Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (mã số 9 42 02 01) của tác giả Lê Quốc Phong, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Ngô Kế Sương, bảo vệ tại Học viện Khoa học và Công nghệ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam năm 2021, có tiêu đề: "Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học".

Về tính cấp thiết, nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps sinensis) là dược liệu quý ký sinh trên ấu trùng bướm đêm Thitarodes (Hepialus) armoricanus vùng núi cao Himalaya và cao nguyên Tây Tạng (3500–5000 m). Trong tự nhiên, loài này đứng trước nguy cơ cạn kiệt do khai thác quá mức và biến đổi khí hậu. Trong khi kỹ thuật nuôi cấy bán rắn tạo quả thể đòi hỏi thời gian dài và chi phí cao, công nghệ lên men lỏng thu nhận sinh khối hệ sợi cho phép kiểm soát tốt các thông số kỹ thuật, rút ngắn chu kỳ sinh trưởng và phù hợp sản xuất quy mô công nghiệp. Song song đó, selen (Se) là nguyên tố vi lượng thiết yếu đối với người, tham gia vào cấu trúc của 25 selenoprotein (như glutathione peroxidase, thioredoxin reductase, iodothyronine deiodinases) và có vai trò điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, hỗ trợ chức năng tuyến giáp. Tuy nhiên, nguồn dược liệu tự nhiên giàu Se ở Việt Nam còn hạn chế và không ổn định. Nhằm giải quyết yêu cầu bổ sung Se hữu cơ an toàn theo Quyết định số 689/TH ngày 29/6/2011 về "Chiến lược quốc gia về dinh dưỡng giai đoạn 2011–2020 và tầm nhìn đến năm 2030", việc nghiên cứu tích hợp selen vào sinh khối C. sinensis được đặt ra.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định là: Se ở nồng độ cao có độc tính mạnh, ức chế sự phân chia tế bào và gây chết nấm sợi. Trước công trình này, các nghiên cứu trong và ngoài nước về khả năng dung nạp các dạng selen khác nhau, cơ chế thích nghi, việc tối ưu hóa đồng thời các yếu tố dinh dưỡng và thông số vật lý bằng phương pháp đáp ứng bề mặt để chuyển hóa selen vô cơ thành selen hữu cơ gắn trong sinh khối, polysaccharide của C. sinensis còn thiếu đồng bộ.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định cụ thể như sau:

  1. Mục tiêu tổng quát: Sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học được cải thiện và tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao.
  2. Mục tiêu cụ thể:
    • (1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.
    • (2) Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các hoạt chất chứa Se từ sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Chủng nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 do TS. Trương Bình Nguyên (Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Nông nghiệp Công nghệ cao, Trường Đại học Đà Lạt) cung cấp.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại Viện Sinh học Nhiệt đới, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh), Viện Y tế Công cộng TP. Hồ Chí Minh và Viện Công nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh.
  • Phạm vi thời gian: Đề tài thực hiện từ tháng 01/2015 đến tháng 06/2020.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong phần tổng quan tài liệu, tác giả hệ thống hóa các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến phân loại học, nuôi trồng nấm Cordyceps và sinh học selen:

  • Về phân loại và hoạt chất: Sung và cộng sự (2007) dựa trên phân tích 5–7 locus gen (nrSSU, dnrLSU, tef1, rpb1, rpb2, tub, atp6) đã chuyển Cordyceps sinensis sang chi Ophiocordyceps. Shrestha và cộng sự (2013) mô tả đặc điểm sinh thái tự nhiên của loài. Tác giả tổng hợp các nhóm hoạt chất gồm hợp chất nitơ (adenosine, cordycepin), sterol (ergosterol), polysaccharide (cordysinocan), các acid amin và acid béo.
  • Về nuôi trồng nhân tạo: Kỹ thuật nuôi quả thể bán rắn trên môi trường gạo, nhộng tằm của Cao và cộng sự (2015) cần 140 ngày; Liu và cộng sự (2019) nuôi cấy trên ấu trùng Thitarodes xiaojinensis. Đối với nuôi cấy lỏng thu sinh khối, luận án dẫn chứng thành phần môi trường của Xiao và cộng sự (2004) cho C. jiangxiensis, Kim và cộng sự (2003) cho C. militaris, Singh và cộng sự (2014) và Dong và cộng sự (2005) cho C. sinensis, Lin và cộng sự (2010) cho C. guangdongensis, Kang và cộng sự (2014) cho C. militaris.
  • Về chuyển hóa selen ở nấm: Kieliszek và cộng sự (2015) mô tả con đường chuyển hóa selenate và selenite thông qua kênh vận chuyển sulfate Sul1p/Sul2p, hệ enzyme sulfurylase ATP, PAPSe reductase và sulfate reductase thành hydrogen selenide ($H_2Se$), làm tiền chất tổng hợp selenomethionine (SeMet) và selenocysteine (SeCys). Seko và cộng sự (1988) giải thích phản ứng giữa selenite và glutathione tạo gốc superoxide ($O_2^{\bullet-}$), cơ chế gây độc của selenite ở liều cao.
  • Về làm giàu selen trên nấm: Ji và cộng sự (2014) bổ sung 0,4% Se cho C. sinensis đạt mức tích lũy 4789,26 ± 13,0 µg/g; Zheng và cộng sự (2014) nuôi chủng C. sinensis SU-1 với 20 mgSe/L đạt hàm lượng Se tích lũy 1260,16 ± 107,12 µg/g qua phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS; Yang và cộng sự (2006) bổ sung 33,78 mgSe/L natri selenite thu nhận selenopolysaccharide nội bào 197,35 mg/g; Zhang và cộng sự (2014) khảo sát bổ sung 20 mgSe/L cho C. militaris; Hu và cộng sự (2018a, 2018b) và Tie và cộng sự (2014) ứng dụng kỹ thuật HPLC-ICP-MS xác định SeMet, SeCys trong nấm Cordyceps. Huỳnh Thị Diễm Phúc và cộng sự (2016) ứng dụng phần mềm BCPharSoft để tối ưu hóa nồng độ kẽm cho C. sinensis.

Vị trí của luận án được xác lập thông qua việc giải quyết khoảng trống: so sánh trực tiếp tác động sinh học của ba nguồn selen (selenite, selenate, selenourea) lên chủng C. sinensis CS-YK2007; xây dựng quy trình nuôi cấy thích nghi cải tiến để nâng ngưỡng chịu đựng selenate; ứng dụng đồng bộ hai mô hình toán học Box–Behnken và D-optimal để tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng và điều kiện vật lý; đồng thời xác định dạng selen hữu cơ trong polysaccharide và phân đoạn cao chiết gắn liền với 8 chỉ tiêu hoạt tính sinh học in vitro và an toàn in vivo.


Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết đồng hóa khoáng vi lượng ở nấm lớn: Se có đặc tính hóa lý tương tự lưu huỳnh nên được hấp thu qua kênh sulfate rồi gắn cộng hóa trị vào amino acid tạo selenoprotein hoặc tích lũy vào vách tế bào tạo seleno-exopolysaccharide (Se-EPS) và seleno-intracellular polysaccharide (Se-IPS). Cơ sở tối ưu hóa thực nghiệm dựa trên phương pháp toán học thống kê mô hình bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology - RSM), thiết kế Plackett–Burman để sàng lọc yếu tố ảnh hưởng và phương trình hồi quy đa thức bậc hai:

$$A = B_0 + B_1X_1 + B_2X_2 + B_3X_3 + B_{12}X_1X_2 + B_{13}X_1X_3 + B_{23}X_2X_3 + B_{11}X_1^2 + B_{22}X_2^2 + B_{33}X_3^2$$

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tuần tự:

  1. Chuẩn bị giống: Giống cấp 1 nuôi trên môi trường thạch PGA (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L, agar 15 g/L) ở 22 ± 2°C trong 15 ngày. Giống cấp 2 nuôi trên môi trường lỏng PG (khoai tây 200 g/L, glucose 20 g/L) với tỷ lệ cấy 2 khoanh thạch giống cấp 1 vào 200 mL môi trường.
  2. Đánh giá ảnh hưởng của selen: Bổ sung 3 nguồn selen gồm natri selenite ($Na_2SeO_3.5H_2O$), natri selenate ($Na_2SeO_4.10H_2O$) và selenourea ($SeC(NH_2)_2$) ở các nồng độ 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mgSe/L vào môi trường PGA (đo tốc độ lan tơ bằng kính trắc vi thị kính ở ngày thứ 5, 10, 15) và môi trường lỏng PS (khoai tây 200 g/L, saccharose 50 g/L, peptone 6 g/L, cao nấm men 4 g/L, $KH_2PO_4$ 0,5 g/L, $MgCl_2$ 0,1 g/L; nuôi 40 ngày ở 22 ± 2°C, thu sinh khối khô ở 60°C).
  3. Phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến: Cấy chuyển hệ sợi qua thang nồng độ selenate tăng dần xen kẽ giữa thạch PGA và lỏng PS từ 5, 10, 7,5 (phục hồi), 15 đến 25 mgSe/L để chọn lọc dòng sợi nấm thích nghi.
  4. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy:
    • Sàng lọc 7 biến độc lập bằng ma trận Plackett–Burman (12 nghiệm thức, 2 mức -1 và +1): khoai tây ($X_1$: 150–250 g/L), saccharose ($X_2$: 40–60 g/L), peptone ($X_3$: 5–15 g/L), cao nấm men ($X_4$: 5–15 g/L), $KH_2PO_4$ ($X_5$: 0,5–1,5 g/L), $K_2HPO_4$ ($X_6$: 0,5–1,5 g/L), $MgCl_2$ ($X_7$: 0,1–1 g/L).
    • Tối ưu hóa thành phần môi trường bằng mô hình Box–Behnken (17 nghiệm thức, 3 mức -1, 0, +1).
    • Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy bằng mô hình D-optimal (19 nghiệm thức, 3 mức): nhiệt độ ($Z_1$: 20, 25, 30°C), pH ($Z_2$: 6, 7, 8), ánh sáng ($Z_3$: ánh sáng đỏ 6,617 µmol photon/$m^2$/s, ánh sáng trắng 8,618 µmol photon/$m^2$/s, ánh sáng xanh dương 13,872 µmol photon/$m^2$/s).
Thiết bị / Kỹ thuật Nhà sản xuất / Xuất xứ Mục đích sử dụng
Hệ thống ICP-MS Agilent 7700x & NexION 350X Agilent (Mỹ) / Perkin Elmer (Mỹ) Định lượng Se tổng (đồng vị $^{78}Se$, nội chuẩn $^{74}Ge$)
Sắc ký lỏng HPLC ghép khối phổ ICP-MS Agilent / Perkin Elmer Định lượng Se nguyên dạng (SeMet, SeCys, selenite, selenate) sau thủy phân proteinase K và XIV
Máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) Viện Công nghệ Hóa học TP.HCM Xác định liên kết đặc trưng của Se-EPS và Se-IPS
Thử nghiệm độc tính tế bào SRB Biotek Instruments (Mỹ) Khảo sát gây độc tế bào ung thư MCF-7, Jurkat và nguyên bào sợi fibroblast (đo OD 492 và 620 nm)
Độc tính cấp đường uống Quy trình Bộ Y tế Chuột nhắt trắng, thể tích uống 0,2 mL/10g thể trọng, theo dõi 72 giờ (xác định $D_{max}$, $LD_0$, $LD_{50}$)
Phần mềm phân tích Design Expert 7.0; IBM SPSS Statistics 20 Phân tích hồi quy, ANOVA, tối ưu hóa thông số thực nghiệm
  1. Phương pháp thu nhận các phân đoạn cao chiết: Chiết ngấm kiệt bằng ethanol 96% thu cao tổng EtOH (theo Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007); phân đoạn lỏng–lỏng lần lượt với petroleum ether (PE), ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) và pha nước; chiết cao polysaccharide từ bã (CPS) bằng nước nóng 65°C tủa cồn 96° tỷ lệ 1:4; chiết polysaccharide ngoại bào (EPS) từ dịch lọc nuôi cấy tủa ethanol lạnh 96° tỷ lệ 1:4; chiết polysaccharide nội bào (IPS) từ bột sinh khối bằng NaOH 0,4M ở 60°C tủa cồn 1:5, thẩm tách màng 1–2 kDa trong 24 giờ.
  2. Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học in vitro: Đánh giá khả năng bắt gốc tự do ABTS (đo OD 734 nm, chứng dương vitamin C); bắt gốc tự do DPPH (đo OD 517 nm, chứng dương vitamin C); năng lực khử ion sắt (đo OD 700 nm); bảo vệ đoạn gen ITS của nấm Pleurotus pulmonarius chống phản ứng Fenton ($H_2O_2$ 1M + $FeSO_4$ 140 mM) điện di trên gel agarose 1,5% định dạng 3D qua UVITEC 1D; ức chế xanthine oxidase (đo OD 290 nm, chứng dương allopurinol); kháng viêm qua ức chế biến tính albumin huyết thanh bò (BSA) ở 67°C (đo OD 660 nm, chứng dương diclofenac); ức chế $\alpha$-glucosidase (đo OD 405 nm bằng cơ chất pNPG, chứng dương acarbose); thử nghiệm độc tính tế bào SRB (nồng độ 100 µg/mL, chứng dương camptothecin).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Nấm Cordyceps sinensis

Chương 1 tổng thuật chi tiết cơ sở sinh học và dược lý của nấm Cordyceps sinensis, vai trò chuyển hóa của selen và các phương thức nuôi cấy bổ sung vi lượng:

  • Hệ thống hóa nguồn gốc phân bố tự nhiên tại cao nguyên Tây Tạng, Nepal, Bhutan ở độ cao 3500–5000 m, lịch sử sử dụng trên 2000 năm trong y học phương Đông và cơ sở phân loại sinh học phân tử chuyển loài từ chi Cordyceps sang chi Ophiocordyceps.
  • Thống kê 8 nhóm thành phần hoạt chất chính trong nấm gồm: hợp chất chứa nitơ (adenosine, cordycepin, cordymin), sterol (ergosterol, daucosterol), polysaccharide và dẫn xuất (cordysinocan, heteroglycan, mannoglucan), protein và acid amin tự do, acid phenolic, isoflavone, acid béo bão hòa và chưa bão hòa, cùng các vitamin và khoáng chất (Zn, Mg, Mn, Fe, Se).
  • Tổng hợp cơ chế tác động dược lý: tăng cường miễn dịch (tăng IgG, IgG1, IgG2b, kích hoạt đại thực bào tiết IL-1$\beta$, TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$ qua con đường I$\kappa$B–NF-$\kappa$B; kích thích tế bào T tiết IL-2, IL-6, IL-8); kháng viêm (giảm sản xuất NO, IL-12, TNF-$\alpha$); kháng oxy hóa (duy trì GPx, SOD, giảm lactate dehydrogenase và malondialdehyde); kháng khối u và gây apoptosis (ức chế phosphoryl hóa tyrosine của Bcl-2, kích hoạt caspase/MAPK, tăng p53, ức chế MMP-2, MMP-9, uPA); bảo vệ tim mạch, bảo vệ mô thận (ức chế tăng sinh tế bào mesangial qua trục tín hiệu PDGF/ERK và TGF-$\beta$1/Smad).
  • Phân tích vai trò sinh học của selen, khuyến cáo nhu cầu hàng ngày (RNI) theo FAO/WHO (từ 6 µg/ngày ở trẻ sơ sinh đến 34 µg/ngày ở nam trưởng thành, ngưỡng an toàn tối đa 400 µg/ngày cho người lớn); bệnh Keshan và bệnh lý xương khớp liên quan đến thiếu hụt Se; cơ chế giải phẫu con đường biến dưỡng Se ở nấm men từ $SeO_4^{2-}$ qua APSe, $SeO_3^{2-}$, $H_2Se$ đến các seleno-amino acid (SeMet, SeCys, SeMeCys). Phân tích ưu nhược điểm giữa nuôi cấy bán rắn tạo quả thể và nuôi cấy chìm thu sinh khối lỏng.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu sinh học, hóa chất, chủng giống và các quy trình phân tích định lượng, mô hình hóa toán học:

  • Nguồn gốc chủng giống nấm C. sinensis CS-YK2007; hóa chất selen chuẩn đồng vị $^{77}Se$ (Isoflex, Mỹ), selen nguyên tố (BDH), muối vô cơ $Na_2SeO_3$, $Na_2SeO_4$, selenourea; môi trường nuôi cấy cơ bản PGA, PG và PS.
  • Quy trình bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ và dạng muối selen (5–40 mgSe/L) lên đường kính lan tơ trên môi trường thạch PGA và sản lượng sinh khối khô trong môi trường lỏng PS sau 40 ngày nuôi cấy tĩnh ở 22 ± 2°C.
  • Quy trình 7 bước nuôi cấy thích nghi cải tiến sợi nấm trên môi trường tăng dần nồng độ selenate (5 mgSe/L trên thạch 7 ngày $\rightarrow$ 5 mgSe/L dịch lỏng 10 ngày $\rightarrow$ 10 mgSe/L dịch lỏng 10 ngày $\rightarrow$ phục hồi ở 7,5 mgSe/L 10 ngày $\rightarrow$ 15 mgSe/L trên thạch 10 ngày $\rightarrow$ phục hồi ở 15 mgSe/L dịch lỏng 15 ngày $\rightarrow$ nâng dần đến 25 mgSe/L).
  • Thiết kế ma trận thực nghiệm tối ưu hóa gồm: Plackett–Burman 12 nghiệm thức sàng lọc 7 thành phần dinh dưỡng; Box–Behnken 17 nghiệm thức tối ưu hóa thành phần môi trường bổ sung selen; D-optimal 19 nghiệm thức tối ưu hóa 3 yếu tố vật lý (nhiệt độ 20–30°C, pH 6–8, 3 nguồn ánh sáng đỏ/trắng/xanh).
  • Quy trình phân đoạn chiết xuất thu 8 loại chế phẩm cao chiết (cao tổng EtOH, cao PE, EtOAc, BuOH, cao nước, cao bã CPS, cao polysaccharide ngoại bào EPS, cao polysaccharide nội bào IPS).
  • Kỹ thuật phân tích ICP-MS đo Se tổng (phá mẫu bằng hỗn hợp acid $HNO_3$ 68%, $HClO_4$ 72%, $H_2SO_4$ 98%); kỹ thuật HPLC-ICP-MS phân tích Se nguyên dạng sau khi xử lý mẫu bằng proteinase K và proteinase XIV ở 50°C; quang phổ hồng ngoại FT-IR.
  • Các quy trình kiểm tra hoạt tính sinh học in vitro và thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng theo phương pháp Karber–Behrens của Bộ Y tế.

Chương 3: Kết quả và biện luận

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ 5 nội dung chính:

  1. Tác động của selen lên sinh trưởng của C. sinensis:
    • Trên môi trường thạch PGA sau 15 ngày: Selenate thể hiện khả năng dung nạp tốt nhất; ở nồng độ 40 mgSe/L, đường kính lan tơ đạt 5,9 ± 0,9 cm, không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng 6,1 ± 0,5 cm ($p > 0,05$), tơ nấm màu trắng, mọc tròn đều. Selenite gây ức chế rõ khi nồng độ > 25 mgSe/L; ở 40 mgSe/L, đường kính lan tơ giảm còn 4,2 ± 0,2 cm ($p < 0,05$), mặt sau khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ sậm và sợi nấm có dấu hiệu lão hóa. Selenourea gây độc mạnh nhất; ở nồng độ 40 mgSe/L, đường kính tơ chỉ đạt 2,2 ± 0,03 cm và nấm bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn ở nồng độ 35–40 mgSe/L.
    • Trên môi trường lỏng PS sau 40 ngày: Trọng lượng sinh khối khô giảm khi tăng nồng độ Se. Ở nồng độ 25 mgSe/L, môi trường bổ sung selenate cho sinh khối đạt 14,52 ± 0,82 g/L, cao hơn rõ rệt so với selenite là 11,85 ± 1,52 g/L ($p < 0,05$). Khi tăng nồng độ lên 30 mgSe/L, sinh khối ở nghiệm thức selenite giảm gần 80% so với đối chứng (từ 20,74 ± 1,58 g/L xuống còn 5,26 ± 0,37 g/L), nghiệm thức selenourea giảm gần 95%, và nấm bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ 35–40 mgSe/L. Đường kính sợi nấm duy trì ổn định ở mức 5–7,5 µm, sợi thẳng, không phân nhánh, không có vách ngăn.
    • Hiệu quả của phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến: Chủng nấm sau khi thích nghi bậc thang sinh trưởng ổn định ở 25 mgSe/L selenate, cho sản lượng sinh khối và hàm lượng selen hữu cơ tích lũy cao hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống (hàm lượng Se ở mẫu đối chứng không bổ sung là 0,424 ± 0,017 µg/g, tăng mạnh khi được nuôi bằng phương pháp cải tiến).
Nguồn selen khảo sát Đường kính lan tơ PGA ở 40 mgSe/L (cm) Sinh khối khô môi trường lỏng ở 25 mgSe/L (g/L) Mức độ ức chế sinh khối ở 30 mgSe/L so với ĐC (%)
Selenate ($Na_2SeO_4$) 5,9 ± 0,9 ($p > 0,05$ so với ĐC: 6,1 ± 0,5) 14,52 ± 0,82 Thấp hơn selenite, sợi nấm sinh trưởng ổn định
Selenite ($Na_2SeO_3$) 4,2 ± 0,2 ($p < 0,05$ so với ĐC: 5,5 ± 0,1) 11,85 ± 1,52 Giảm ~80% (còn 5,26 ± 0,37 g/L so với ĐC 20,74 ± 1,58 g/L)
Selenourea ($SeC(NH_2)_2$) 2,2 ± 0,03 ($p < 0,05$) Rất thấp, tơ nấm mỏng thưa Giảm ~95%, ức chế hoàn toàn ở 35–40 mgSe/L
  1. Tối ưu hóa môi trường và điều kiện nuôi cấy:

    • Sàng lọc Plackett–Burman: Xác định các biến có ảnh hưởng lớn đến sinh khối và lượng Se tổng tích lũy trong 7 yếu tố dinh dưỡng khảo sát.
    • Tối ưu hóa Box–Behnken: Xây dựng bề mặt đáp ứng và phương trình hồi quy bậc hai mô tả sự tương tác giữa các thành phần môi trường chính nhằm tối đa hóa sản lượng sinh khối (g/L) và hàm lượng Se tích lũy (µg/g).
    • Tối ưu hóa D-optimal: Xác định vùng tối ưu của nhiệt độ, pH và điều kiện chiếu sáng cho quá trình sinh trưởng và tích lũy Se của hệ sợi nấm.
  2. Thu nhận cao chiết và phân tích thành phần selen:

    • Phân đoạn chiết xuất thu các cao chiết EtOH, PE, EtOAc, BuOH, pha nước, CPS, EPS và IPS.
    • Phân tích phổ FT-IR của Se-EPS và Se-IPS ghi nhận các đỉnh hấp thụ đặc trưng của liên kết polysaccharide gắn selen. Kỹ thuật HPLC-ICP-MS chứng minh selen vô cơ đã được tế bào nấm chuyển hóa thành các hợp chất selen hữu cơ (Se-protein và Se-polysaccharide).
  3. Hoạt tính sinh học của sinh khối nấm C. sinensis giàu selen:

    • Kháng oxy hóa: Sinh khối và các cao chiết giàu selen thể hiện khả năng bắt gốc tự do ABTS và DPPH vượt trội so với mẫu đối chứng không có selen; giá trị $\Delta OD$ năng lực khử tại nồng độ 2000 µg/mL đạt mức cao; bảo vệ tính toàn vẹn của DNA đoạn gen ITS nấm Pleurotus pulmonarius trước tác nhân oxy hóa gốc tự do hydroxyl sinh ra từ phản ứng Fenton.
    • Ức chế enzyme xanthine oxidase: Khảo sát xác định giá trị $IC_{50}$ của các phân đoạn cao chiết trên mô hình ức chế enzyme XO in vitro so với allopurinol.
    • Kháng viêm in vitro: Thể hiện qua tỷ lệ ức chế sự biến tính nhiệt của protein albumin huyết thanh bò (BSA) ở 67°C phụ thuộc vào nồng độ thử nghiệm so với diclofenac.
    • Ức chế $\alpha$-glucosidase: Ghi nhận tỷ lệ phần trăm ức chế enzyme chuyển hóa đường so với chất chuẩn acarbose.
    • Gây độc tế bào ung thư: Thử nghiệm SRB tại nồng độ 100 µg/mL cho thấy các mẫu cao chiết giàu selen ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư máu Jurkat; đồng thời không gây độc lên dòng tế bào thường fibroblast phân lập từ mô bao quy đầu người.
  4. Quy trình công nghệ và an toàn sinh học:

    • Xây dựng sơ đồ quy trình công nghệ nuôi cấy sản xuất sinh khối nấm C. sinensis giàu Se.
    • Thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng: Chuột uống dịch bột sinh khối ở thể tích tối đa 0,2 mL/10g thể trọng; theo dõi trong 72 giờ không ghi nhận chuột tử vong, không có biểu hiện hành vi bất thường, xác định chế phẩm đạt mức liều tối đa không gây chết ($D_{max}$ / $LD_0$), thuộc nhóm không độc theo bảng phân loại độc tính của Bộ Y tế.
    • Các chỉ tiêu vi sinh vật và kim loại nặng đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm.

Kết quả và những đóng góp mới

Về mặt lý luận và khoa học:

  1. Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về mức độ dung nạp và độc tính so sánh của ba nguồn selen vô cơ và hữu cơ (selenate, selenite, selenourea) trên nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007; chứng minh selenate ít gây độc nhất và phù hợp nhất cho mục đích nuôi cấy làm giàu selen.
  2. Xây dựng phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến theo bậc thang nồng độ selenate (từ 5 đến 25 mgSe/L), giúp hệ sợi nấm thích nghi với ngưỡng nồng độ khoáng vi lượng cao mà phương pháp truyền thống bị ức chế.
  3. Ứng dụng mô hình toán học bề mặt đáp ứng (Plackett–Burman, Box–Behnken và D-optimal) để xác định sự tương tác giữa các yếu tố dinh dưỡng (khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, muối khoáng) và thông số vật lý (nhiệt độ, pH, chế độ ánh sáng đơn sắc) đến sự tạo sinh khối và tích lũy selen.
  4. Chứng minh bằng phổ FT-IR và HPLC-ICP-MS rằng C. sinensis có khả năng chuyển hóa selenate vô cơ thành các dạng selen hữu cơ gắn trong cấu trúc seleno-exopolysaccharide (Se-EPS), seleno-intracellular polysaccharide (Se-IPS) và các phân đoạn cao chiết.
  5. Chứng minh việc làm giàu selen giúp gia tăng hoạt tính sinh học in vitro của C. sinensis, bao gồm khả năng chống oxy hóa (bắt gốc tự do ABTS, DPPH, năng lực khử, bảo vệ DNA), ức chế xanthine oxidase, kháng viêm in vitro, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase và gây độc tế bào ung thư (MCF-7, Jurkat) trong khi an toàn đối với tế bào lành (fibroblast).

Về mặt thực tiễn và công nghệ:

  1. Thiết lập quy trình công nghệ nuôi cấy chìm sản xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen ở quy mô phòng thí nghiệm, kiểm soát được các thông số môi trường và dinh dưỡng.
  2. Cung cấp dữ liệu độc tính cấp in vivo ($D_{max}$, $LD_0$) trên mô hình chuột nhắt trắng và các chỉ tiêu an toàn thực phẩm, tạo cơ sở khoa học để chuyển giao công nghệ sản xuất nguyên liệu cho thực phẩm chức năng và sản phẩm bảo vệ sức khỏe bổ sung selen hữu cơ.

Kiến nghị đề xuất từ tác giả:

  • Tiếp tục nghiên cứu mở rộng quy mô lên men trong các hệ thống bioreactor tự động kiểm soát oxy hòa tan và khuấy trộn.
  • Thực hiện các thử nghiệm dược lý chuyên sâu in vivo trên động vật mô hình bệnh lý (chuột đái tháo đường, chuột gây viêm hoặc mang khối u thực nghiệm) để khẳng định hiệu quả điều trị trước khi ứng dụng lâm sàng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Thử nghiệm nuôi cấy mới dừng lại ở quy mô bình/hộp nuôi 200 mL và mẻ nuôi 2 lít trong điều kiện phòng thí nghiệm tĩnh, chưa khảo sát các yếu tố thủy động học, tốc độ sục khí và truyền khối oxy trong các bồn lên men công nghiệp.
  • Các khảo sát hoạt tính dược lý (kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế enzyme, độc tính tế bào ung thư) chủ yếu thực hiện ở mức độ in vitro; chưa tiến hành đánh giá dược động học và cơ chế phân tử chi tiết in vivo.
  • Thử nghiệm an toàn sinh học trên động vật mới dừng ở độc tính cấp đường uống trong 72 giờ, chưa đánh giá độc tính bán trường diễn và độc tính trường diễn.

Hướng nghiên cứu tiếp:

  • Khảo sát quá trình lên men nấm C. sinensis giàu selen trên hệ thống bồn lên men chìm (fermentor/bioreactor) từ quy mô pilot đến công nghiệp.
  • Nghiên cứu tinh sạch sâu từng phân đoạn seleno-polysaccharide và xác định trật tự liên kết cấu trúc hóa học phân tử.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học in vivo trên các mô hình bệnh học thực nghiệm (chuột tiểu đường, chuột rối loạn lipid máu, chuột mang khối u) và thử nghiệm độc tính bán trường diễn dài ngày.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng và tham khảo cho các đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Hóa sinh và Dược học: Có thể tham khảo phương pháp luận thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa đa biến RSM (Plackett–Burman, Box–Behnken, D-optimal), quy trình nuôi cấy thích nghi nấm dược liệu với các chất gây độc vô cơ, và kỹ thuật chiết tách phân đoạn polysaccharide nội/ngoại bào.
  • Các nhà nghiên cứu phân tích kiểm nghiệm: Tham khảo quy trình phân tích định lượng vi lượng selen tổng và selen nguyên dạng bằng phương pháp phá mẫu acid kết hợp HPLC-ICP-MS và kỹ thuật quang phổ FT-IR.
  • Các doanh nghiệp và đơn vị sản xuất dược phẩm, thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Tham khảo thông số quy trình lên men lỏng nấm Cordyceps sinensis tích lũy selenate để nghiên cứu phát triển sản phẩm bổ sung selen hữu cơ khả dụng cao phục vụ sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Trong ba nguồn selen khảo sát, dạng nào thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nấm Cordyceps sinensis?
Dạng selenate ($Na_2SeO_4$) là nguồn thích hợp nhất. Kết quả thực nghiệm cho thấy trên môi trường thạch PGA ở nồng độ 40 mgSe/L, sợi nấm nuôi với selenate đạt đường kính lan tơ 5,9 ± 0,9 cm (không khác biệt có ý nghĩa với đối chứng 6,1 ± 0,5 cm, $p > 0,05$), hệ sợi mọc tròn đều, màu trắng. Trên môi trường lỏng PS ở 25 mgSe/L, sinh khối khô đạt 14,52 ± 0,82 g/L, vượt trội so với selenite (11,85 ± 1,52 g/L) và selenourea. Ngược lại, selenite ức chế nấm mạnh ở nồng độ > 25 mgSe/L (làm chuyển màu khuẩn lạc sang đỏ sậm), còn selenourea gây ức chế gần như hoàn toàn sinh khối ở nồng độ trên 30 mgSe/L.

2. Phương pháp nuôi cấy thích nghi cải tiến đối với C. sinensis bổ sung selenate được thực hiện như thế nào?
Phương pháp thích nghi cải tiến gồm 7 bước nâng dần nồng độ selenate xen kẽ giữa môi trường thạch PGA và môi trường lỏng PS: kích hoạt sợi nấm trên PGA với 5 mgSe/L trong 7 ngày; chuyển sang môi trường lỏng PS 5 mgSe/L nuôi 10 ngày; chuyển tiếp sang môi trường lỏng PS 10 mgSe/L nuôi 10 ngày; chuyển sang môi trường lỏng PS chứa 7,5 mgSe/L để phục hồi trong 10 ngày; cấy sang PGA với 15 mgSe/L ủ 10 ngày; phục hồi trên môi trường lỏng PS 15 mgSe/L trong 15 ngày; lặp lại chu kỳ tăng nồng độ và phục hồi cho đến khi hệ sợi sinh trưởng ổn định ở nồng độ 25 mgSe/L rồi lưu giữ giống trên thạch nghiêng ở 4°C.

3. Những mô hình toán học nào đã được tác giả áp dụng để tối ưu hóa quá trình nuôi cấy?
Tác giả đã ứng dụng ba mô hình toán học thống kê: thiết kế Plackett–Burman gồm 12 nghiệm thức để sàng lọc 7 biến dinh dưỡng độc lập (khoai tây, saccharose, peptone, cao nấm men, $KH_2PO_4$, $K_2HPO_4$, $MgCl_2$); mô hình Box–Behnken gồm 17 nghiệm thức ở 3 mức (-1, 0, +1) để tối ưu hóa nồng độ các chất dinh dưỡng chính; và mô hình D-optimal gồm 19 nghiệm thức ở 3 mức để tối ưu hóa 3 thông số môi trường vật lý gồm nhiệt độ (20–30°C), pH (6–8) và nguồn ánh sáng (đỏ, trắng, xanh dương).

4. Selen tích lũy trong nấm tồn tại ở những dạng nào và được xác định bằng phương pháp gì?
Selen tích lũy trong sinh khối nấm C. sinensis được chuyển hóa thành các hợp chất selen hữu cơ, bao gồm seleno-exopolysaccharide (Se-EPS), seleno-intracellular polysaccharide (Se-IPS) và các selenoprotein/amino acid. Sự hiện diện của các nhóm chức selen trong polysaccharide được xác định bằng phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR). Hàm lượng Se tổng được định lượng bằng ICP-MS sau khi phá mẫu bằng hỗn hợp acid ($HNO_3$, $HClO_4$, $H_2SO_4$). Các dạng selen nguyên dạng (SeMet, SeCys, selenite, selenate) được phân tích bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ plasma ICP-MS (HPLC-ICP-MS) sau khi thủy phân bằng enzyme proteinase K và proteinase XIV ở 50°C.

5. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường uống của sinh khối nấm giàu selen trên chuột nhắt trắng ra sao?
Thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng (uống bột sinh khối ở thể tích tối đa qua kim là 0,2 mL/10g thể trọng) theo dõi trong 72 giờ ghi nhận toàn bộ chuột trong lô thử nghiệm sống bình thường, không xuất hiện triệu chứng ngộ độc (không co giật, run rẩy, tím tái hay hoảng loạn) và không có chuột tử vong. Do đó, nghiên cứu xác định được liều dung nạp tối đa không gây chết ($D_{max}$ / $LD_0$), kết luận sinh khối nấm C. sinensis giàu selen thuộc nhóm không độc theo quy chuẩn phân loại của Bộ Y tế.


Kết luận

Luận án tiến sĩ của Lê Quốc Phong đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu thông qua việc xác lập selenate là nguồn selen tối ưu, xây dựng quy trình nuôi cấy thích nghi cải tiến giúp nấm Cordyceps sinensis CS-YK2007 chịu được nồng độ selenate lên đến 25 mgSe/L trên môi trường lỏng. Bằng việc ứng dụng thành công các mô hình toán học Plackett–Burman, Box–Behnken và D-optimal, tác giả đã chuẩn hóa các thông số dinh dưỡng và điều kiện lý hóa để tối đa hóa sinh khối và hiệu suất tích lũy selen hữu cơ dạng Se-protein và Se-polysaccharide. Các kết quả thực nghiệm in vitro và in vivo đã chứng minh sinh khối nấm giàu selen có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, ức chế enzyme xanthine oxidase, $\alpha$-glucosidase và gây độc chọn lọc trên tế bào ung thư, đồng thời đạt độ an toàn sinh học cao, tạo tiền đề khoa học cho việc phát triển các sản phẩm bổ sung vi lượng selen hữu cơ phục vụ sức khỏe cộng đồng.