MỞ ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợc cả xã hội quan tâm, đặc biệt là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợc sử dụng cho vào thức ăn gia súc để kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều trị dự phòng, điều trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong chăn nuôi gia súc, gia cầm.
Chúng cũng đã đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thủy sản.Vì vậy sự tồn dƣ của chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đặc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợng chất chuyển hóa của nitrofuran trong số lƣợng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thủy sản các sản phẩm nhập khẩu vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớc Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc gia bao gồm Mỹ, Canada và EU. Các nƣớc này đã đặt lệnh cấm trên tất cả các loại thực phẩm nhập khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran.
Tháng 3 năm 2003 EU đã quy định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lƣu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong đó có nitrofuran [9]. Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp “Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”.
2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran 1. Nhóm nitrofuran là gì? Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣởng, chủ yếu đối với gia súc (nhƣ gia cầm, lợn), nuôi trồng thủy sản (cá, tôm) và nuôi ong để điều trị các vi khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu [12]. Các chất nhóm nitrofuran Các chất nhóm n itrofuran bao gồ m Furazolidone, furaltadone, furazolidone, nitrofurazone, khi đi vào cơ thể sinh vâ ̣t nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kế t trong các mô tồ n ta ̣i trong nhiề u tuầ n sau khi sƣ̉ du ̣ng [12].
Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa của nitrofurazone nhƣ sau : 3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.1: Cấ u trúc hóa ho ̣c của mô ̣t số chấ t nhóm nitrofuran đƣơ ̣c xác đinh ̣ trong đề tài Khố i lƣơ ̣ng Công thƣ́c STT Các chất nitrofuran phân Công thƣ́c cấ u ta ̣o phân tƣ̉ tƣ̉ (g/mol) AOZ 1 C3H6N2O2 102,09 3-amoni-2-oxazolidinone NPAOZ 3-(2-nitrobenzylidenamino)- 2 C10H9N3O4 235,2 2-oxazolidinone) AMOZ 3 3-amoni-5-morpholinomethyl C8H15N3O3 201,22 -1,3-oxazolidinone NPAMOZ 5-(morpholinomethyl)-3-(2- 4 nitrobenzylidenamino)-2- C15H18N4O5 334,33 oxazolidinone AHD 5 C3H5N3O2 116,05 1-aminohydantoin NPAHD 6 [3-(2-nitrobenzylidenamino) C10H8N4O4 248,19 -2,4-imidazolidinedione] 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SEM CH5N3O 7 75,08 semicarbazide NPSEM 3[(2-nitrophenyl)methylene]- C8H8N4O3 208,174 8 hydrazinecarboxamide 1. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran McCracken và các cô ̣ng sƣ̣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng ứng liên kết trong các mô. Về mặt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ̀ nitrofuran đã kìm hãm hoặc phá hủy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không phát triển và không sinh sản đƣợc nữa.
Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác dụng tố t trong viê ̣c giê ̣t trƣ̀ giun đũa [7]. Với n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác dụng diệt khuẩn. Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viê ̣c diê ̣t khuẩ n salmonellosis, colisepticeamia.
Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡng. Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp sẽ giúp cho gà và lợn còn tăng trọng nhanh. Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến [7], khi thƣ̣c phẩ m có tồ n dƣ nitrofuran và các dẫn xuấ t của nó. Do đó hầ u hế t các nƣớc trên thế giới đã cấ m sƣ̉ du ̣ng kháng sinh nhóm nitrofuran trong chăn nuôi.
Ở Việt Nam, bô ̣ Nông nghiê ̣p và phát triể n nông thôn đã quyế t đinh ̣ cấ m sƣ̉ du ̣ng ni trofuran cho vào trong thƣ́c ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy 5 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơ ̣c phát hiện thấ y trong thịt gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thủy sản nhập khẩu vào các nƣớc EU từ Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25]. Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari.
Sau đó EU đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn 9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc (37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm tôm, mật ong và thịt hộp [25]. Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thủy sản nhập khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê, cá ba sa.cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran trong tôm [11]. Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát của TS.
Nguyễn Quố c Ân , phó trƣởng phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đã phát hiện 5 mẫu thủy sản nuôi lấ y tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mẫu tôm, 1 mẫu cá và 1 mẫu cua lô ̣t) với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 0 – 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mẫu tôm thẻ chân trắ ng ta ̣i Phú Mỹ – Bình Định nhiễm AOZ với hàm lƣơ ̣ng 12,6 ng/g; 2/754 mẫu cua lô ̣t ta ̣i Cầ n Guô ̣c – Long An nhiễm SEM với hàm lƣơ ̣ng tƣ̀ 2 – 2,2 ng/g [1]. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran Hiê ̣n nay có nhiề u phƣơng pháp để xác đinh ̣ kháng sinh nhóm nitrofuran , bao gồ m: phƣơng pháp sắ c ký lỏng v ới detector UV , phƣơng pháp vi sinh (kỹ thuật Elisa), phƣơng pháp sắ c ký lỏng với detector MS/MS. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất của 6 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nó trong một số đối tƣợng thực phẩm.
Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate, làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kế t hơ ̣p với detector UV ở bƣớc sóng 275nm. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 5 và 10 µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ với độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18]. Tác giả Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận của lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợc 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran.
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg [21]. Phƣơng pháp HPLC -UV có ƣu điể m là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng phân tić h rô ̣ng raĩ. Tuy nhiên phƣơng pháp la ̣i không đáp ƣ́ng đƣơ ̣c yêu cầ u về đô ̣ nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t tới (MRPL) là 1 µg/kg. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay- ELISA) Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng các sản phẩm sinh học.
Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, enzyme sẽ thủy phân thành một chất có màu. Phòng thí nghiệm randox của Anh đã nghiên cứu xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran sử dụng phƣơng pháp Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣờng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28]. Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thủy phân và dẫn xuất bằng o-NBA 7 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com trong môi trƣờng axit HCl , sau đó trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane.
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp là 0,13 µg/kg, CCα = 0,3 µg/kg [25].