồi sau đó chuyển sang trạng thái ác tính và di căn, nên trong quá trình phát sinh ung thƣ, những tế bào hình thành khối u có xu hƣớng tích lũy các biến đổi di truyền và qua đó có những đặc tính mới. Sự tích lũy các gen ung thƣ ở các tế bào khối u là căn nguyên của phát sinh ung thƣ [17]. Gen ung thư và gen ức chế khối u Gen ung thƣ (oncogenes) có thể định nghĩa là dạng gen đột biến làm tăng nguy cơ ung thƣ hoặc làm thúc đẩy sự phát sinh ung thƣ.

Các gen ung thƣ cũng có thể đƣợc coi nhƣ các dạng alen đặc biệt của các gen bình thƣờng xuất hiện do kết quả của đột biến [3]. Các cá thể đƣợc truyền các gen ung thƣ phát sinh từ các tế bào mầm sinh Lê Thị Lan Anh 3 Cao học K18 z Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 dục (còn gọi là các gen ung thư bẩm sinh) từ bố, mẹ sẽ mang gen ung thƣ này trong hầu hết các tế bào của cơ thể, ở cả các tế bào sinh dƣỡng và các tế bào sinh dục (những cá thể này đƣợc gọi là các thể mang). Ngƣợc lại, các gen ung thƣ phát sinh từ các tế bào sôma sẽ không đƣợc truyền cho các thế hệ sau [17]. Các khối u tích lũy dần các gen ung thƣ khi chúng tăng trƣởng.

Sự tích lũy các gen đột biến gây ung thƣ có thể diễn ra theo ba con đƣờng: 1) Đƣợc truyền qua dòng sinh dục, 2) Do đột biến tự phát trong tế bào sôma và 3) Do sự lây nhiễm của virut. Các gen ung thƣ quan trọng có thể đƣợc nhóm lại theo chức năng bình thƣờng của chúng trong một tế bào. Các tiền gen ung thƣ (Proto-oncogenes) là các gen có vai trò quan trọng, ví dụ điều hòa sự sinh trƣởng tế bào, sinh sản và biệt hóa tế bào. Các gen tiền ung thƣ có thể đƣợc kích hoạt và trở thành gen ung thƣ thông qua đột biến điểm, sao chép hoặc chuyển đoạn.

Các gen ung thƣ đƣợc di truyền trội, vì chỉ có một đột biến là đủ gây ra thay đổi chức năng tế bào, tuy nhiên, các gen ung thƣ hiếm khi là nguyên nhân gây ra sự nhạy cảm di truyền ung thƣ. Mặt khác, gen ức chế khối u là những gen khi bị bất hoạt không còn ức chế sự sinh sản của tế bào có thể gây tổn thƣơng ADN và do đó cung cấp cho các khối u một lợi thế tăng trƣởng. Knudson quan sát thấy rằng các gen ức chế khối u là các gen lặn, cần phải có “cú đánh thứ hai” (cả hai alen trở thành bất hoạt) cho sự phát triển của bệnh ung thƣ. Sự ức chế khối u đã đƣợc mô tả trong một số hình thức di truyền của bệnh ung thƣ, “đòn thứ nhất” đƣợc di truyền và “đòn thứ hai” xảy ra ở tế bào soma [28].

Hơn nữa, các gen ức chế khối u có thể đƣợc chia thành gen gác cổng (Gatekeeper), gen trông giữ (Caretaker) và gen làm cảnh (Lanscaper). Gen gác cổng trực tiếp ức chế sự phát triển hoặc thúc đẩy tế bào chết, ví dụ gen APC khi bị đột biến sinh u tuyến polyp theo dòng họ (FAP). Ngƣợc lại, các gen trông giữ, không trực tiếp thúc đẩy sự phát triển khối u, nhƣng sự bất hoạt của chúng dẫn đến sự mất ổn định di truyền là nguyên nhân gia tăng tỷ lệ đột biến trong cả gen ung thƣ và gen ức chế khối u, góp phần cho sự tạo thành các khối u. Một ví dụ về gen trông giữ là Lê Thị Lan Anh 4 Cao học K18 z Luận văn thạc sĩ khoa học 2009 - 2011 các gen sửa chữa bắt cặp sai (MMR) mở đƣờng cho hội chứng Lynch.

Gen “làm cảnh”, nhƣ tên của nó, gián tiếp gây ra ung thƣ bằng cách thay đổi cảnh quan, có nghĩa là vi môi trƣờng, tạo thuận lợi đối với sự hình thành khối u. Hiện tƣợng này đã đƣợc quan sát thấy trong ung thƣ ruột kết, nơi các môi trƣờng mô đệm bất thƣờng ảnh hƣởng đến sự phát triển và tăng trƣởng của các tế bào biểu mô, dẫn đến sự hình thành ung thƣ (Hình 1). Các con đường hình thành ung thư đại trực tràng [3] 1. Hội chứng ung thƣ ruột kết Ung thƣ ruột kết hay còn gọi là ung thƣ đại trực tràng là một loại ung thƣ biểu mô rất thƣờng gặp.

Đây là một trong những bệnh ung thƣ biểu mô phổ biến nhất trên thế giới, là ung thƣ gây tử vong đứng thứ hai ở Mỹ và đang có xu hƣớng tăng lên ở các nƣớc đang phát triển [8, 19]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thƣ đại trực tràng chỉ sau ung thƣ dạ dày.