MỞ ĐẦU. Lý do chọn đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU.
Tổng quan về tình hình vô sinh và vô sinh nam. Gen TEX15 và vô sinh nam. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước. Tình hình nghiên cứu trên thế giới.
Tình hình nghiên cứu trong nước. Nguyên nhân gây vô sinh nam. Môi trường. Nguyên nhân do nội tiết.
Độ tuổi sinh sản. Bệnh lý ảnh hưởng đến khả năng sinh sản ở nam giới. Nguyên nhân di truyền. Tổng quan về đa hình nucleotide đơn.
Đặc điểm đa hình nucleotide đơn. Các phương pháp xác định đa hình nucleotide đơn. Phản ứng chuỗi polymerase - đa hình chiều dài đoạn giới hạn (Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism - PCR-RFLP). Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao (Denaturing High- Performance Liquid Chromatography - DHPLC).
Phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (Single-strand conformation polymorphism - SSCP). Điện di trên gel nhạy cảm với cấu trúc (Conformation- Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE). Phân tách hóa học nucleotide ghép đôi lệch (Chemical Cleavage of Mismatch - CCM).21 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tượng nghiên cứu.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Trang thiết bị và hóa chất. Trang thiết bị. Phương pháp nghiên cứu.
Tách chiết DNA tổng số. Phương pháp thiết kế mồi. Khuếch đại vùng DNA có chứa đa hình TEX15 rs142485241. Phương pháp PCR - RFLP.
Phương pháp thống kê và so sánh.5 Vấn đề y đức trong nghiên cứu y sinh học. Kết quả xác định tần số alen và kiểu gen của đa hình TEX15 rs142485241 ở hai nhóm bệnh và nhóm chứng. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mẫu máu. Khuếch đại vùng DNA có chứa TEX15 rs142485241.
Phân tích sự liên quan của đa hình TEX15 rs142485241 và bệnh vô sinh nam. 59 v KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.63 TÀI LIỆU THAM KHẢO. Tài liệu tiếng Anh. Tài liệu tiếng Việt.
73 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 95% CI 95% Confident interval Khoảng tin cậy 95% AIS Androgen insensitivity Hội chứng không nhạy syndrome cảm androgen AR Androgen Thụ thể androgen Array Microarray-based CGH comparative genomic Lai so sánh hệ gen dựa trên hybridization microarray AZF Azoospermia factor Vùng yếu tố không tinh trùng bp Base pair Cặp cơ sở (cặp nucleotide) Chemical Cleavage of Phân tách hóa học nucleotide ghép CCM Mismatch đôi lệch CNV Copy number variantion Biến dị số lượng bản sao Conformation-Sensitive Điện di trên gel nhạy cảm với cấu CSGE Gel Electrophoresis trúc Dideoxynucleotide tripho ddNTP sphate Dideoxynucleotide triphosphate Denaturing High- Performance Liquid DHPLC Chromatography Biến tính sắc ký lỏng hiệu năng cao DNA Deoxyribonucleic acid deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide dNTP triphosphate DSB Double-strand break Tách đôi sợi DNA Etylene diamine tetra EDTA acetic acid vii EST Expressed sequence tags Các thẻ trình tự được thể hiện Fluorescence in situ Kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh FISH hybridization quang Genome-Wide Nghiên cứu dùng để xác định các GWAS Association Study biến thể bộ gen có ý nghĩa thống kê HWE Hardy – Weinberg Trạng thái cân bằng Hardy – equilibrium Weinberg National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công nghệ NCBI Information sinh học Quốc gia Next Generation NGS Sequencing Giải trình tự gen thế hệ mới Non- NOA obstructive Azoospermia Azoospermia không tắc nghẽn OD Optical density Mật độ quang học OR Odd ratio Tỷ suất chênh PCR Polemerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase RE Restriction Enzyme Enzyme giới hạn Restriction Fragment RFLP Length Polymorphism. Hạn chế mảnh chiều dài đa hình Sertoli cell only SCOS syndrome Hội chứng tế bào Sertoli đơn thuần Single-strand conformation SSCP polymorphism Phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn STSs Sequence-Tagged Site Vị trí được gắn thẻ trình tự viii Single-nucleotide SNP polymorphism Đa hình đơn nucleotide TEX15 Testis Expressed 15 WES Whole exome sequencing Giải trình tự hệ gen mã hóa World Health WHO Organization Tổ chức Y tế Thế giới Y-Chromosome YCMD Microdeletion Mất đoạn NST Y ix DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Tìm hiểu các gen liên quan đến vô sinh nam.2 Tuổi tác ảnh hưởng đến quá trình sinh Testosteron ở nam giới.3 Sơ đồ các locus của vùng AZF trên nhiễm sắc thể Y.4 Đa hình nucleotide đơn trên DNA.1 Chu kỳ chạy PCR.2 Trình tự nhận biết của enzyme PfeI.3 Trình tự đoạn DNA có chứa điểm đa hình TEX15 rs142485241.1(a) Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ 227 mẫu máu của bệnh nhân vô sinh nam (VSN) trên gel agarose 1%.1(b) Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ 202 mẫu máu của người nam bình thường (VSC) trên gel agarose 1%.3 Sản phẩm xử lý PCR điện di trên gel agarose 3%.4(a) Điện di đồ các sản phẩm PCR sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn PfeI của 227 mẫu từ bệnh nhân vô sinh nam (VSN) trên gel agarose 1,5%.4(b) Điện di đồ các sản phẩm PCR sau khi xử lý bằng enzyme giới hạn PfeI của 202 mẫu từ người bình thường (VSC) trên gel agarose 1,5%. So sánh tần số alen của đa hình TEX15 rs142485241 giữa kết quả nghiên cứu và các quần thể lân cận. Lý do chọn đề tài Vô sinh là một vấn đề ngày càng phức tạp ở những nước đang phát triển, đặc biệt là ở Việt Nam, khi tỷ lệ vô sinh của các cặp đôi trong độ tuổi sinh đẻ chiếm tới 7.
Bệnh vô sinh có rất nhiều kiểu hình khác nhau, trải dài từ bất thường niệu sinh dục, rối loạn nội tiết tố, ảnh hưởng của các yếu tố miễn dịch cho tới suy giảm số lượng và chất lượng tinh trùng ở nam giới. Trong đó, các ca vô sinh có nguyên nhân từ nam giới chiếm tới 50% tổng số ca bệnh [61]. Dựa trên phương diện vị trí địa lí, một nghiên cứu để phân tích dữ liệu từ 40.000 nhiễm sắc thể Y ở người cũng cho thấy có sự hiện diện của mất đoạn siêu nhỏ trên nhiễm sắc thể Y (Y-Chromosome Microdeletion – YCMD) với khoảng 7,5% trong nam giới vô sinh trên toàn thế giới [10]. Bên cạnh những nguyên nhân do các tác động từ môi trường, yếu tố di truyền cũng được cho là đóng vai trò quan trọng và chiếm tới 10-15% nguyên nhân gây ra vô sinh ở nam giới [77].
Yếu tố di truyền gây ra vô sinh nam bao gồm đột biến số lượng nhiễm sắc thể, đột biến lặp đoạn, đảo đoạn, mất đoạn siêu nhỏ,. Trong đó, các gen liên quan đến quá trình sinh tinh được cho là những ứng cử viên cho việc xác định chính xác nguyên nhân gây ra bệnh vô sinh. Tuy nhiên, việc có đến hơn 2,000 gen liên quan đến quá trình sinh tinh khiến cho việc tìm hiểu nguyên nhân của bệnh càng trở nên khó khăn [36]. Hơn nữa, các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng những gen tham gia vào các chức năng phổ biến của tế bào nhưng có liên quan tới tế bào mầm như chết tế bào, sửa chữa DNA, giảm phân,… cũng được cho là nguyên nhân đáng kể gây vô sinh nam, chúng chiếm tới khoảng 70% những gen liên quan tới vô sinh nam [16,41,45].
Trong khi chỉ 30% còn lại là những gen liên quan tới hệ thống sinh sản của nam giới. Mặc dù đã có rất nhiều nỗ lực trong việc tìm kiếm nguyên nhân gây ra bệnh vô sinh ở nam giới, vẫn còn ít nhất 2 30% những ca vô sinh không tìm thấy nguyên nhân hay được phân loại thành những ca vô sinh không rõ nguyên nhân [16]. Ở các nghiên cứu sau này, các biến dị di truyền trên nhiễm sắc thể Y bao gồm đột biến điểm, đột biến mất đoạn hoặc biến dị số lượng bản sao (Copy number variants - CNV) đã được tìm thấy trên các bệnh nhân vô sinh nam và được chỉ ra rằng có thể làm giảm hoặc mất hoàn toàn quá trình sinh tinh [10,57]. Trong đó, mất đoạn siêu nhỏ trên nhiễm sắc thể Y ở “vùng yếu tố không tinh trùng” (Azoospermia factor - AZF) là sai lệch di truyền phổ biến thứ hai ở nam giới vô sinh, thường xảy ra ở vùng nguyên nhiễm sắc nằm ở Yq của nhiễm sắc thể Y [10,44,47].
Tần suất của chúng dao động trong khoảng 3% đến 15% ở nam giới mắc vô sinh không xuất hiện bất thường ở ống dẫn tinh, 6% đến 8% ở nam giới mắc chứng ít tinh trùng (oligozoospermia) nặng, và 0,025% ở dân số nói chung tùy thuộc vào tiêu chí lựa chọn bệnh nhân và kỹ thuật được sử dụng [1,35]. Hiện nay, nhờ sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ trong sinh học phân tử tiêu biểu như giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS), những gen liên quan tới vô sinh nam đã được chỉ ra không chỉ nằm ở nhiễm sắc thể Y mà còn nằm rải rác ở những gen trên nhiễm sắc thể thường. Bên cạnh đó, những nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen (Genome-Wide Association Studies - GWAS) cũng góp phần vào việc chỉ ra những gen ứng cử viên quan trọng có mối quan hệ mật thiết với vô sinh nam. Cho đến nay, các microarray đa hình nucleotide đơn lẻ đã xác định thành công một vài gen, chẳng hạn như SPATA16, DPY19L2, DNAH1 và TEX15, liên quan đến vô sinh nam [7,11,13,43].
Tuy nhiên, ở nước ta, nghiên cứu mới chỉ đạt ở mức độ đơn gen hoặc một vài gen, các nghiên cứu xác định tần xuất của đa hình các gen tiềm năng liên quan đến vô sinh trong quần thể xuất hiện với số lượng rất hạn chế. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình gen liên quan đến vô sinh ở nam giới thăm khám tại bệnh viện 3 trƣờng Đại học Y Hà Nội". Nghiên cứu này đặt mục tiêu xác định tần số của một số đa hình trên những gen tiềm năng liên quan đến vô sinh nam trên nhóm bệnh và nhóm chứng. Mục tiêu nghiên cứu Xác định được tần suất alen và kiểu gen của đa hình TEX15 rs142485241 ở hai nhóm bệnh và nhóm đối chứng.
Phân tích sự liên quan của đa hình này với bệnh vô sinh nam. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3. Đối tượng nghiên cứu Hai trăm hai mươi bảy (227) người nam giới mắc bệnh vô sinh. Hai trăm lẻ hai (202) người nam giới khỏe mạnh có ít nhất một người con (sinh con tự nhiên) được tuyển chọn để làm mẫu đối chứng.
Các đối tượng tình nguyện tham gia cung cấp mẫu máu cho nghiên cứu phải ký tên vào bản xác nhận đồng ý hiến mẫu cho mục đích nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu Mẫu nghiên cứu được thu thập tại Bệnh viện Trường Đại học Y, Hà Nội. Đề tài được thực hiện tại Phòng Hệ gen học người, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.