MỞ ĐẦU Dioxin là một trong số các chất ô nhiễm môi trƣờng, gây tổn thƣơng đa dạng và phức tạp đối với cơ thể con ngƣời, làm phát sinh nhiều bệnh lý đặc biệt là ung thƣ. Ngày nay, ô nhiễm dioxin do tồn lƣu sau chiến tranh và phát sinh từ các hoạt động sống của con ngƣời. Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể chuyên biệt cho hydrocarbon thơm, trong đó có dioxin và nhiều chất độc hại từ môi trƣờng, gọi chung là phối tử (ligand). Khi AhR đƣợc hoạt hóa bởi phối tử, gây điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình sinh lý quan trọng của cơ thể nhƣ: trao đổi chất và giải độc, đáp ứng miễn dịch, sinh trƣởng tế bào, tăng sinh tế bào, chết tế bào theo chƣơng trình.Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi nhiễm với các chất độc hại từ môi trƣờng nhƣ nhau, nhƣng lại chịu ảnh hƣởng cũng nhƣ có nguy cơ với ung thƣ là khác nhau, điều này có liên quan đến đa hình các gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein), là những gen quan trọng trong con đƣờng chuyển hóa các chất ngoại sinh.
Do vậy, nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP ở những ngƣời phơi nhiễm dioxin là cần thiết, làm cơ sở cho các nghiên cứu về ảnh hƣởng của dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng ở mức phân tử, đặc biệt trong bối cảnh đánh giá nguy cơ sức khỏe con ngƣời sống trong môi trƣờng phơi nhiễm dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng độc hại. Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và AIP chủ yếu trên ngƣời không phơi nhiễm dioxin. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ phân tử của dioxin phần lớn trên mô hình động vật thực nghiệm và tế bào nuôi cấy, đánh giá cơ chế tác động thông qua gây độc dioxin cấp tính, trong thời gian ngắn, chƣa có nhiều nghiên cứu trên các đối tƣợng bị phơi nhiễm dioxin trong thời gian dài. Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về gen trên đối tƣợng phơi nhiễm dioxin nhƣ các gen: p53, CYP1A1, CYP1B1, hOGG1, GSTM1, SOD.Tuy nhiên chƣa có nghiên cứu nào về gen AIP cũng nhƣ đa hình trên toàn bộ exon gen AhR ở những ngƣời phơi nhiễm dioxin.
Cho đến nay, ảnh hƣởng tác động của dioxin cũng nhƣ 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com các chất ô nhiễm môi trƣờng qua con đƣờng tín hiệu AhR vẫn đƣợc coi là phức tạp, chƣa đƣợc biết đầy đủ, có nhiều kết quả trái chiều nhau. Mặt khác, hiện nay cũng chƣa có nhiều dữ liệu về các gen chịu ảnh hƣởng bởi tác động của dioxin. Gần đây, giải mã gen thế hệ mới cho phép giải mã toàn bộ hệ gen (genome) cũng nhƣ hệ gen biểu hiện (exome) ở ngƣời, phát hiện đƣợc các đa hình và đột biến ở nhiều gen. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin”.
Mục tiêu nghiên cứu: 1. Xác định đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin; Tìm hiểu mối liên quan giữa các đa hình gen với dioxin. Bƣớc đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES - whole exome sequencing) ở ngƣời có nồng độ dioxin trong máu cao để xác định đa hình các gen AhR, AIP và một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin. Nội dung nghiên cứu: 1.
Giải trình tự nucleotide toàn bộ 11 exon của gen AhR và 06 exon của gen AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin. Phân tích, đánh giá đa hình các gen AhR, AIP và mối liên quan giữa các đa hình gen với dioxin. Phân tích ảnh hƣởng của đa hình gen AhR và AIP tới cấu trúc và chức năng protein 3. Giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) trên 01 đối tƣợng có nồng độ dioxin trong máu cao.
Phân tích, so sánh đa hình gen AhR và AIP từ kết quả WES với kết quả giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger. Phân tích đa hình một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đóng góp mới của luận án: 1. Là nghiên cứu mới ở Việt Nam về giải trình tự, phân tích đa hình toàn bộ 11 exon gen AhR trên đối tƣợng nạn nhân phơi nhiễm dioxin. Xác định 01 đa hình (rs75519181) chƣa đƣợc công bố có trên quần thể ngƣời Việt Nam.
Nghiên cứu toàn bộ 6 exon gen AIP phát hiện 01 đột biến mới c.H42N) và 01 đa hình (rs138902236) chƣa đƣợc công bố có trên quần thể ngƣời Việt Nam. Bƣớc đầu nghiên cứu giải trình toàn bộ hệ gen biểu hiệu (WES) đối tƣợng có nồng độ dioxin trong máu cao, xác định đƣợc 34 biến thể di truyền ở một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin. Góp phần làm cơ sở cho các nghiên cứu ở mức phân tử về ảnh hƣởng của dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng độc hại. 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ DIOXIN 1. Khái niệm dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin Dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin bao gồm hàng trăm hợp chất hữu cơ độc hại, tồn tại bền vững trong môi trƣờng. Thuật ngữ “Dioxin” thƣờng đƣợc sử dụng để nói đến hai nhóm chất là PCDD (Policlodibenzo-p-dioxin) và PCDF (Polyclodibenzofuran).
Trong đó, PCDD gồm 75 chất đồng phân (congener), đƣợc chia thành 8 nhóm tƣơng ứng với số nguyên tử clo có trong phân tử từ 1 đến 8. PCDF gồm 135 chất đồng phân cũng đƣợc chia 8 nhóm tƣơng ứng số nguyên tử clo. Hợp chất tƣơng tự dioxin là các PCB (Policlobiphenyl), chúng có cấu trúc và cơ chế gây nhiễm độc tƣơng tự dioxin. PCB gồm 209 chất đồng phân, chia thành 10 nhóm tƣơng ứng với số nguyên tử clo từ 1 đến 10 [5, 10, 116].
Trong các nghiên cứu đánh giá phơi nhiễm dioxin thƣờng đánh giá cả các hợp chất tƣơng tự dioxin [10]. Trong các chất dioxin thì TCDD (2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin) là chất độc nhất hay còn gọi là chất “siêu độc”. TCDD có thể gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời ngay cả khi chỉ có một lƣợng nhỏ trong cơ thể. Nồng độ của TCDD đƣợc đo bằng đơn vị phần nghìn tỷ (ppt - part per trillion) [5, 145].
Các thông số dùng đánh giá độ độc của dioxin và hợp chất tƣơng tự dioxin gồm có hệ số độc tƣơng đƣơng (TEF - Toxic Equivalency Factor), là độ độc của từng chất so với độ độc của chất độc nhất là TCDD - có hệ số độc qui ƣớc bằng 1. Hiện nay, tồn tại hai bảng hệ số độc tƣơng đƣơng: (i) - Bảng hệ số theo quy định quốc tế (I-TEF - International TEF) và (ii) - Bảng hệ số theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO-TEF - World Health Organization TEF). Chỉ số độ độc tƣơng đƣơng (TEQ - Toxic Equivalency Quantity) hay còn gọi là đƣơng lƣợng độc của mỗi chất đƣợc tính bằng nồng độ của chất đó nhân với hệ số TEF tƣơng ứng. Giá trị TEQ của dioxin thể hiện tổng độ độc của tất cả các chất đồng phân trong nhóm.
Giá trị TEQ phản ánh một cách đầy đủ và toàn diện mức độ ô nhiễm, là giá trị quan trọng để đánh giá tác động độc hại của dioxin và các hợp chất tƣơng tự dioxin [10, 191]. 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Đặc tính của dioxin Một trong những đặc điểm nổi bật của dioxin là độ bền vững cao về các mặt vật lý, hóa học và sinh học. Dioxin tồn lƣu trong các môi trƣờng khác nhau nhƣ: không khí, nƣớc, đất, trầm tích và cơ thể sinh vật.
Dioxin tồn tại bền vững, lâu dài nhất là ở trong đất. Thời gian bán hủy của dioxin ở bề mặt đất với độ sâu 0,1 cm là khoảng 9 - 15 năm, ở các lớp đất sâu hơn thì thời gian bán hủy có thể kéo dài từ 25 - 100 năm. Thời gian bán hủy của dioxin trong cơ thể ngƣời là từ 5 - 12 năm [5, 7, 9]. Dioxin có thể xâm nhập vào cơ thể ngƣời và động vật từ nhiều nguồn khác nhau và theo các con đƣờng khác nhau.
Ví dụ nhƣ ngấm qua da, hít thở phải đất, khói thải chứa dioxin hoặc ăn thực phẩm chứa dioxin. Khoảng 90% dioxin vào cơ thể ngƣời qua đƣờng ăn uống thực phẩm nhiễm dioxin [168]. Với đặc tính ái mỡ (lipophilic) và kị nƣớc (hydrophobic), khi xâm nhập vào cơ thể ngƣời và động vật, dioxin tích lũy chủ yếu trong mô mỡ và đào thải rất chậm. Vì vậy, các nhà nghiên cứu thƣờng lấy mỡ, máu và sữa mẹ để đánh giá độ tồn lƣu của dioxin trong cơ thể.
Khi nồng độ dioxin trong cơ thể cao sẽ tích tụ trong gan và liên kết bền vững với các protein có trong gan [89]. Từ năm 1961 đến 1972, Mỹ đã tiến hành cuộc chiến tranh hóa học tại miền Nam Việt Nam. Trong cuộc chiến tranh này, quân đội Mỹ đã phun rải gần 80 triệu lít chất độc hóa học mục đích phát quang và phá hoại mùa màng. Các chất độc hóa học mà Mỹ sử dụng (chất da cam, chất hồng, chất tím, chất xanh lá cây và chất trắng), trong đó nguồn chủ yếu là chất da cam đều có chứa tạp chất dioxin; có ít nhất 366 kg dioxin đƣợc rải xuống miền Nam Việt Nam [5, 10].
Chất độc da cam/dioxin đã phá hủy nghiêm trọng môi trƣờng, gây ra hậu quả nặng nề và lâu dài đối với sức khỏe con ngƣời Việt Nam [2, 7]. Các nghiên cứu cho thấy, đã nhiều năm sau chiến tranh nhƣng nồng độ dioxin vẫn còn rất cao trong cơ thể ngƣời dân sống tại những vùng sinh thái bị nhiễm chất độc hóa học nặng, nhƣ trong khu vực và xung quanh các sân bay Đà Nẵng, Biên Hoà và Phù Cát [2, 10, 35, 69]. Ngày nay, ô nhiễm dioxin còn phát sinh bởi các hoạt động sống của con ngƣời. Dioxin là chất không mong muốn, phát sinh trong quá trình sản xuất các hợp 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chất hữu cơ chứa clo và là sản phẩm phụ của các quá trình sản xuất này.
Dioxin phát sinh trong các quá trình đốt cháy nhƣ: cháy nhiên liệu trong các nhà máy, thiêu hủy rác thải sinh hoạt, công nghiệp, y tế và phát sinh từ nguồn khí thải của các phƣơng tiện giao thông. Có thể nói dioxin là một loại sản phẩm của nhiệt: Vật chất, vật liệu hữu cơ chứa clo + nhiệt độ cao Dioxin. Có tới 95% lƣợng dioxin đƣợc phát thải vào môi trƣờng chính là từ các lò đốt rác thải bẩn có chứa tác nhân clo [5]. Ngoài ra, dioxin thƣờng lẫn tạp trong thành phần của các thuốc bảo vệ thực vật.