ĐẶT VẤN ĐỀ Hòe giác là quả chín được phơi hoặc sấy khô của cây Hòe (Sophora japonica L.), thường được thu hoạch vào mùa đông. Vị thuốc Hòe giác đã được sử dụng trong Y dược học cổ truyền, có công năng thanh nhiệt giáng hỏa, lương huyết chỉ huyết, chủ trị nhiệt đường ruột gây đại tiện ra huyết, trĩ xuất huyết, can nhiệt gây đau đầu, chóng mặt, mắt đỏ [18]. Sophoricosid (SPH) là một isoflavon glycosid, thành phần hoạt chất chính của Hòe giác, có tác dụng chống viêm, chống dị ứng [25], [28], [29], [33]; chống oxy hóa và bảo vệ gan [22], [30]; cầm máu, chống béo phì, chống khối u, chống bệnh trĩ [25]; ngoài ra còn có tác dụng làm tăng tạo xương, giảm hủy xương, giảm tình trạng loãng xương ở phụ nữ mãn kinh [13], [21]… Do vậy, việc nghiên cứu chiết xuất nhằm thu được cao đặc có hàm lượng và hiệu suất chiết SPH cao là cần thiết, đóng vai trò quan trọng quyết định chất lượng của cao đặc vị thuốc Hòe giác. Từ trước đến nay, phương pháp sắc là phương pháp phổ biến và thông dụng đã được dân gian áp dụng để sử dụng các vị dược liệu, trong đó có cả Hòe giác.
Tuy nhiên, phương pháp sắc lại gây ra rất nhiều sự bất tiện khi sử dụng, đặc biệt là tốn nhiều thời gian và khó bảo quản. Với mong muốn phát huy tính ưu việt của thuốc cổ truyền, tiện lợi cho người bệnh, việc nghiên cứu điều chế phương thuốc thành dạng bào chế hiện đại, cao đặc Hòe giác được sử dụng nhiều làm bán thành phẩm để tiếp tục bào chế thành các dạng thành phẩm như bột cốm, viên nang, viên nén để người dùng có thể dễ dàng sử dụng hơn. Phương pháp thiết kế thí nghiệm (experimental design) và lựa chọn điều kiện tối ưu dựa trên nguyên tắc của mạng neuron nhân tạo (artificial neural network- ANN), với sự hỗ trợ của phần mềm máy tính [31] là một công cụ hiệu quả trong việc tối ưu hóa các quá trình chiết xuất. Từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc dược liệu Hòe giác giàu sophoricosid” được nghiên cứu với mục tiêu: “Tối ưu hóa quy trình chiết xuất để điều chế cao đặc Hòe giác có hàm lượng và hiệu suất chiết sophoricosid cao”.
TỔNG QUAN Vị thuốc Hòe giác 1. Vị trí, phân loại và đặc điểm thực vật của cây Hòe Vị trí phân loại: Cây Hòe có tên khoa học là Sophora japonica (L.) Schott, được phân loại thực vật học như sau [3],[35]: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae = Leguminosae) Phân họ Đậu (Faboideae = Papilionoideae) Chi Sophora (= Styphnolobium) Loài Sophora japonica L. Đặc điểm thực vật: cây gỗ, to, cao có thể đến 15 m, thân thẳng có chỏm lá tròn, vỏ hơi nứt nẻ, màu nâu sẫm. Cành nằm ngang, hình trụ, nhẵn, cong queo, màu lục nhạt và có những chấm trắng.
Lá kép lông chim lẻ, mọc so le, có 9 – 13 lá chét mọc đối, hình trứng, đỉnh nhọn, gốc tròn, nguyên, dài 3 cm, rộng 1,5 – 2,5 cm, màu lục nhạt, nhất là ở mặt dưới, hơi có lông, có lá kèm. Cụm hoa hình chùy ở đầu cành, dài 20 cm, phân nhánh nhiều. Hoa lưỡng tính, không đều, nhỏ, màu trắng hoặc vàng nhạt. Đài hình chuông, gần như nhẵn.Tràng hoa hình bướm, có màu trắng ngà.
Quả loại đậu, không mở, hình tràng hạt, nhẵn, dày và thắt nhỏ lại không đều ở giữa các hạt. Hạt 2 – 5, hình bầu dục, hơi dẹt, màu đen bóng [1], [4], [3], [11]. Tại Việt Nam, cây Hòe được trồng phổ biến ở một số tỉnh miền Bắc, nhiều nhất ở tỉnh Thái Bình. Ở các nước khác như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Triều Tiên cũng có trồng.
Ở một số nước châu Âu, cây Hòe chỉ được trồng làm cảnh [4], [26]. Cây Hòe ra hoa vào khoảng tháng 5 đến tháng 8, quả chín từ tháng 9 đến tháng 11 [1]. Bộ phận dùng Trong y học cổ truyền, nhiều bộ phận của cây Hòe được sử dụng để làm thuốc. Dược liệu là nụ hoa được gọi là ‘Hòe mễ’, hoa đã nở được gọi là ‘Hòe hoa’ và quả Hòe chín được gọi là ‘Hòe giác’ [4].
Ngoài ra, rễ, lá, cành non và vỏ cây Hòe cũng được sử dụng làm thuốc với một số công dụng nhất định [26]. Hòe giác (Fructus Sophorae) là quả chín của cây Sophora japonica L. Leguminosae), được thu hái vào mùa đông, loại bỏ tạp chất và phơi khô. Hòe giác có chiều dài 1 – 8 cm, đường kính 6 – 10 mm, bên ngoài màu vàng lục đến nâu vàng, nhăn nheo và thô ráp.
Mặt bên có đường khớp màu vàng. Kết cấu mềm, nhăn sau khi khô, dễ 2 bẻ gãy tại chỗ thắt. Hạt hình trứng, dài 6 – 11 mm, bề mặt nhẵn, màu đen đến nâu đen, rốn hạt tròn ở mặt lõm, màu trắng xám. Hạt có kết cấu cứng, hai lá mầm màu vàng đến lục.
Vỏ quả giữa mỏng, có vị đắng. Hạt có vị giống đậu khi nhai [17], [18]. Thành phần hóa học Flavonoid, alcaloid, terpenoid, acid amin, saccharid, phospholipid và các loại khác [15]. Flavonoid gồm 6 loại chính là: sophoricosid, genistin, genistein, rutin, quercetin và kaempferol [15].
Vỏ quả chứa 10,5% flavonoid toàn phần trong đó có 4,3% là rutin. Các isoflavonoid glycosid dẫn chất của genistein là genistin, sophoricosid và sophorabiosid và 7,4’-di-O-β-glucopyranosid cùng một số flavonoid khác là dẫn chất của kaempferol [4]. Hạt chứa kaempferol 7-O-α-rhamnopyranosid, sophoricosid, sophorabiosid và kaempferol 3-O-α–rhamnopyranosyl (1→6)-β-glucopyranosyl (1→2) β- glucopyranosid-7-O- β-glucopyranosid [4]. Cấu trúc hóa học của sophoricosid (SPH) Tên IUPAC: 5,7 – dihydroxy – 3 – [4 – [(2S, 3R, 4S, 5S, 6R) – 3,4,5 – trihydroxy – 6 – (hydroxymethyl)oxan – 2 – yl] oxyphenyl]chromen – 4 – on.
Công thức phân tử: C21H20O10, trọng lượng phân tử: 432,4 g/mol [39]. Với nhiều tác dụng dược lý nổi bật, đồng thời chiếm hàm lượng lớn trong quả cây Hòe, sophoricosid được ghi chép trong DĐTQ 2015 như là tiêu chuẩn để đánh giá và kiểm tra chất lượng dược liệu Hòe giác và các chế phẩm của nó. Hàm lượng sophoricosid quy định trong chuyên luận Hòe giác, phân tích bằng HPLC không được thấp 3 hơn 4% tính theo dược liệu khô [18]. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền - Tính vị, quy kinh:Vị đắng, tính hàn; quy kinh: can, đại trường [18].
- Công năng, chủ trị: Thanh nhiệt giáng hỏa, lương huyết, chỉ huyết, thu liễm [9], [18]. Chủ trị đi ngoài ra máu, giải nhiệt, trĩ, đau mắt đỏ [18]. - Kiêng kỵ: Phụ nữ có thai không được dùng quả Hòe, vì dễ bị sảy thai [1]. Tác dụng sinh học của sophoricosid có trong dược liệu Hòe giác Đã có nhiều nghiên cứu in vitro và in vivo về tác dụng sinh học của Hòe giác và sophoricosid cho thấy những tiềm năng của chúng trong việc điều trị và hỗ trợ điều trị một số bệnh lý.
Trong Y học Trung Quốc và Hàn Quốc, vị thuốc Hòe giác được sử dụng vì đặc tính chống viêm, làm mát máu và cầm máu [23]. - Tác dụng chống viêm: Cao chiết từ dược liệu Hòe giác và sophoricosid có tác dụng làm giảm sản xuất các cytokin gây viêm [25], [28], [33]. - Tác dụng chống dị ứng: Nghiên cứu trên chuột cho thấy sophoricosid có tác dụng đáng kể trong việc ức chế sự giải phóng histamin từ tế bào mast, làm giảm lượng IgE trong huyết tương [27], [29]. - Tác dụng cầm máu, chống béo phì, chống bệnh trĩ, chống khối u [25].
- Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan [22], [30]. - Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng Fructus Sophorae có tác dụng làm tăng tạo xương, giảm hủy xương, giảm tình trạng loãng xương ở chuột đã được cắt buồng trứng [13], [21]. Định tính, định lượng 1. Định tính Bằng SKLM - Pha tĩnh: Bản mỏng: Silica gel 60 F254.
- Dung môi khai triển: Hệ 1: Ethylacetat- Ethanol- Acid acetic (7,5: 1: 0,5) [17]. Hệ 2: Ethyl acetat- Acid formic- Nước (8: 1: 1) [18]. - Dung dịch thử: Cân 0,5 g dược liệu Hòe giác, thêm 10ml methanol, siêu âm trong 30 phút, lọc, ly tâm 5000 vòng trong 5 phút, thu phần dịch trong, cô đến thể tích 1ml dùng để chấm sắc ký [17]. 4 - Dung dịch đối chiếu: Dung dịch sophoricosid chuẩn, dược liệu Hòe giác chuẩn (chiết như dung dịch thử) [17].
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu phải có các vết cùng Rf và màu sắc [17]. Định lượng sophoricosid bằng HPLC a) Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC HPLC là kỹ thuật phân tách, trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Sự phân tách các chất chủ yếu dựa trên cơ chế phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của các chất trong hỗn hợp cần phân tích với hai pha là ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động.
Để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý, thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh cho phù hợp [6], [12]. Một số đại lượng đặc trưng Thời gian lưu (tR) là thời gian cần thiết để rửa giải một chất, từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector [2], [6]. Diện tích pic là đại lượng dùng để định lượng các chất [20]. Số đĩa lý thuyết (N): Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểu kiến của cột), được tính theo công thức [5], [6], [12]: N = 5,54 × ( )2 / Hoặc N = 16 × ( )2 Trong đó: W là chiều rộng đo ở đáy pic.
W1/2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao của pic Ứng dụng HPLC được ứng dụng nhiều trong kiểm nghiệm, dùng để định tính định lượng, xác định giới hạn tạp chất. - Định tính: Thông qua thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn trên sắc ký đồ. - Định lượng: Các phép định lượng bằng HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Các phương pháp định lượng thường được sử dụng trong HPLC là phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn, thêm đường chuẩn và chuẩn hóa diện tích [6].
- Xác định giới hạn tạp chất [2], [12]. 5 b) Định lượng sophoricosid trong dược liệu Hòe giác Chuẩn bị mẫu: - Dung dịch thử: Cân chính xác 2 g bột dược liệu (qua rây số 3) vào bình nón có nút mài, thêm chính xác 50 ml ethanol 70% và siêu âm (300 W, 25 kHz) trong 45 phút, làm mát, cân lại và bổ sung lượng ethanol 70% đã mất và lắc đều. Lọc và lấy chính xác 0,5 ml dịch lọc vào bình định mức 20 ml.