ĐẶT VẤN ĐỀ Huyết khối động mạch và huyết khối tĩnh mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới vào năm 2010, trung bình cứ bốn người chết thì có một người tử vong do huyết khối [1]. Huyết khối có thể dẫn đến các tình trạng nguy hiểm như suy tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, đột quị hoặc huyết khối tĩnh mạch sâu, phù phổi tắc nghẽn [2]. Để phòng ngừa và điều trị bệnh huyết khối tắc mạch, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu được coi là liệu pháp điều trị lý tưởng. Bên cạnh tác dụng điều trị, thuốc chống ngưng tập tiểu cầu và thuốc chống đông máu có tác dụng không mong muốn như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm tiểu cầu [3].
Vì vậy, việc tìm kiếm liên tục các loại thuốc mới đặc biệt là thuốc chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu là vô cùng cần thiết. Xác định được các con đường sinh hoá liên quan đến hoạt hoá đông máu và ngưng tập tiểu cầu đã đưa đến việc tìm kiếm các thuốc chống huyết khối mới có ít tác dụng không mong muốn hơn luôn được các nhà khoa học quan tâm. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên là một ứng viên tiềm năng để sử dụng nghiên cứu [4], [5]. Dong riềng là một loại cây thân rễ dễ trồng, cho năng suất cao, được trồng chủ yếu ở Nam Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan và Việt Nam.
Một số nghiên cứu đã chứng minh hàm lượng phenol và flavonoid của C. edulis có tác dụng chống ung thư, chống oxi hóa và chống viêm [6]. Hiện nay, theo danh mục thực vật Việt Nam có 5 loài: C. edulis Ker Gawl.
Một số loài Canna đã được dân gian sử dụng để chữa bệnh viêm loét dạ dày, đau nhức xương, tức ngực và đặc biệt có sử dụng trong điều trị các bệnh tim mạch. Nguyễn Thị Vân Anh và cộng sự đã xác định dịch chiết phân đoạn ethyl acetat từ phần dưới mặt đất cây dong riềng có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu ở cả ba nồng độ thử là 4 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL tốt hơn nhiều so với cao toàn phần và phân đoạn nước. Dịch chiết ethyl acetat ở nồng độ 4 mg/mL có tác dụng kéo dài thời gian đông máu với PT và aPTT [7]. Nhận thấy các nghiên cứu liên quan đến phần thân lá còn tương đối hạn chế, do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu tiếp theo nhằm đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu và chống oxi hóa của phần thân lá cây 1 dong riềng.
Từ đó, sử dụng kết quả nghiên cứu để chọn ra phân đoạn có tác dụng tốt nhất để định hướng phân lập chất có tiềm năng, hướng tới khả năng ứng dụng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh huyết khối. Đề tài “Nghiên cứu hoạt tính chống ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu và chống oxi hóa của phần thân lá cây dong riềng (Canna edulis Ker Gawl.)” được thực hiện với mục tiêu sau: 1. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao toàn phần, các phân đoạn và các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng. Đánh giá tác dụng chống đông máu in vitro của cao toàn phần của cây dong riềng, các phân đoạn và các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng.
Đánh giá tác dụng chống oxi hóa in vitro của cao toàn phần của cây dong riềng, các phân đoạn và các chất phân lập từ phân đoạn tiềm năng. Sinh lý học tiểu cầu Tiểu cầu là những mảnh đa giác, hình đĩa rất nhỏ, đường kính 2 – 4 µm, không có nhân. Tiểu cầu được sinh ra từ mẫu tiểu cầu (megakaryocytes) trong tủy xương rồi vào máu [8]. Cấu trúc của tiểu cầu Màng tiểu cầu Màng tiểu cầu là các glycoprotein (trong đó GPIb, GPIIb và GPIIIa đóng vai trò chính trong hiện tượng kết dính) và các phospholipid (có yếu tố III tiểu cầu – hoạt hóa quá trình đông máu).
GPIb là protein xuyên màng, liên kết với yếu tố von Willebrand, là bước đầu tiên trong hoạt động cầm máu của tiểu cầu. GPIIb/IIIa là protein màng, hoạt động phụ thuộc Ca++, liên kết với fibrinogen giúp tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu. Mặt ngoài màng là nơi có các yếu tố đông máu hấp thụ vào [9]. Hệ thống các hạt đặc hiệu Các hạt đặc chứa các chất kích hoạt tiểu cầu như ADP, ATP, Ca++, serotonin, histamin và epinephrine.
Các hạt alpha gồm có các protein kết dính (yếu tố von Willebrand, thrombospondin, fibronectin), các yếu tố tăng trưởng tiểu cầu (PDGH – platelet derived growth factor), các yếu tố đông máu và tiêu sợi huyết (fibrinogen, yếu tố V), trong tiểu cầu còn có một hệ thống co gồm có actin và myosin [10], [11]. Hệ thống vi ống và vi sợi Các vi ống nằm sát dưới màng tiểu cầu, bao quanh tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích. Các ống dày đặc là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, đóng vai trò là kho dự trữ Ca++, đồng thời là nơi tổng hợp cyclooxigenase và prostaglandin của tiểu cầu. Và các vi sợi bản chất là các sợi actin tham gia vào tạo giả túc của tiểu cầu [10], [12].
Hệ thống kênh mở Hệ thống các kênh mở là hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường vào trong tế bào chất 3 của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu khi bị hoạt hóa [13]. Chức năng tiểu cầu Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mạc bị phá vỡ, các tổ chức dưới nội mạc như collagen, yếu tố von Willebrand (vWF), màng nền, vi sợ được bộc lộ. Lúc này hiện tượng dính và ngưng tập tiểu cầu xảy ra [14].
Khả năng bám dính của tiểu cầu: Bình thường tiểu cầu không dính vào thành mạch máu do một số chất ức chế dính của tiểu cầu như prostaglandin nhưng khi thành mạch bị tổn thương tiểu cầu lập tức được hoạt hóa và dính vào nơi bị tổn thương. Tiểu cầu sẽ tiếp xúc với yếu tố Willebrand, vWF tạo điều kiện cho sự bám dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên màng tiểu cầu [15]. vWF và collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa, fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [13]. Khả năng ngưng tập (aggregation) của tiểu cầu: Tiểu cầu có khả năng kết dính với nhau tạo nên các kết chụm tiểu cầu gọi là ngưng tập tiểu cầu.
Có nhiều chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu như ADP, thrombin, adrenalin, serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin,… các chất này được gọi là “chất kích hoạt” tiểu cầu. Trong đó, ADP đóng vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng cầu tại vị trí thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [13].
Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP: bình thường các tiểu cầu không ngưng tập là phải có năng lượng, năng lượng được tạo ra là do sự thoái hoá ATP thành ADP. Trong trường hợp có nhiều ADP (do đưa từ ngoài vào) thì phản ứng này bị ức chế, do đó gây ra thiếu năng lượng dẫn đến tiểu cầu bị ngưng tập. Hiện nay vai trò của phospholipid màng (cụ thể là acid arachidonic (AA) đã được chứng minh tham gia vào sự ngưng tập tiểu cầu nhờ sự 4 tương tác giữa các yếu tố kích tập với phospholipid màng và các men như cyclo- oxigenase và thromboxan synthetase [14]. ADP ngoại lai (-) Adenylakinase ATP ADP AMP Năng lượng Phosphatase (-) Tiểu cầu bị ngưng tập Xâm nhập vào tiểu cầu và trở Adrenosin thành ATP Hình 1.
Cơ chế ngưng tập tiểu cầu của ADP (- -: ức chế, ngăn cản) Ngưng tập tiểu cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào một nút cầm máu. Các thụ thể tiểu cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu không hoạt hóa có khoảng phức hợp GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không thể gắn với fibrinogen, vWF, fibronectin, vitronectin.
Chỉ khi tiểu cầu được hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến khi tạo thành nút tiểu cầu [13]. Khả năng chế tiết của tiểu cầu: Với sự có mặt của collagen hoặc thrombin hoạt hóa sẽ dẫn đến tăng chế tiết của các hạt tiểu cầu bao gồm ADP, serotonin, fibrinogen, men lysosom, beta- thromboglobulin, heparin, collagen và thrombin hoạt hóa quá trình tổng hợp prostaglandin tiểu cầu. Ngoài tác dụng làm tăng tính thấm thành mạch các hạt tiểu 5 cầu còn có tác dụng làm tăng thấm mạch, hoạt hóa protein C, tạo thromboxan A2 và prostacyclin.
Từ đây một chuỗi phản ứng, bao gồm tăng thấm mạch, giảm Ca++, ức chế ngưng tập tiểu cầu sẽ xảy ra [14]. Hoạt hóa tiểu cầu Khi tiểu cầu đến khu vực mạch máu bị tổn thương, chúng được kích hoạt bởi một loạt chất chủ vận bao gồm ADP, thrombin, thromboxanes… tương tác với các thụ thể xuyên màng [16]. Kết quả quá trình hoạt động chuyển hóa trong nồng độ cao của Ca++ bào tương và phosphoryl hóa các protein bề mặt mang lại thay đổi hình dạng tiểu cầu, giải phóng các chất trong hạt α và hạt đặc, kích thích phospholipase A2 và giải phóng thromboxan A2 (TXA2), cảm ứng bề mặt gây đông máu và kích hoạt thụ thể GPIIb/IIIa. TXA2 được tổng hợp bởi tiểu cầu kích hoạt từ acid arachidonic thông qua con đường cyclooxigennase (COX), sau khi hình thành TXA2 khuếch tán qua màng tế bào và kích hoạt tiểu cầu khác.
Ở các tiểu cầu TXA2 liên kết với các thụ thể, cặp đôi với G-protein (Gq , G12 , hoặc G13) tất cả đều kích hoạt phospholipase C.