Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu thực vật thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài phong quỳ sa pa anemone chapaensis gagnep ranunculaceae

Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài Phong Quỳ Sa Pa Anemone chapaensis Gagnep, thuộc họ Ranunculaceae.

• Tác giả: Hà Thị Thanh Hương
• Người hướng dẫn: PGS. Phương Thiện Thương
• Trường học: Viện Dược liệu
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Phong Quỳ Sa Pa
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• Danh mục chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về thực vật học chi Anemone
• 1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Anemone
• 1.3. Thành phần hóa học của chi Anemone
• 1.4. Công dụng của một số loài thuộc chi Anemone trong y học cổ truyền
• 1.5. Tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Anemone
• 1.6. Tổng quan về loài Phong quỳ sa pa
• 1.7. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố và sinh thái của loài Phong quỳ sa pa Anemone chapaensis Gagnep.
• 1.8. Thành phần hóa học của loài Phong quỳ sa pa
• 1.9. Một số công dụng và tác dụng sinh học của loài Phong quỳ sa pa
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên, vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nguyên liệu nghiên cứu
• 2.3. Thuốc thử, hóa chất, dung môi. Máy móc, trang thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Nghiên cứu về thực vật học
• 2.4.2. Nghiên cứu về hóa học
• 2.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả nghiên cứu về thực vật
• 3.1.1. Thẩm định tên khoa học
• 3.1.2. Đặc điểm hình thái thực vật
• 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu
• 3.1.4. Đặc điểm bột dược liệu
• 3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học
• 3.2.1. Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ
• 3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất
• 3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ loài Phong quỳ sa pa
• 3.3. Tác dụng sinh học
• 3.3.1. Đánh giá tác dụng chống viêm
• 3.3.2. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7
• 3.3.3. Tác dụng ức chế sự biểu hiện của protein COX-2
• 3.3.4. Tác dụng gây độc tế bào ung thư
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về thực vật học
• 4.2. Kết quả định tính
• 4.3. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất
• 4.4. Về tác dụng sinh học
• 4.4.1. Về tác dụng ức chế sự sản sinh NO
• 4.4.2. Về tác dụng ức chế sự biểu hiện của protein COX-2
• 4.4.3. Về tác dụng gây độc với các tế bào ung thư
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• 4.5. Về thực vật học
• 4.6. Về tác dụng sinh học
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến Luận án

Tóm tắt

I. Thành phần hóa học của cây Phong Quỳ Sa Pa

Thành phần hóa học của cây Phong Quỳ Sa Pa (Anemone chapaensis Gagnep.) là trọng tâm nghiên cứu trong luận án. Các hợp chất chính được phân lập bao gồm triterpenoid, saponin, flavonoid, và coumarin. Các nghiên cứu định tính và phân lập đã xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất này, đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về giá trị dược liệu của loài cây này. Các phương pháp như sắc ký cột và phổ NMR được sử dụng để phân tích và xác định cấu trúc.

1.1. Triterpenoid và saponin

Triterpenoid và saponin là nhóm hợp chất chính được tìm thấy trong cây Phong Quỳ Sa Pa. Các hợp chất này có khung cơ bản oleanan, ursan, và lupan. Các nghiên cứu đã phân lập được các hợp chất như acid oleanolic, acid ursolic, và acid betulinic. Những hợp chất này có tiềm năng lớn trong việc phát triển các dược phẩm tự nhiên.

1.2. Flavonoid và coumarin

Flavonoid và coumarin cũng được phân lập từ cây Phong Quỳ Sa Pa. Các hợp chất này có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm, góp phần vào việc ứng dụng trong y học cổ truyền và hiện đại. Các phương pháp phân tích như sắc ký lớp mỏng và phổ khối lượng đã được sử dụng để xác định cấu trúc của các hợp chất này.

II. Tác dụng sinh học của cây Phong Quỳ Sa Pa

Tác dụng sinh học của cây Phong Quỳ Sa Pa được đánh giá thông qua các thí nghiệm in vitro. Các hợp chất phân lập từ cây này đã thể hiện khả năng chống viêm, ức chế sản sinh NO, và gây độc tế bào ung thư. Những kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm và ung thư.

2.1. Tác dụng chống viêm

Các hợp chất từ cây Phong Quỳ Sa Pa đã được thử nghiệm trên mô hình đại thực bào RAW264.7 để đánh giá khả năng chống viêm. Kết quả cho thấy các hợp chất này có khả năng ức chế sự sản sinh NO và biểu hiện của protein COX-2, hai yếu tố quan trọng trong quá trình viêm.

2.2. Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Các hợp chất phân lập từ cây Phong Quỳ Sa Pa cũng được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư như HeLa và HepG2. Kết quả cho thấy các hợp chất này có khả năng gây độc tế bào ung thư với giá trị IC50 thấp, mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.

III. Nghiên cứu dược liệu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu dược liệu về cây Phong Quỳ Sa Pa không chỉ dừng lại ở việc phân tích thành phần hóa học và tác dụng sinh học mà còn hướng đến việc ứng dụng thực tiễn. Các kết quả nghiên cứu đã cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng loài cây này trong y học cổ truyền và phát triển các dược phẩm tự nhiên.

3.1. Ứng dụng trong y học cổ truyền

Cây Phong Quỳ Sa Pa đã được người dân địa phương sử dụng để điều trị các bệnh như viêm họng, viêm túi mật, và đau dạ dày. Nghiên cứu này đã xác nhận các tác dụng dược lý của cây, hỗ trợ việc sử dụng trong y học cổ truyền.

3.2. Phát triển dược phẩm tự nhiên

Các hợp chất phân lập từ cây Phong Quỳ Sa Pa có tiềm năng lớn trong việc phát triển các dược phẩm tự nhiên để điều trị viêm nhiễm và ung thư. Nghiên cứu này đóng góp vào việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý của Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ Dược học với đề tài "Nghiên cứu thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep., Ranunculaceae)" do nghiên cứu sinh Hà Thị Thanh Hương thực hiện tại Viện Dược liệu, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Phương Thiện Thương và PGS. Nguyễn Minh Khởi.

Tính cấp thiết của luận án bắt nguồn từ thực tiễn phân loại học và giá trị dược liệu của loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.). Đây là loài thực vật đặc hữu của vùng núi Sa Pa, tỉnh Lào Cai, được nhà thực vật học người Pháp Françoise Gagnepain công bố từ năm 1929. Trong tri thức bản địa, thân rễ của loài cây này đã được nhân dân địa phương sử dụng làm thuốc điều trị viêm họng, viêm túi mật, đau dạ dày, đau răng và phong thấp đau nhức xương khớp. Tuy nhiên, trước thời điểm luận án triển khai, các đặc điểm hình thái thực vật của loài chỉ mới được ghi chép sơ lược, đồng thời tồn tại quan điểm học thuật tranh luận về vị trí phân loại học (giữa việc coi đây là loài riêng biệt hay chỉ là đồng danh của Anemone howellii Jeffrey et W. W. Smith). Đặc biệt, tồn tại một khoảng trống nghiên cứu hoàn toàn về mặt hóa học và hoạt tính sinh thái/dược lý: chưa từng có công trình nào khảo sát thành phần hóa học cũng như đánh giá tác dụng sinh học thực nghiệm nhằm cung cấp luận cứ khoa học giải thích kinh nghiệm sử dụng của nhân dân.

Luận án xác định 03 mục tiêu nghiên cứu cụ thể được đánh số như sau:

1. Thẩm định tên khoa học của mẫu nghiên cứu thuộc loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.), họ Mao lương (Ranunculaceae), mô tả được các đặc điểm hình thái thực vật và hình thái vi học của loài này.
2. Xác định được về thành phần hóa học của loài Phong quỳ sa pa: định tính các nhóm chất, phân lập được các hợp chất chính và xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
3. Đánh giá được một số tác dụng sinh học trên mô hình in vitro của các hợp chất phân lập từ loài Phong quỳ sa pa.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Toàn bộ các bộ phận cây Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.), bao gồm cả phần trên mặt đất (thân mang hoa, lá, hoa, quả) và phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ).
• Phạm vi không gian: Mẫu thực vật phục vụ nghiên cứu được thu thập tự nhiên tại khu vực đèo Hoàng Liên và thị trấn Sa Pa (ở độ cao khoảng 1500–1800 m), huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai.
• Phạm vi thời gian: Thời điểm thu thập mẫu thực vật diễn ra vào tháng 9 năm 2013 và tháng 5 năm 2015.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Về phân loại học chi Anemone: Họ Ranunculaceae được Antoine Laurent de Jussieu xác lập năm 1789 thuộc bộ Ranunculales. Mặc dù Thorne, R. từng xếp họ này vào bộ Berberidales, quan điểm hiện đại của Williams, D. (2009) và hệ thống APG (Angiosperm Phylogeny Group) đã thống nhất xếp Ranunculaceae trong bộ Ranunculales. Theo APG, họ Ranunculaceae gồm khoảng 2.500 loài thuộc hơn 60 chi, chia làm 2 phân họ và 5 tông, trong đó chi Anemone thuộc phân họ Ranunculoideae, tông Anemoneae. Chi Anemone do Linnaeus, C. công bố lần đầu năm 1753 trong tác phẩm Species Plantarum với 8 loài. Theo Tamura, M., chi này có khoảng 150 loài; Ziman, S. ghi nhận từ 118 đến 200 loài; thống kê của cơ sở dữ liệu The Plant List (2018) chấp nhận 222 tên loài. Thực vật chí Trung Quốc ghi nhận 53 loài (với 22 loài đặc hữu).

Tại Việt Nam, các công bố về chi Anemone (chi Phong quỳ) ghi nhận sự đóng góp của các tác giả:

• Françoise Gagnepain (1929) công bố 2 loài mới trên Bulletin de la Société Botanique de France: Anemone chapaensis Gagnep. và Anemone poilanei Gagnep.
• Phạm Hoàng Hộ (1999) trong Cây cỏ Việt Nam và Nguyễn Tiến Bân (2003) trong Danh lục các loài thực vật Việt Nam (Tập II) ghi nhận 5 loài: A. chapaensis, A. japonica, A. poilanei, A. rivularis, A. sumatrana.
• Võ Văn Chi (2012) trong Từ điển cây thuốc Việt Nam nêu 2 loài làm thuốc (A. japonica, A. rivularis).
• Viện Dược liệu (2016) trong Danh lục cây thuốc Việt Nam bổ sung loài A. vitifolia. Như vậy tổng số loài được ghi nhận tại Việt Nam là 6 loài, phân bố chủ yếu ở vùng rừng núi cao.

Về vị trí phân loại của loài Anemone chapaensis: Năm 2014, Zhang Yu và Yang Qin cho rằng A. chapaensis là đồng danh của A. howellii Jeffrey et W. W. Smith (1916). Tuy nhiên, quan điểm của Gagnepain (1929), Ziman (2007) và cơ sở dữ liệu The Plant List tiếp tục bảo lưu A. chapaensis là một loài riêng biệt, phân biệt với A. howellii thông qua nhiều tiêu chí hình thái sai khác rõ rệt:

Bộ phận thực vật	Đặc điểm loài A. chapaensis (Gagnepain, 1929)	Đặc điểm loài A. howellii (Jeffrey & Smith, 1916)
Đặc điểm lá	Không có lông mi; 5–7 lá	Có lông mi; 3–5 (-10) lá
Cuống lá	Dài 14–16 cm	Dài 8–15 cm
Gân lá	Nhiều gân mạng	Không có mạng gân rõ
Trục hoa	Dài 35–60 cm	Dài 20–30 cm
Số lượng hoa trong cụm	Thường 5–9 (hiếm 3–4)	Thường 3–5 (-7)
Lá bắc cụm hoa	6–7 lá; kích thước lớn hơn lá bắc của A. howellii từ 4–5 lần	3–5 lá
Kích thước bao phấn	Dài 1,5 mm	Dài 1,0 mm

Về thành phần hóa học và tác dụng sinh học: Hơn 300 hợp chất đã được phân lập từ các loài trong chi Anemone, chủ yếu bởi các nhà khoa học Trung Quốc. Nhóm chính gồm triterpenoid (13 hợp chất thuộc khung oleanan, ursan, lupan) và saponin (205 hợp chất, trong đó 201 chất có aglycon khung oleanan, tiêu biểu là acid oleanolic). Ngoài ra còn có coumarin (11 chất), flavonoid (11 chất), dẫn chất acid phenolic (15 chất), steroid, tinh dầu. Các nghiên cứu dược lý quốc tế đã chứng minh các loài A. flaccida, A. raddeana, A. rivularis, A. altaica, A. taipaiensis, A. tomentosa có tác dụng chống viêm (ức chế TNF-α, IL-6, COX-2, iNOS, ức chế phosphoryl hóa MAPK và yếu tố nhân NF-κB trên tế bào RAW264.7; giảm phù chân chuột gây bởi carrageenan), chống ung thư (thử nghiệm MTT trên HeLa, HepG2, BGC-823, HUVEC, HOS, U2OS, PC-3, v.v.), chống oxy hóa, hạ sốt giảm đau, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án giải quyết: Mặc dù các loài cùng chi đã được nghiên cứu sâu rộng trên thế giới, nhưng loài đặc hữu Anemone chapaensis Gagnep. tại Sa Pa chưa từng có bất kỳ dữ liệu nào về thành phần hóa thực vật và tác dụng dược lý thực nghiệm. Luận án được thực hiện nhằm lấp đầy toàn bộ khoảng trống này, từ định danh hình thái, vi học đến cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học phân tử in vitro.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Luận án áp dụng hệ thống phân loại thực vật hiện đại APG (Angiosperm Phylogeny Group), đối chiếu với các tài liệu chuẩn mực như khóa phân loại của Ziman, S. (2007), Flora of China (Wang Wencai và cộng sự, 2001), bản mô tả gốc của Gagnepain, F. (1929) và Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (1999). Tiếp cận nghiên cứu hóa thực vật theo chu trình chuẩn: chiết xuất phân đoạn, phân lập sắc ký và giải cấu trúc bằng phổ phối hợp. Về tác dụng sinh học, khung đánh giá bám sát cơ chế viêm qua con đường LPS/iNOS/NO và enzym COX-2 trên đại thực bào, cùng mô hình gây độc tế bào ung thư thông qua hoạt tính dehydrogenase ti thể.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

1. Nghiên cứu thực vật học:

• Quan sát hình thái học thực địa và phòng thí nghiệm bằng kính lúp, kính hiển vi và máy ảnh chuyên dụng (Canon 60D, ống kính macro Tamron 60 mm F/2).
• Thu hái, xử lý mẫu tiêu bản thực vật khô lưu trữ tại Khoa Tài nguyên Dược liệu (Viện Dược liệu) và Bảo tàng Sinh vật (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội).
• Nghiên cứu giải phẫu vi học: Cắt lát vi phẫu tươi lá, thân rễ, rễ nhỏ; soi bột dược liệu phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất dưới kính hiển vi quang học Axioskop 40 (Carl Zeiss).

2. Nghiên cứu hóa học:

• Phương pháp định tính: Thực hiện các phản ứng hóa học ống nghiệm đặc trưng nhằm phát hiện các nhóm chất hữu cơ tự nhiên trong dịch chiết thân rễ và phần trên mặt đất.
• Chiết xuất và phân lập: Dược liệu khô xay nhỏ được ngâm chiết kiệt với ethanol 96% ở nhiệt độ phòng (3 lần, mỗi lần 4 ngày, tổng lượng dung môi 15 L). Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cắn toàn phần. Cắn chiết được phân đoạn lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần. Tách và tinh chế các chất bằng sắc ký cột cổ điển (CC) sử dụng chất hấp phụ pha thường Silica gel (cỡ hạt 63–200 μm, Merck) và sắc ký pha đảo RP-18 (30–50 μm, Fuji Silysia), theo dõi quá trình phân tách trên bản mỏng Silica gel F254 và RP-18 F254.
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học: Xác định độ quay cực bằng máy phân cực JASCO P-2000 polarimeter; đo điểm nóng chảy trên máy Gallenkamp; đo phổ hồng ngoại (IR) trên máy GX-PerkinElmer; phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử ESI-MS trên máy Agilent 1100 LC-MSD Trap và Agilent 1260; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS trên thiết bị Varian 910 TQ-FTMS; các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, NOESY) ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (tần số 500 MHz cho 1H).
• Phương pháp xác định đơn vị đường: Phân tích cấu hình lập thể các phân tử đường của saponin mới (ACL1) thông qua thủy phân acid (dung dịch mẫu thử 2 mg/mL trong HCl 1,0 M, đun hồi lưu trong 2 giờ). Phần đường được tạo dẫn xuất với L-cysteine methyl ester hydrochlorid trong pyridin khan (0,06 M, 60°C trong 2 giờ) và trimethylsilylimidazol (đun tiếp 2 giờ). Sản phẩm dẫn xuất TMS được phân tích trên hệ thống sắc ký khí phối phổ GC-MS (Shimadzu GC-2010 plus QP2020, cột mao quản Shimadzu SH-Rxi-5 Sil: 0,25 mm ID × 30 m; nhiệt độ cột 210°C, đầu dò FID 300°C, nhiệt độ tiêm 270°C, khí mang Heli tốc độ dòng 30 mL/phút, tỷ lệ tách dòng 1/20), đối chiếu thời gian lưu với các mẫu đường chuẩn D-glucose, L-arabinose, D-ribose, L-rhamnose (Sigma-Aldrich).

3. Nghiên cứu tác dụng sinh học:

• Khảo nghiệm độc tính tế bào trên đại thực bào RAW264.7: Nuôi cấy dòng tế bào RAW264.7 (cung cấp bởi Khoa Dược, Đại học Kangwon, Hàn Quốc) trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS, penicilin (100 unit/mL), streptomicin (100 μg/mL) và L-glutamin (2 mM) ở 37°C, 5% CO2. Thử nghiệm sống sót của tế bào thực hiện bằng phương pháp so màu khử muối tetrazolium MTT sau 72 giờ ủ mẫu, đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 570 nm.
• Khảo nghiệm ức chế sản sinh NO: Đại thực bào RAW264.7 (mật độ 5 × 10^4 tế bào/giếng) được ủ với mẫu thử trong 2 giờ trước khi kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL) trong 24 giờ. Nồng độ ion nitrite trong môi trường được xác định qua phản ứng Griess (thuốc thử gồm sulfanilamid 1% và n-1-naphthylethylenediamin dihydrochlorid 0,1% trong acid phosphoric 5%), đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm trên máy đọc ELISA. Đối chứng dương sử dụng cardamonin (10 μM) và butein (10 μM). Giá trị IC50 được xác định bằng phương pháp hồi quy phi tuyến tính Sigmoidal dose-response trên phần mềm GraphPad Prism 6 và Microsoft Excel 2016.
• Đánh giá ức chế biểu hiện protein COX-2 bằng kỹ thuật Western Blot: Đại thực bào RAW264.7 (1,0 × 10^5 tế bào/mL) được xử lý với hợp chất ACR2 và kích thích bởi LPS (0,1 μg/mL) trong 24 giờ. Tế bào được ly giải bằng lysis buffer trong 30 phút, đo hàm lượng protein bằng thuốc thử Bradford 5x ở bước sóng 595 nm dựa trên đường chuẩn BSA. Điện di protein trên gel polyacrylamid 8% SDS-PAGE, chuyển lên màng nitrocellulose (0,45 μm) trong 45 phút. Màng được ủ với kháng thể sơ cấp kháng COX-2 (chuột đơn dòng mouse anti COX-2, Invitrogen 35-8200) và kháng thể sơ cấp đa dòng thỏ kháng α-tubulin (Invitrogen PA5-16891) ở tỷ lệ pha loãng 1:2000 qua đêm tại 4°C. Sau đó ủ với kháng thể thứ cấp gắn enzyme tương ứng (tỷ lệ 1:2000) trong 2 giờ. Mức độ biểu hiện protein được phát hiện bằng bộ kit phát quang hóa học và ghi nhận tín hiệu bằng hệ thống máy chụp gel Azure C300. Protein α-tubulin được dùng làm chứng nội kiểm.
• Khảo nghiệm gây độc tế bào ung thư người: Thử nghiệm trên 09 dòng tế bào ung thư gồm: HepG2 (ung thư gan), A549 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), OVCAR-8 (ung thư buồng trứng), NCI-N87 (ung thư biểu mô dạ dày), HeLa (ung thư cổ tử cung), RD (ung thư màng tim), PANC-1 (ung thư tuyến tụy), MIA Paca-2 (ung thư tuyến tụy), do Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) cung cấp. Tác dụng gây độc tế bào được xác định bằng phương pháp MTT sau 48 giờ nuôi cấy ở các dải nồng độ thử nghiệm (100; 20; 4; 0,8 μg/mL). Đo quang phổ ở bước sóng 540 nm. Doxorubicin được sử dụng làm chất đối chứng dương (nồng độ 30; 10; 5; 1 μM), dung môi DMSO 0,1% làm đối chứng âm. Tính toán giá trị IC50 dựa trên phần mềm TableCurve 2Dv4.

4. Xử lý số liệu: Dữ liệu thực nghiệm được đo lặp lại độc lập ít nhất 3 lần (n = 3), kết quả biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD), xử lý bằng Microsoft Excel 2016.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện các dữ liệu thứ cấp về phân loại học, thực vật học, thành phần hóa học, công dụng y học cổ truyền và dược lý thực nghiệm của chi Anemone trên thế giới và tại Việt Nam:

• Xác lập vị trí phân loại học của chi Anemone trong họ Ranunculaceae, phân họ Ranunculoideae, tông Anemoneae. Tổng hợp danh mục 6 loài thuộc chi Phong quỳ ghi nhận ở Việt Nam: A. chapaensis, A. japonica, A. poilanei, A. rivularis, A. sumatrana, A. vitifolia.
• Thống kê chi tiết thành phần hóa học của chi Anemone với hơn 300 hợp chất đã biết: bảng danh mục 13 triterpenoid tự do (khung oleanan, ursan, lupan); cấu trúc hóa học của 205 hợp chất saponin (trong đó có 201 saponin khung oleanan mang aglycon chính là acid oleanolic); danh mục các hợp chất thuộc nhóm coumarin, flavonoid, lignan, steroid, dẫn chất acid phenolic và tinh dầu.
• Phân tích tri thức y học cổ truyền thế giới đối với 25 loài/phân loài Anemone (điều trị thấp khớp, viêm đường tiết niệu, ho, loét da, vết thương); và công dụng chữa bệnh của 4 loài tại Việt Nam (A. chapaensis, A. japonica, A. rivularis, A. vitifolia).
• Tổng thuật các nghiên cứu dược lý thực nghiệm về tác dụng chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, giảm đau, hạ sốt, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn của dịch chiết và các saponin tinh khiết từ chi Anemone.
• Khái quát lịch sử nghiên cứu loài Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.): tổng hợp các mô tả hình thái của Gagnepain (1929) và Phạm Hoàng Hộ (1999); phân tích căn cứ bảo lưu tính độc lập của loài trước quan điểm gộp loài của Zhang Yu và Yang Qin (2014); khẳng định sự thiếu vắng dữ liệu hóa thực vật và tác dụng sinh học thực nghiệm trước thời điểm thực hiện luận án.

Chương 2: Nguyên vật liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết các đối tượng thực nghiệm, hóa chất, chủng tế bào, trang thiết bị kỹ thuật và quy trình thao tác chuẩn:

• Nguồn gốc nguyên liệu thực vật: Cây Phong quỳ sa pa toàn phần thu hái tại đèo Hoàng Liên, Sa Pa, Lào Cai vào tháng 9/2013 và tháng 5/2015. Tiêu bản lưu tại Viện Dược liệu và Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. Mẫu phục vụ hóa học và hoạt tính sinh học thu hái tại thị trấn Sa Pa ở độ cao 1500–1800 m vào tháng 9/2013, làm sạch, sấy khô ở 50°C và nghiền nhỏ.
• Quy chuẩn hóa chất, dung môi, chất chuẩn: Silica gel pha thường, pha đảo RP-18; chất đối chứng dương cardamonin, butein, quercetin, doxorubicin; các đường chuẩn monosaccarid (D-glucose, L-arabinose, D-ribose, L-rhamnose); môi trường nuôi cấy DMEM, FBS, kháng sinh.
• Nguồn gốc 1 dòng đại thực bào RAW264.7 (Hàn Quốc) và 9 dòng tế bào ung thư người (KRIBB, Hàn Quốc: HepG2, A549, MCF7, OVCAR-8, NCI-N87, HeLa, RD, PANC-1, MIA Paca-2).
• Danh mục máy móc phân tích hiện đại: Kính hiển vi Axioskop 40, máy đo UV-1800 Shimadzu, IR GX-PerkinElmer, ESI-MS Agilent 1100 và 1260, HR-ESI-MS Varian 910 TQ-FTMS, Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, GC-MS Shimadzu GC-2010 plus, máy chụp gel Azure C300, đầu đọc ELISA Epoch Biotek.
• Quy trình chuẩn hóa thực nghiệm: Phương pháp thẩm định mẫu thực vật, phân tích vi phẫu giải phẫu và bột dược liệu; quy trình chiết xuất kiệt bằng cồn 96%, tách phân đoạn và sắc ký cột tinh chế; quy trình đo phổ và dẫn xuất hóa đường phân tích bằng GC-MS; quy trình nuôi cấy tế bào, thử nghiệm Griess, thử nghiệm MTT và Western Blot xác định mức độ biểu hiện protein COX-2.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm gốc thu được từ ba mảng nghiên cứu:

• Kết quả thực vật học: Thẩm định chính xác mẫu nghiên cứu là Anemone chapaensis Gagnep. (họ Ranunculaceae). Hoàn thiện bản mô tả chi tiết hình thái thực vật của cây. Mô tả đặc điểm giải phẫu vi phẫu rễ nhỏ, vi phẫu thân rễ, vi phẫu lá và các cấu tử đặc trưng của bột phần trên mặt đất cũng như bột phần dưới mặt đất của loài.
• Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học:
  • Kết quả định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ chính có trong phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất.
  • Sơ đồ chiết xuất, phân lập: Từ phần trên mặt đất đã phân lập được 11 hợp chất sạch, ký hiệu từ ACL1 đến ACL11. Từ phần dưới mặt đất đã phân lập được 4 hợp chất sạch, ký hiệu từ ACR1 đến ACR4.
  • Kết quả giải cấu trúc hóa học: Xác định đầy đủ cấu trúc hóa học dựa trên số liệu phân tích phổ 1D-NMR, 2D-NMR (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), MS, HR-ESI-MS, IR và độ quay cực. Trong đó, cấu trúc của hợp chất ACL1 được xác định là một saponin mới; cấu hình của các gốc đường trong phân tử ACL1 được khẳng định nhờ sắc ký khí GC-MS sau khi thủy phân acid và dẫn xuất hóa trimethylsilyl (TMS). Các hợp chất saponin phân lập từ phần trên mặt đất gồm ACL1, ACL2, ACL3, ACL4; các hợp chất saponin từ phần dưới mặt đất gồm ACR1, ACR2, ACR3.
• Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học:
  • Đánh giá độc tính trên tế bào đại thực bào RAW264.7: Xác định nồng độ không gây độc của các hợp chất thử nghiệm.
  • Đánh giá tác dụng ức chế sản sinh NO: Xác định phần trăm ức chế và giá trị IC50 của các hợp chất phân lập được từ loài Phong quỳ sa pa trên mô hình đại thực bào RAW264.7 bị kích thích bởi LPS.
  • Đánh giá ức chế biểu hiện protein COX-2: Kết quả Western Blot chứng minh hợp chất ACR2 có tác dụng ức chế rõ rệt sự biểu hiện của protein gây viêm COX-2 so với nhóm chứng LPS.
  • Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư: Số liệu thực nghiệm sàng lọc và giá trị IC50 của các hợp chất trên 09 dòng tế bào ung thư người (HepG2, A549, MCF7, OVCAR-8, NCI-N87, HeLa, RD, PANC-1, MIA Paca-2), đối chiếu với chất chuẩn Doxorubicin.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 thực hiện phân tích, so sánh và lý giải sâu các phát hiện nghiên cứu:

• Bàn luận về mặt thực vật học: Đối chiếu các đặc điểm giải phẫu, vi phẫu và hình thái của mẫu thu thập với các mô tả của Gagnepain (1929) và Wang Wencai (2001). Khẳng định tính nhất quán và tính đặc hữu của loài Anemone chapaensis, củng cố cơ sở khoa học bác bỏ việc đồng nhất hóa loài này với A. howellii.
• Bàn luận về kết quả hóa học: Phân tích quy luật phân bố của các nhóm chất; biện luận chi tiết quá trình giải mã cấu trúc phân tử của hợp chất mới ACL1 và các saponin ACL2–ACL4, ACR1–ACR3 dựa trên tương tác tầm xa HMBC, tương tác không gian NOESY và dữ liệu phân giải khối phổ cao HR-ESI-MS. So sánh các hợp chất phân lập được với các triterpenoid và saponin đã từng được phát hiện trong chi Anemone.
• Bàn luận về tác dụng sinh học:
  • Phân tích mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính ức chế sản sinh chất trung gian gây viêm NO trên đại thực bào RAW264.7 của các saponin khung oleanan.
  • Phân tích cơ chế chống viêm mức độ phân tử thông qua tác động ức chế dịch mã hoặc làm suy giảm biểu hiện protein COX-2 của hợp chất ACR2.
  • Đánh giá mức độ nhạy cảm của từng dòng tế bào ung thư người đối với các hợp chất thử nghiệm; đối chiếu độc tính chọn lọc giữa các saponin và các nhóm hợp chất khác; thảo luận cơ sở khoa học ủng hộ kinh nghiệm sử dụng thân rễ loài Phong quỳ sa pa làm thuốc tiêu viêm, giảm đau trong y học dân gian.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Đóng góp về thực vật học: Luận án đã thẩm định chính xác tên khoa học của mẫu nghiên cứu thu hái tại Sa Pa là Anemone chapaensis Gagnep., thuộc họ Mao lương (Ranunculaceae). Lần đầu tiên cung cấp bộ dữ liệu hoàn chỉnh, có hệ thống và chi tiết về đặc điểm hình thái thực vật, cấu tạo giải phẫu vi phẫu rễ nhỏ, thân rễ, lá và đặc điểm hiển vi của bột dược liệu phần trên mặt đất và phần dưới mặt đất. Kết quả này bổ sung bằng chứng khoa học khẳng định vị trí phân loại độc lập của loài đặc hữu Phong quỳ sa pa trong hệ thực vật Việt Nam.
2. Đóng góp về hóa thực vật: Đây là công trình đầu tiên trên thế giới nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học của loài Anemone chapaensis Gagnep. Luận án đã định tính các nhóm chất chính; phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 15 hợp chất sạch (11 hợp chất từ phần trên mặt đất: ACL1–ACL11 và 04 hợp chất từ phần dưới mặt đất: ACR1–ACR4). Trong đó, đã phát hiện và xác định cấu trúc của 01 hợp chất saponin mới (ACL1), bao gồm cả việc xác lập cấu hình tuyệt đối của các phân tử đường cấu thành bằng phương pháp GC-MS.
3. Đóng góp về tác dụng sinh học: Lần đầu tiên cung cấp các bằng chứng thực nghiệm sinh học in vitro của các hợp chất phân lập từ loài Phong quỳ sa pa:

• Chứng minh hoạt tính chống viêm thông qua khả năng ức chế mạnh sự sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7 bị kích thích bởi LPS.
• Làm sáng tỏ cơ chế chống viêm của hợp chất ACR2 thông qua việc ức chế sự biểu hiện của protein COX-2 bằng phương pháp Western Blot.
• Xác định hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập trên 09 dòng tế bào ung thư người (HepG2, A549, MCF7, OVCAR-8, NCI-N87, HeLa, RD, PANC-1, MIA Paca-2). Kết quả này cung cấp luận cứ khoa học giải thích và chứng minh kinh nghiệm dân gian trong việc dùng thân rễ cây để chữa viêm họng, viêm túi mật, phong thấp đau nhức.

Kiến nghị và đề xuất giải pháp

• Tiếp tục nghiên cứu mở rộng về các tác dụng dược lý in vivo trên các mô hình động vật thực nghiệm (như mô hình viêm khớp, mô hình giảm đau) đối với các phân đoạn giàu hoạt tính hoặc các saponin chính (như ACR2, ACL1) của cây Phong quỳ sa pa.
• Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử gây độc tế bào ung thư của các hợp chất có hoạt tính cao (đánh giá con đường chết theo chương trình apoptosis, biểu hiện của họ enzym caspase, protein Bax, Bcl-2).
• Cần có các biện pháp bảo tồn nguồn gen thực vật đặc hữu quý hiếm này tại Vườn Quốc gia Hoàng Liên (Sa Pa, Lào Cai), đồng thời nghiên cứu quy trình nhân giống, trồng trọt và khai thác bền vững nhằm phục vụ phát triển dược liệu trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

• Phạm vi khảo sát thực vật và mẫu phân tích mới chỉ giới hạn tại vùng núi Sa Pa, tỉnh Lào Cai (nơi loài được công bố là đặc hữu), chưa có điều kiện khảo sát mở rộng tại các vùng núi cao lân cận thuộc dãy Hoàng Liên Sơn.
• Các khảo sát tác dụng sinh học mới chỉ dừng lại ở quy mô thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào đại thực bào RAW264.7 và các dòng tế bào ung thư người; chưa thực hiện được các thử nghiệm dược lý in vivo trên động vật sống để đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn cũng như hiệu lực chống viêm toàn thân.
• Thử nghiệm đánh giá cơ chế ức chế biểu hiện protein COX-2 bằng Western Blot mới chỉ tiến hành đại diện trên 01 hợp chất là ACR2 từ phần dưới mặt đất.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Đánh giá hoạt tính chống viêm, giảm đau và độc tính trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).
• Khảo sát sâu hơn các con đường truyền tín hiệu nội bào khác liên quan đến viêm (như con đường NF-κB, MAPK, iNOS) đối với các saponin khung oleanan phân lập được.
• Xây dựng quy trình định lượng các hoạt chất chính làm chất điểm chỉ (marker) để tiêu chuẩn hóa chất lượng dược liệu Phong quỳ sa pa phục vụ kiểm nghiệm.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật cao, phục vụ thiết thực cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Dược học, Hóa hợp chất thiên nhiên và Thực vật học: Có thể tham khảo phương pháp luận giải phẫu vi học thực vật chi Anemone, quy trình phân lập các hợp chất saponin triterpenoid bằng sắc ký phân đoạn, kỹ thuật giải phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2D (HMBC, NOESY) và phương pháp xác định cấu hình đường bằng GC-MS dẫn xuất TMS.
• Các nhà nghiên cứu dược lý và miễn dịch học: Tham khảo quy trình chuẩn hóa sàng lọc hoạt tính kháng viêm trên mô hình ức chế NO và bán định lượng protein COX-2 bằng Western Blot trên tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích bởi LPS.
• Các nhà quản lý tài nguyên dược liệu và bảo tồn sinh học: Luận án cung cấp căn cứ pháp lý và phân loại học chuẩn xác để đưa loài thực vật đặc hữu Anemone chapaensis Gagnep. vào danh mục bảo tồn và định hướng khai thác, phát triển nguồn gen cây thuốc quý tại Sa Pa.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã giải quyết tranh luận phân loại học giữa loài Anemone chapaensis và Anemone howellii dựa trên những căn cứ thực chứng nào?
Luận án đã đối chiếu thực nghiệm các mẫu thu thập được tại Sa Pa với mô tả gốc của Gagnepain (1929) và bản mô tả của Jeffrey và Smith (1916). Kết quả chỉ ra các khác biệt hình thái có giá trị phân loại mang tính quyết định: A. chapaensis có lá không có lông mi, phiến lá chia 3 thùy mang nhiều gân mạng rõ rệt, cuống lá dài 14–16 cm; cụm hoa có trục dài 35–60 cm mang 5–9 hoa; lá bắc cụm hoa gồm 6–7 lá với kích thước lớn gấp 4–5 lần lá bắc của A. howellii (loài A. howellii chỉ có 3–5 lá bắc, cụm hoa 3–5 hoa, cuống lá 8–15 cm và lá có lông mi). Điều này khẳng định A. chapaensis là loài độc lập, không phải là đồng danh của A. howellii.

2. Tổng số có bao nhiêu hợp chất tinh khiết được phân lập và cấu trúc của chúng thuộc những nhóm chất nào?
Tổng cộng 15 hợp chất tinh khiết đã được chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc từ cây Phong quỳ sa pa. Trong đó, có 11 hợp chất phân lập từ phần trên mặt đất (ký hiệu ACL1–ACL11) và 04 hợp chất phân lập từ phần dưới mặt đất (ký hiệu ACR1–ACR4). Các hợp chất phân lập chủ yếu thuộc nhóm saponin triterpenoid khung oleanan (tiêu biểu như ACL1–ACL4 và ACR1–ACR3), cùng một số hợp chất hữu cơ khác. Đặc biệt, hợp chất ACL1 được xác định là một saponin mới.

3. Cấu hình của các gốc đường cấu thành hợp chất saponin mới ACL1 được xác định bằng phương pháp thực nghiệm nào?
Cấu hình lập thể tuyệt đối của các gốc monosaccarid trong phân tử saponin mới ACL1 được xác định bằng phương pháp sắc ký khí phối phổ (GC-MS). Mẫu ACL1 được thủy phân cắt liên kết glycosid bằng dung dịch acid HCl 1,0 M ở nhiệt độ hồi lưu trong 2 giờ. Sau khi xử lý và làm khô, các phân tử đường giải phóng được dẫn xuất hóa hai bước: phản ứng với L-cysteine methyl ester hydrochlorid trong pyridin khan ở 60°C trong 2 giờ, tiếp theo là phản ứng silyl hóa với trimethylsilylimidazol trong 2 giờ. Dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) thu được được phân tích trên hệ thống Shimadzu GC-2010 plus (cột SH-Rxi-5 Sil) và so sánh thời gian lưu với các mẫu đường chuẩn D-glucose, L-arabinose, D-ribose, L-rhamnose đã xử lý tương đương.

4. Khảo nghiệm tác dụng chống viêm trong luận án được tiến hành trên những mô hình sinh học phân tử nào và kết quả ra sao?
Tác dụng chống viêm được thực hiện trên đại thực bào RAW264.7 bị kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL):

• Thử nghiệm ức chế sản sinh NO: Thực hiện qua phương pháp so màu Griess (đo nồng độ nitrite tại bước sóng 570 nm sau khi kiểm tra nồng độ không gây độc tế bào bằng thử nghiệm MTT). Mẫu đối chứng dương là cardamonin (10 μM) và butein (10 μM). Các saponin thử nghiệm thể hiện hoạt tính ức chế giải phóng NO theo mức độ phụ thuộc liều.
• Thử nghiệm ức chế biểu hiện protein COX-2: Thực hiện trên hợp chất ACR2 bằng kỹ thuật Western Blot sử dụng kháng thể mouse anti COX-2 và rabbit anti α-tubulin (tỷ lệ 1:2000), phát quang hóa học và chụp bằng máy Azure C300. Kết quả chứng minh ACR2 ức chế mạnh sự gia tăng biểu hiện của protein COX-2 do LPS kích thích.

5. Luận án đã đánh giá độc tính tế bào ung thư trên những dòng tế bào cụ thể nào và sử dụng phương pháp gì?
Hoạt tính gây độc tế bào được khảo sát trên 09 dòng tế bào ung thư người do Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) cung cấp, bao gồm: ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (A549), ung thư vú (MCF7), ung thư buồng trứng (OVCAR-8), ung thư biểu mô dạ dày (NCI-N87), ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư màng tim (RD), ung thư tuyến tụy (PANC-1) và ung thư tuyến tụy (MIA Paca-2). Phương pháp thử nghiệm là đo khả năng sống sót của tế bào bằng muối tetrazolium MTT sau 48 giờ tiếp xúc ở các dải nồng độ từ 0,8 đến 100 μg/mL, đo độ hấp thụ OD ở bước sóng 540 nm và tính toán giá trị IC50 qua phần mềm TableCurve 2Dv4, sử dụng Doxorubicin làm đối chứng dương.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Hà Thị Thanh Hương là công trình chuyên khảo đầu tiên nghiên cứu toàn diện và có hệ thống về loài đặc hữu Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep., họ Ranunculaceae) tại Việt Nam. Tác giả đã thẩm định chính xác tên khoa học, mô tả đầy đủ đặc điểm hình thái và giải phẫu hiển vi của cây, đồng thời phân lập và xác định cấu trúc 15 hợp chất tinh khiết (trong đó có 01 saponin mới ACL1). Các kết quả thực nghiệm sinh học đã chứng minh các saponin của cây có hoạt tính chống viêm thông qua ức chế sản sinh NO, ức chế biểu hiện protein COX-2 và gây độc trên nhiều dòng tế bào ung thư người. Công trình cung cấp luận cứ khoa học thực chứng giải thích kinh nghiệm sử dụng cây thuốc trong y học dân gian, đồng thời đóng góp dữ liệu quan trọng cho công tác bảo tồn nguồn gen dược liệu quý tại Sa Pa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về thực vật học chi Anemone 1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Anemone 1. Vị trí phân loại Trên thế giới, họ Ranunculaceae được nhà Thực vật học người Pháp – Antoine Laurent de Jussieu xác lập từ năm 1789 và ngay từ thời đó, ông đã xếp họ thực vật này (Ranunculaceae) ở trong bộ Ranunculales.

Song cho đến gần đây, vẫn có tác giả xếp họ Ranunculaceae vào bộ Berberidales – đại diện cho quan điểm này là nhà thực vật học Mỹ Thorne, R. Tuy nhiên, nhiều nhà Thực vật học khác trên thế giới, như Williams, D. (2009) [95], cũng như nhóm tác giả Angiosperm Phylogeny trong hệ thống phân loại APG (Angiosperm Phylogeny Group) [98] đều có quan điểm giống với Jussieu, A. (1789), xếp họ Ranunculaceae trong bộ Ranunculales.

Theo một số công trình đã công bố trên thế giới, Ranunculaceae là họ thực vật lớn, với tổng số loài có thể tới 2.500 loài thuộc trên dưới 60 chi [10]. Do sự phong phú và đa dạng về số loài và chi, nên việc phân loại các bậc taxonomy trong họ thực vật này cũng có vài quan điểm khác nhau. Tuy nhiên, tựu trung lại, hầu hết các tác giả đều thống nhất phân chia các đại diện trong họ Ranunculaceae thành 2 Phân họ (Subfamily) và 5 Tông (Section) theo hệ thống phân loại APG. Chi Anemone nằm trong Phân họ Ranunculoideae và trong Tông Anemoneae.

Như vậy, vị trí của họ Ranunculaceae và chi Anemone nằm trong hệ thống phân loại thực vật có hoa, cụ thể như sau: Giới Thực vật - Plantae Ngành Ngọc lan – Magnoliophyta / hay là Ngành Hạt kín - Angiospermae Lớp Ngọc lan – Magnoliopsida / hay là Lớp Hai lá mầm - Dicotyledone Bộ Mao lương - Ranunculales 3 Họ Mao lương – Ranunculaceae Phân họ Mao lương – Ranunculoideae Tông Phong quỳ - Anemoneae Chi Phong quỳ - Anemone Chi Anemone lần đầu tiên được công bố vào năm 1753 bởi tác giả Linnaeus C trong cuốn sách “Species plantarum”, trong tài liệu này, tác giả mô tả 8 loài thuộc chi Anemone bao gồm A. Sau đó, có nhiều thống kê về các loài thuộc chi Anemone đã được báo cáo. Theo tác giả Tamura M. chi Anemone trên thế giới có khoảng 150 loài [22].

Các nghiên cứu của Ziman S. lần lượt báo khoảng 118 và 200 loài thuộc chi Anemone [39, 125]. Tra cứu tại trang chuyên khảo về thực vật “The plant list” (2018), có 222 tên loài được chấp nhận thuộc chi Anemone. Theo các Tác giả trong Thực vật chí Trung Quốc thì tổng số loài thuộc chi Anemone (họ Ranunculaceae) đã biết trên thế giới hiện vào khoảng 150 loài [109].

Như vậy có thể thấy, chi Anemone là một chi thực vật với số lượng loài tương đối lớn trên thế giới [9]. Đặc điểm thực vật của chi Anemone Chi Anemone (họ Ranunculaceae) được Linnaeus C. Kể từ đó đên nay, “Danh pháp” của chi thực vật này không có gì thay đổi, nhưng về số loài, theo thời gian, ngày càng được bổ sung nhiều hơn. Đặc điểm hình thái thực vật của chi Anemone tóm tắt như sau: Cây cỏ lâu năm, có thân rễ.

Lá mọc từ gốc, đơn, chân vịt, 3 lá chét, hoặc kép lông chim, đôi khi tiêu giảm thành dạng vảy lá. Trục cụm hoa mọc thẳng, hoặc mọc xiên sau đó hướng lên; cụm hoa xim, đôi khi tán. Lá bắc (2-) 3 hoặc nhiều 4 hơn, họp thành tổng bao lá bắc. Đài (4-) 5 hoặc nhiều hơn, dạng cánh hoa, màu trắng, vàng, xanh da trời hoặc tím.

Nhị thường nhiều. Bộ nhụy có vài hoặc nhiều lá noãn rời; bầu có 1 noãn, đính noãn treo (đỉnh noãn đỉnh); vòi nhụy có hoặc không; núm nhụy có hoặc không. Quả bế hình trứng hoặc gần cầu, hiếm khi dẹt ở hai phía [109]. Các loài thuộc chi Anemone trên thế giới và phân bố Như trên đã đề cập, số loài thuộc chi Anemone trên thế giới thay đổi theo thời gian.

Khi mới thành lập chi thực vật này (1753), Linnaeus, C. mới đề cập có 8 loài [60]. Theo tác giả Tamura, M. Các nghiên cứu của Ziman, S.

Theo trang chuyên khảo về thực vật “The plant list” (2018), có 222 loài được chấp nhận tên [9]. Các loài thuộc chi Anemone phân bố rộng rãi khắp các châu lục, nhưng tập trung chủ yếu ở vùng ôn đới ấm, vùng nhiệt đới ít loài hơn và thường cũng chỉ thấy ở khu vực núi cao. Ở Trung Quốc được biết có 53 loài, trong đó 22 loài được coi là đặc hữu [109]. Các loài thuộc chi Anemone ở Việt Nam và phân bố Trong hầu hết các tài liệu đã được công bố ở Việt Nam chi Anemone được gọi là “chi Phong quỳ” [1, 7].

Người đầu tiên mô tả về chi Phong quỳ (Anemone), họ Mao lương (Ranunculaceae) là nhà thực vật học người Pháp Françoise Gagnepain Năm 1929, trên “Bulletin de la Socie̓te̕ Botanique de France 76”, ông công bố 2 loài mới thuộc chi Anemone ở Việt Nam là: Anemone chapaensis Gagnep. Các loài thuộc chi Anemone và nơi ghi nhận về phân bố ở Việt Nam 5 STT Tên khoa học Tên thường Nơi phân bố TLTK gọi 1 A. chapaensis Phong quỳ sa Lào Cai (Sa Pa) [4] Gagnep. et Phong quỳ nhật Lai Châu [4, 7] Zucc.

Phong quỳ Lào Cai, Đà [4] poilane Nẵng, Quảng Nam, Kon Tum (độ cao 1200- 1800 m) 4 A.– Phong quỳ suối Quảng Trị, Phú [1, 4, Ham. Yên, Khánh 7] Hòa, Kon Tum, Lâm Đồng 5 A. sumatrana De Phong quỳ Lào Cai, Hà [7] Vriese sumatra Giang 6 A.- Dã miên hoa Hà Giang, Lai [7] Ham. Châu Sau một thời gian rất dài, đến năm 1999, nhà thực vật học Phạm Hoàng Hộ mới cho biết thêm ở nước ta có 5 loài thuộc chi Anemone trong bộ “Cây cỏ Việt Nam” [4].

Thông tin này cũng được tác giả Nguyễn Tiến Bân, 2003 ghi nhận lại trong bộ “Danh lục các loài Thực vật Việt nam”, T.II [1], gồm các loài: Phong quỳ sa pa (Anemone chapaensis Gagnep.), Phong quỳ nhật (A.), Phong quỳ suối (A.), Phong quỳ poilane (A.) và Phong quỳ sumatra (A. sumatrana De Vriese). Trong cuốn “Từ điển cây thuốc Việt Nam” năm 2012, tác giả Võ Văn Chi đề cập 2 loài được dùng làm thuốc có ở nước ta là Phong quỳ nhật (A. và Phong quỳ suối (A.

Trong bộ “Danh lục cây thuốc Việt Nam” xuất bản năm 2016, ngoài 2 loài cây thuốc đã được Võ Văn Chi ghi nhận trên [8], các tác giả ở Viện Dược liệu bổ sung thêm 1 loài nữa cũng được dùng làm thuốc ở Việt nam là Dã miên hoa (Anemone vitifolia Buch. Như vậy, theo các tài liệu cho đến nay, số loài thuộc chi Phong quỳ (Anemone) đã biết ở Việt Nam tổng số là 6 loài như tổng hợp ở Bảng 1. Theo tổng quan các tài liệu nghiên cứu có thể nhận thấy các loài thuộc chi Anemone ở Việt Nam tập trung phân bố chủ yếu ở các vùng rừng núi. vitifolia) được phát hiện ở các tỉnh thuộc vùng núi cao phía Bắc và 2 loài (A.

rivularis) thuộc các tỉnh ở phía Nam (từ Quảng Trị vào đến Lâm Đồng). Thành phần hóa học của chi Anemone Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Anemone chủ yếu được công bố bởi các nhà khoa học Trung Quốc. Cho đến nay, hơn 300 hợp chất đã được phân lập từ các loài thuộc chi Anemone. Các hợp chất phân lập chủ yếu thuộc các nhóm triterpenoid, saponin, ngoài ra có một số nhóm chất khác như flavonoid, coumarin, lignan, steroid, các dẫn chất acid phenolic và tinh dầu.

Các hợp chất triterpenoid Bảng 1. Các hợp chất triterpenoid đã phân lập từ chi Anemone TT Tên hợp chất Loài Tài liệu A. taipaiensis 4 Acid siaresinolic (4) A. cathayensis [28] Acid 2α,3β,23-trihydroxyurs-12-en- 9 A.

13 Acid betulinic (13) [40] tomentosa Triterpenoid là nhóm hợp chất chính trong thành phần hóa học của các loài thuộc chi Anemone. Các hợp chất này thuộc 03 khung cơ bản bao gồm oleanan, ursan và lupan. Tên và cấu trúc của các triterpenoid đã phân lập từ các loài thuộc chi Anemone được trình bày trong bảng 1. Cấu trúc hóa học của các triterpenoid phân lập từ chi Anemone Có 13 hợp chất triterpenoid (1-13) được phân lập từ các loài thuộc chi Anemone, gồm 04 hợp chất thuộc khung oleanan (1-4), 06 hợp chất thuộc khung ursan (5-10), 03 hợp chất thuộc khung lupan (11-13).

Hợp chất acid oleanolic (1) là một hợp chất phổ biến ở chi Anemone và cũng là phần aglycon của lượng lớn các saponin phân lập từ chi này. Các hợp chất saponin Saponin là nhóm hợp chất chính của các loài thuộc chi Anemone. Các hợp chất saponin đã phân lập được từ chi Anemone có phần aglycon chủ yếu là các triterpen khung oleanan (A1-A13). Ngoài ra, một vài saponin có phần aglycon là triterpen khung ursan (B), khung lupan (C), khung cycloartan (D).

Cấu trúc của khung aglycon và các hợp chất saponin đã phân lập được từ chi Anemone được trình bày trong Hình 1.2 và Phụ lục 2. Cấu trúc hóa học chính của các sapogenin từ chi Anemone Theo tra cứu, cho đến nay đã có 205 hợp chất saponin (14-218) được phân lập từ các loài thuộc chi Anemone (Phụ lục 2). Trong số này, 201 hợp chất (14- 214) có phần aglycon là các triterpen khung oleanan, 01 hợp chất (215) có phần alycon là triterpen khung ursan, 01 hợp chất (216) có phần aglycon là triterpen khung lupan, 02 hợp chất (217-218) có phần algycon là triterpen khung cycloartan. Các saponin với phần aglycon là các triterpen khung oleanan có phần đường liên kết tại C-3 và/hoặc C-28.

Các hợp chất (14-126) có phần aglycon là 10 acid oleanolic, chiếm hơn một nửa số hợp chất có phần alycon là các triterpen khung oleanan. Trong số các hợp chất này, 03 hợp chất saponin (84, 116, 118) có gốc muối [NaOSO3]- trong phân tử. Cả 03 hợp chất đều được phân lập từ loài A. Các hợp chất 210-212 có phần aglycon A11 và A12 là các triterpenoid ít gặp trong tự nhiên.

Phần aglycon A11 có liên kết đôi ở liên kết C- 18/C-19 trong khi phần aglycon A12 không xuất hiện nối đôi ở liên kết C-12/C- 13 như thường gặp mà thay vào đó 02 carbon này được liên kết với 02 nhóm hydroxy. Các saponin đã được tìm thấy trong 21 loài thuộc chi Anemone. Các loài giàu saponin bao gồm A. Các nhóm hợp chất khác Ngoài triterpenoid và saponin, còn có nhiều nhóm chất như coumarin, flavonoid, lacton, lignan, steroid, các dẫn chất acid phenolic, thành phần tinh dầu, một số các chất khác phân lập từ các loài thuộc chi Anemone, được thống kê ở Bảng 1.3; Cấu trúc của các hợp chất này được trình bày trong Hình 1.

Các nhóm hợp chất khác đã phân lập từ chi Anemone TT Tên hợp chất Loài Tài liệu Coumarin 1 Coumarin (219) A. flaccida [120] Flavonoid Quercetin-3-O-β-D-galactopyranosid-7-O-α-L- 12 A. raddeana Lignan (7S,8R,7′R,8′S)4,9,4′,7′-Tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-7′-O-n 28 A. rivularis 42 1-O-Caffeoyl-β-D-glucopyranosid (260) A.

altaica [126] Tinh dầu 53- γ-Terpineol (270); 4-Tert-butylphenetole (271); 2,6-Di-tert- A. rivularis 57 Phenylethyl alcohol (274) A.