Chương 1 TỔNG QUAN 1. Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ 1. Nguyên lý chung của kỹ thuật sắc ký Sắc ký là một phương pháp tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. - Pha tĩnh (stationary phase) hay pha cố định, là phần chất liệu hay dung dịch được giữ cố định trong quá trình sắc ký.
Pha tĩnh có tác dụng giữ các chất lại. - Pha động (mobile phase): là phần khí hay dung dịch đi qua pha tĩnh, pha di động có tác dụng kéo các chất đi. Hai pha này luôn tiếp xúc với nhau nhưng không trộn lẫn vào nhau. Các chất có ái lực càng cao với pha tĩnh sẽ di chuyển càng chậm trong quá trình sắc ký và ngược lại.
Các phân tử có trọng lượng lớn, kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn trong cột và xuất hiện sau các phân tử nhỏ, trọng lượng phân tử thấp. Sắc ký khí – khối phổ Sắc ký khí khối phổ là phương pháp phân tích kết hợp giữa sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS) để xác định các thành phần hoạt chất khác nhau trong mẫu thử. Các mẫu sắc ký khí ở dạng hơi hoặc dạng khí. Nguyên lý: Sắc ký khí giúp phân tách các thành phần khác nhau trong mẫu thành các chất nhờ ái lực của mỗi chất trong hỗn hợp mẫu có sự tương tác khác nhau với pha tĩnh.
Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn sẽ xuất hiện trước, các phân tử có trọng lượng lớn hơn sẽ xuất hiện sau trên sắc ký đồ. Phần khối phổ có nhiệm vụ xác định định tính và định lượng các chất. Ở bộ phận khối phổ các phân tử mẹ được chọn lọc trước khi bị ion hóa và bị bắn phá thành các mảnh ion. Các ion chọn lọc đặc trưng cho mỗi chất được chuyển đến bộ phận lọc.
Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm 4 biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính để tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ. GC/MS được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định các hoạt chất bởi độ nhạy và độ đặc hiệu cao, mỗi chất được đặc trưng bởi thời gian lưu và các mảnh ion đặc hiệu cho cấu trúc phân tử của hoạt chất đó.
GC/MS được ứng dụng trong phát hiện thuốc, các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu, các chất có trong mẫu thử chưa biết. GC/MS là một phương pháp có độ nhạy cao được sử dụng để định tính và định lượng các chất ở thể khí (hay được hóa hơi). Ngưỡng phát hiện của phương pháp là picrogram [18]. Cấu tạo của hệ thống GC/MS 3.
Nguồn cấp khí Bộ phận 6. Bộ phận Bộ phận 11. Bảng điều Bơm mẫu khối phổ kết nối khiển điện tử sắc ký khí 8. Bộ phân tích 7.
Đầu ion khối lượng dò 4. Hệ thống cột chân không 2. Bộ điều khiển khí nén Hình 1. Cấu tạo hệ thống sắc ký khí – khối phổ [19] 1.
Nguồn cấp khí 2. Bộ điều khiển khí nén 3. Kết nối sắc ký với khối phổ 7. Bộ phận phân tích khối lượng 9.
Hệ thống chân không 11. Bảng điều khiển điện tử 5 Cửa tiêm mẫu: gồm một bơm tiêm mẫu tự động (3), dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm tự động vào hệ thống tại cửa này. Mẫu sau đó được hệ thống cấp khí, điều khiển khí nén (1 và 2) dẫn qua hệ thống sắc ký khí, thường sử dụng các loại khí trơ như heli, hydro. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên cao để mẫu từ dạng lỏng trở thành dạng khí.
Vỏ ngoài: vỏ ngoài của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt (4). Nhiệt độ của lò này dao động từ 40oC cho đến 320oC. Cột: bên trong hệ thống GC chính là một cuộn ống nhỏ hình trụ với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt (5). Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.
Sau đó, khi phân tách hỗn hợp thành các thành phần khác nhau dựa theo ái lực khác nhau với pha tĩnh, các chất chuyển qua bộ phận kết nối sang bộ phận khối phổ. Nguồn ion: nguồn ion (7) cung cấp ion để ion hóa các sản phẩm trong hỗn hợp sau khi phân tách. Ion mẹ chuyển đến bộ phận phân tích khối lượng (8), bắn phá tạo thành các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử của chất phân tích. Các mảnh ion được chọn lọc, phát hiện bằng đầu dò khối phổ rất đặc hiệu (9).
Hệ thống chân không: duy trì áp lực chân không trong bộ phận khối phổ (10). Bảng điều khiển điện tử: sử dụng để điều khiển hệ thống (11). Kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS Nguyên lý kỹ thuật theo Honour JW [18],[20]: thủy phân steroid liên hợp bằng enzym glucuronidase/sulphatase sau đó tách chiết các steroid tự do và tạo dẫn xuất steroid lần lượt với methoxyamin và trimethylsilylimidazole (TMSI). Tinh sạch steroid trước khi bơm mẫu vào hệ thống sắc ký khí- khối phổ.
Trong máy, steroid được làm bay hơi ở nhiệt độ cao. Sau khi phân tách các steroid bởi bộ phận sắc ký khí, steroid được vận chuyển đến bộ phận khối 6 phổ. Ion hóa các steroid và bắn phá tạo các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc từng steroid và phát hiện bằng đầu dò khối phổ. Quy trình kỹ thuật Thủy phân steroid niệu liên hợp với acid glucuronic và acid sulphuric bằng enzym glucuronidase và arylsulphatase ở nhiệt độ 370C qua đêm hoặc ở 550C trong 3 giờ.
Hoạt hóa cột Bond Elut bằng methanol và rửa lại bằng nước cất. Cho mẫu lên cột, các steroid tự do được tách chiết, tinh sạch bằng cột Bond Elut C18, chỉ steroid được giữ lại tại màng lọc của cột. Steroid tự do được rửa giải bằng methanol và làm khô bằng cách cho bay hơi để loại bỏ methanol khỏi steroid. Tạo dẫn xuất giữa steroid với methoxyamine và TMSI để bảo vệ các nhóm chức –OH không bị phân hủy bởi nhiệt độ cao trong khi làm hóa hơi steroid và thực hiện sắc ký khí.
Steroid sau khi tạo dẫn xuất và tách chiết được bơm trực tiếp vào máy sắc ký khí khối phổ và được vận chuyển trong cột sắc ký nhờ khí trơ như heli. Sau khi phân tách các thành phần steroid khác nhau nhờ tương tác với pha rắn, các steroid được vận chuyển đến bộ phận khối phổ. Tại đây dưới tác dụng của dòng điện các steroid niệu được ion hóa, được bắn phá tạo thành các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử của các steroid. Trong phương pháp SIM (selected ion monitoring), chỉ ion chọn lọc mới đến bộ cảm biến để phát hiện.
Mỗi steroid niệu đặc trưng bằng một đỉnh (peak) trên sắc ký đồ, thời gian xuất hiện đỉnh từ khi mẫu đi qua cột được gọi là thời gian lưu. Mảnh ion được bắn phá từ phân tử mẹ đặc trưng giúp nhận diện steroid trên sắc ký đồ [18]. Chuẩn nội (internal standard) được cho vào các mẫu với một lượng như nhau để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình phân tích. Mẫu chuẩn được phân tích cùng với mẫu bệnh để xây dựng đường chuẩn giúp tính nồng độ steroid trong mẫu thử.
Xác định thời gian lưu, ion đặc hiệu tương ứng của các steroid trong mẫu thử dựa vào phân tích các steroid tinh khiết trong mỗi mẻ phân tích. 7 Ưu điểm kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS: sắc ký giúp phân tách các steroid riêng biệt, các đồng phân được phân biệt trên sắc ký đồ nhờ thời gian lưu khác nhau. Các phân tử có cùng trọng lượng được phân biệt nhờ ion đặc hiệu cho mỗi steroid. Kỹ thuật có độ nhạy cao, có khả năng định lượng mẫu có nồng độ thấp do khả năng cô đặc, tinh sạch.
Độ đặc hiệu cao nhờ phân tích cấu trúc phân tử của các steroid [11]. Nhược điểm kỹ thuật: thời gian xét nghiệm lâu hơn so với LC/MS-MS do thời gian thủy phân và tạo dẫn xuất kéo dài. Toàn bộ quá trình chuẩn bị mẫu thực hiện thủ công, cần người thực hiện có kinh nghiệm. Số lượng mẫu được thực hiện nhỏ do không thể tự động hóa quá trình chuẩn bị mẫu.
Kỹ thuật khó phổ biến rộng rãi và kết quả có thể không tốt ở mẫu của trẻ sơ sinh do nồng độ các steroid rất thấp trong nước tiểu. Hạn chế sai số: Tối ưu hóa điều kiện phản ứng của enzym glucuronidase bằng pH thích hợp của dụng dịch đệm. Ổn định steroid tự do sau khi thủy phân bằng vitamin C. Trước khi tạo dẫn xuất cần làm khô hoàn toàn methanol để tránh sự ức chế khi tạo dẫn xuất, thời gian và nhiệt độ tạo dẫn xuất cần ổn định, lựa chọn ion đặc hiệu cho mỗi steroid niệu [21].
Với các mẫu nước tiểu loãng của trẻ sơ sinh có thể cô đặc bằng cách tách chiết qua cột một thể tích nước tiểu lớn hơn trước khi thủy phân [22]. Mỗi steroid niệu có thể là sản phẩm chuyển hóa của một hoặc nhiều hormon steroid khác nhau. Ngược lại, một hormon có thể chuyển hóa tạo ra nhiều sản phẩm steroid niệu. Danh mục chữ viết tắt, tên đầy đủ và nguồn gốc một số steroid niệu được mô tả chi tiết trong bảng 1.1 Một số sản phẩm chuyển hóa steroid niệu Tên viết tắt Tên đầy đủ Sản phẩm chuyển hóa của Androstenedione, testosterone, An Androsterone 5α-dihydrotestosterone, DHEA Et Etiocholanolone Testosterone, DHEA DHEA Dehydroepiandrosterone Dehydroepiandrosterone 11β-OH-An 11β-Hydroxy-androsterone 11β-OH-androstenedione, cortisol 11β-OH-Et 11β-Hydroxy-etiocholanolone Cortisol 11-OXO-Et 11-Oxo-etiocholanolone Cortisol Dehydroepiandrosterone, 16α-DHEA 16α-OH-DHEA Dehydroepiandrosterone-sulfate Progesterone, 11- PD Pregnanediol deoxycorticosterone 5PD Pregnenediol Pregnenolone Pregnadienol Pregnadienol Pregnenolone (pregnenediol) 17OHPN 17-OH-pregnanolone 17-OH-progesterone 3α5α17HP 3α5α-17-OH-pregnanolone 17-OH-progesterone PT Pregnanetriol 17-OH-progesterone 5PT 5-Pregnenetriol 17-OH-pregnenolone PTL Pregnanetriolone 21-Deoxycortisol THDOC Tetrahydrodeoxycorticosterone 11-Deoxycorticosterone THS Tetrahydro-11-deoxycortisol 11-Deoxycortisol Tetrahydro-11- THA Corticosterone dehydrocorticosterone 5α-Tetra-11- 5αTHA Corticosterone dehydrocorticosterone THB Tetrahydrocorticosterone Corticosterone 5αTHB 5α-Tetrahydrocorticosterone Corticosterone THALDO Tetrahydroaldosterone Aldosterone 9 Tên viết tắt Tên đầy đủ Sản phẩm chuyển hóa của THE Tetrahydrocortisone Cortisol, cortisone THF Tetrahydrocortisol Cortisol 5αTHF 5α-Tetrahydrocortisol Cortisol α-Cortolone α-Cortolone Cortisol, cortisone β-Cortolone β-Cortolone Cortisol, cortisone α-Cortol α-Cortol Cortisol β-Cortol β-Cortol Cortisol 6β-OH-cortisol 6β-OH-cortisol Cortisol 1.
Thẩm định phương pháp và thiết lập khoảng tham chiếu 1. Thẩm định phương pháp Thẩm định phương pháp là việc cung cấp những bằng chứng khách quan cho thấy một phương pháp dự kiến sử dụng hoặc đang sử dụng có thể đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. Thẩm định phương pháp (method validation) cần thực hiện với các phương pháp chưa được nhà sản xuất thẩm định, các phương pháp có sự thay đổi so với ban đầu. Trong khi đó xác nhận phương pháp (method verification) là xác nhận lại các giá trị của nhà sản xuất công bố về kết quả thẩm định phương pháp.