Nghiên cứu tính đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin

Luận án tiến sĩ nghiên cứu hus nghiên cứu tính đa hình gen ahr và aip ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng trong lĩnh vực tại

• Tác giả: Lê Thị Kim Dung
• Người hướng dẫn: Nguyễn Huy Hoàng
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu tính đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ DIOXIN
• 1.1.1. Khái niệm dioxin và các hợp chất tương tự dioxin
• 1.1.2. Đặc tính của dioxin
• 1.1.3. Ảnh hưởng của dioxin đối với sức khỏe con người
• 1.2. CƠ CHẾ PHÂN TỬ TÁC ĐỘNG CỦA DIOXIN
• 1.2.1. Thụ thể AhR (Aryl hydrocarbon Receptor)
• 1.2.2. Cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR
• 1.2.3. Dioxin gây biến đổi vật chất di truyền
• 1.3. TỔNG QUAN VỀ GEN AhR
• 1.3.1. Đặc điểm gen AhR ở người
• 1.3.2. Vai trò của đa hình gen AhR trong đáp ứng dioxin và các chất ô nhiễm môi trường
• 1.4. TỔNG QUAN VỀ GEN AIP
• 1.4.1. Đặc điểm gen AIP
• 1.4.2. Đột biến gen AIP liên quan bệnh lý ở người
• 1.5. VAI TRÒ PROTEIN AIP TRONG CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU THÔNG QUA THỤ THỂ AhR
• 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN CÁC NẠN NHÂN PHƠI NHIỄM DIOXIN Ở VIỆT NAM
• 1.7. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.7.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.7.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 1.7.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 1.7.3.1. Tách chiết DNA tổng số
• 1.7.3.2. Đo quang phổ DNA
• 1.7.3.3. Điện di DNA trên gel Agarose
• 1.7.3.4. Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
• 1.7.3.5. Giải trình tự gen tự động
• 1.7.3.6. Giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES)
• 1.7.3.7. Xử lý số liệu và tính toán thống kê
• 1.8. ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
• 1.9. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 1.9.1. MỘT SỐ CHỈ SỐ SINH HỌC CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
• 1.9.2. ĐA HÌNH CÁC GEN AhR VÀ AIP
• 1.9.2.1. Tách chiết DNA tổng số
• 1.9.2.2. Khuếch đại các đoạn gen AhR và AIP
• 1.9.2.3. Phân tích đa hình gen AhR
• 1.9.2.4. Phân tích đa hình gen AIP
• 1.9.3. GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ HỆ GEN BIỂU HIỆN (WES) NGƯỜI CÓ NỒNG ĐỘ DIOXIN TRONG MÁU CAO
• 1.9.3.1. Phân tích đa hình các gen AhR và AIP từ kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện, so sánh với kết quả giải trình tự gen theo phương pháp Sanger
• 1.9.4. Phân tích biến đổi di truyền một số gen liên quan cơ chế tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP

Nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP ở nạn nhân phơi nhiễm dioxin là một lĩnh vực quan trọng trong di truyền học. Dioxin, một chất độc hại, đã gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho con người. Việc hiểu rõ về đa hình gen AhR và AIP có thể giúp xác định nguy cơ mắc bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

1.1. Định nghĩa và vai trò của gen AhR và AIP

Gen AhR (Aryl hydrocarbon Receptor) và AIP (Aryl hydrocarbon Receptor Interacting Protein) đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa phản ứng của cơ thể với các chất độc hại như dioxin. Chúng tham gia vào các quá trình sinh lý như trao đổi chất và giải độc.

1.2. Tình hình nghiên cứu hiện tại về dioxin

Nghiên cứu về dioxin chủ yếu tập trung vào các tác động của nó đối với sức khỏe con người. Tuy nhiên, các nghiên cứu về đa hình gen AhR và AIP ở những người phơi nhiễm dioxin vẫn còn hạn chế, đặc biệt là ở Việt Nam.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu đa hình gen

Nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP ở nạn nhân phơi nhiễm dioxin gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự đa dạng di truyền giữa các cá thể. Điều này có thể ảnh hưởng đến khả năng phản ứng của cơ thể với dioxin.

2.1. Đặc điểm di truyền của nạn nhân phơi nhiễm dioxin

Các nạn nhân phơi nhiễm dioxin có thể có những đặc điểm di truyền khác nhau, ảnh hưởng đến cách mà họ phản ứng với chất độc này. Việc phân tích đa hình gen là cần thiết để hiểu rõ hơn về vấn đề này.

2.2. Khó khăn trong việc thu thập mẫu và dữ liệu

Việc thu thập mẫu DNA từ các nạn nhân phơi nhiễm dioxin gặp nhiều khó khăn do điều kiện địa lý và tâm lý của người dân. Điều này có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của nghiên cứu.

III. Phương pháp nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP

Để nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP, các phương pháp hiện đại như giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) được áp dụng. Phương pháp này cho phép phát hiện các biến thể di truyền một cách chính xác.

3.1. Giải trình tự gen và phân tích dữ liệu

Giải trình tự gen AhR và AIP giúp xác định các đa hình và đột biến. Phân tích dữ liệu từ giải trình tự cho phép so sánh với các quần thể khác và tìm ra mối liên hệ với dioxin.

3.2. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu gen

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được sử dụng để khuếch đại các đoạn gen cần thiết cho nghiên cứu. Phương pháp này giúp tăng cường độ nhạy và độ chính xác của kết quả.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về đa hình gen AhR và AIP giữa các nạn nhân phơi nhiễm dioxin. Những phát hiện này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị và phòng ngừa hiệu quả hơn.

4.1. Phân tích đa hình gen AhR và AIP

Nghiên cứu đã phát hiện nhiều đa hình gen AhR và AIP, cho thấy mối liên hệ giữa các đa hình này với mức độ phơi nhiễm dioxin. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc đánh giá nguy cơ sức khỏe.

4.2. Ứng dụng trong y học và sức khỏe cộng đồng

Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng trong y học để phát triển các phương pháp điều trị cá nhân hóa cho những người phơi nhiễm dioxin, từ đó cải thiện sức khỏe cộng đồng.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP ở nạn nhân phơi nhiễm dioxin là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Những phát hiện từ nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác động của dioxin mà còn mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu tiếp theo.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu tiếp theo

Cần tiếp tục nghiên cứu để xác định rõ hơn mối liên hệ giữa đa hình gen và tác động của dioxin. Điều này sẽ giúp phát triển các biện pháp phòng ngừa và điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Hướng nghiên cứu mới trong tương lai

Nghiên cứu có thể mở rộng sang các gen khác liên quan đến cơ chế tác động của dioxin, từ đó cung cấp cái nhìn toàn diện hơn về vấn đề này.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học với đề tài "Nghiên cứu tính đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Lê Thị Kim Dung, chuyên ngành Di truyền học (mã số 62420121) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2018, dưới sự hướng dẫn khoa học của người hướng dẫn là Nguyễn Huy Hoàng.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, văn bản nêu rõ dioxin và các hợp chất tương tự dioxin là nhóm chất ô nhiễm môi trường hữu cơ độc hại, bền vững, gây tổn thương đa dạng đối với cơ thể người và làm gia tăng nguy cơ mắc nhiều bệnh lý, đặc biệt là ung thư. Ô nhiễm dioxin tại Việt Nam bắt nguồn chủ yếu từ hậu quả chiến tranh hóa học (1961 - 1972) do quân đội Mỹ phun rải gần 80 triệu lít chất độc diệt cỏ chứa tạp chất dioxin (ít nhất 366 kg dioxin), để lại tồn lưu nồng độ cao tại các điểm nóng như sân bay Biên Hòa, sân bay Đà Nẵng và sân bay Phù Cát. Bên cạnh đó, dioxin tiếp tục phát sinh từ hoạt động công nghiệp và các lò đốt rác thải chứa clo.

Ở cấp độ phân tử, cơ chế tác động của dioxin diễn ra chủ yếu qua thụ thể chuyên biệt Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) và protein tương tác Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein (AIP). Mặc dù cùng chịu phơi nhiễm môi trường như nhau, các cá thể lại bộc lộ mức độ nhạy cảm và nguy cơ bệnh lý khác nhau, điều này liên quan mật thiết đến tính đa hình di truyền của các gen AhR và AIP. Các công trình quốc tế chủ yếu khảo sát trên người không phơi nhiễm dioxin hoặc mô hình tế bào, động vật gây nhiễm độc cấp tính ngắn hạn. Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây mới khảo sát biến đổi ở một số gen riêng lẻ (như p53, CYP1A1, CYP1B1, hOGG1, GSTM1, GSTT1, SOD), chưa có công trình nào đánh giá toàn bộ 6 exon gen AIP cũng như toàn diện 11 exon gen AhR trên các đối tượng phơi nhiễm dioxin dài hạn.

Mục tiêu nghiên cứu được xác định theo văn bản gồm hai nội dung:

1. Xác định đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin; Tìm hiểu mối liên quan giữa các đa hình gen với dioxin.
2. Bước đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES - whole exome sequencing) ở người có nồng độ dioxin trong máu cao để xác định đa hình các gen AhR, AIP và một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin.

Nội dung nghiên cứu triển khai:

1. Giải trình tự nucleotide toàn bộ 11 exon của gen AhR và 06 exon của gen AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin. Phân tích, đánh giá đa hình các gen AhR, AIP và mối liên quan giữa các đa hình gen với dioxin.
2. Phân tích ảnh hưởng của đa hình gen AhR và AIP tới cấu trúc và chức năng protein.
3. Giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) trên 01 đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao. Phân tích, so sánh đa hình gen AhR và AIP từ kết quả WES với kết quả giải trình tự gen theo phương pháp Sanger. Phân tích đa hình một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin.

Về đối tượng và phạm vi:

• Nhóm phơi nhiễm gồm 94 người có tiền sử phơi nhiễm rõ ràng, cư trú trên 5 năm tại các điểm nóng chất độc da cam/dioxin (khu vực sân bay Biên Hòa và sân bay Đà Nẵng), đã được đo nồng độ dioxin trong huyết thanh máu (thuộc đề tài cấp Nhà nước KHCN-33).
• Nhóm đối chứng gồm 20 người sống tại quận Hà Đông, Hà Nội (khu vực không bị phun rải chất độc da cam/dioxin).
• Mẫu phân tích giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) là 01 cựu chiến binh sinh năm 1930, tham gia chiến đấu tại chiến trường Quảng Trị giai đoạn 1970 - 1972, có nồng độ dioxin trong máu là 19,65 ppt và có một con gái bị thiểu năng trí tuệ, dị tật bẩm sinh (thuộc đề tài NAFOSTED 106-YS.34).
• Phạm vi không gian thực nghiệm: Thực hiện tại Phòng Hệ gen học chức năng và các phòng thí nghiệm thuộc Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Xét nghiệm dioxin huyết thanh tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Y dược học quân sự (Học viện Quân y) và Trung tâm Nhiệt đới Việt - Nga.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã tổng thuật hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế về độc tính học dioxin, cấu trúc và chức năng các thụ thể AhR, AIP:

• Về dioxin và tác động sức khỏe: Thuật ngữ dioxin bao gồm PCDD (75 đồng phân) và PCDF (135 đồng phân); các hợp chất tương tự dioxin gồm PCB (209 đồng phân). Chất có độc tính cao nhất là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) với hệ số độc tương đương quy ước TEF bằng 1, nồng độ đo bằng đơn vị ppt (part per trillion). Mức độ độc hại chung được tính bằng đương lượng độc TEQ theo chuẩn I-TEF hoặc WHO-TEF. Dioxin có tính chất ái mỡ và kỵ nước, khoảng 90% xâm nhập qua đường tiêu hóa, tích lũy trong mô mỡ và liên kết protein gan, đào thải chậm với thời gian bán hủy ở cơ thể người từ 5 đến 12 năm (ở bề mặt đất là 9 - 15 năm, ở tầng đất sâu từ 25 - 100 năm). IARC và WHO (1997) xếp TCDD vào nhóm 1 chất gây ung thư ở người; Chương trình Độc học Quốc gia Hoa Kỳ đưa dioxin vào danh mục tác nhân gây ung thư năm 2001; nghiên cứu phân tích gộp (meta-analysis) năm 2016 khẳng định nồng độ TCDD huyết thanh liên quan chặt chẽ đến tử vong do mọi loại ung thư, đặc biệt là ung thư hạch không Hodgkin. Năm 2008, Bộ Y tế Việt Nam đã công bố danh mục 17 bệnh, tật, dị tật, dị dạng có liên quan đến phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin.
• Về thụ thể AhR: AhR là yếu tố phiên mã thuộc họ bHLH/PAS, gồm vùng bHLH ở đầu N (khoảng 60 amino acid) có tính bảo thủ cao giúp liên kết DNA tại promoter gen đích; vùng PAS (gồm PAS-A và PAS-B, dài 250 - 300 amino acid) chứa miền liên kết phối tử LBD và vị trí tương tác protein thành phần; vùng Q-rich ở đầu C có vai trò hoạt hóa phiên mã. Đột biến bất hoạt gen AhR (AhR-/-) trên chuột làm giảm khả năng sinh sản, teo gan và giảm tích lũy tế bào lympho (Schmidt và cs 1996; Fernandez-Salguero và cs 1995, 1997). Thực nghiệm của Shimizu và cs (2000) chứng minh khi tiếp xúc PAH, 47% chuột AhR+/+ mắc ung thư biểu mô trong khi chuột AhR-/- không mắc bệnh. Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Đăng Tôn và cộng sự ghi nhận ở những người phơi nhiễm dioxin sống trên 10 năm quanh sân bay Đà Nẵng, mức độ biểu hiện gen AhR tăng gấp 16,39 lần so với người không phơi nhiễm (p < 0,05). Đa hình gen AhR trên exon 10 được Craig J. Rowlands và cs (2010) ghi nhận đạt tần suất 0,43 ở quần thể Nam Á.
• Về con đường tín hiệu: Con đường cổ điển diễn ra khi TCDD liên kết AhR trong tế bào chất, giải phóng phức hệ khỏi các protein kèm (AIP, p23, hai phân tử HSP90), chuyển vị vào nhân kết hợp với ARNT rồi gắn lên yếu tố đáp ứng chất lạ sinh học XRE (trình tự lõi 5'-GCGTG-3') tại promoter gen đích (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2S2, GST, UDPGT, ALDH, AhRR). Con đường không cổ điển do Huang và Elferink (2012) mô tả cho thấy AhR kết hợp cùng yếu tố ức chế khối u KLF6 và protein CPS1 liên kết tại vị trí NC-XRE (chứa bốn lần lặp lại trình tự 5'-GGGA-3') trên promoter gen PAI-1 và gen p21Cip1 (CDKN1), điều hòa chu trình tế bào gan (năm 2014). Ngoài ra, phức hệ AhR/ARNT còn tương tác chéo với thụ thể estrogen ERα và ERβ tại vị trí EREs.
• Về gen AIP: Nằm tại nhiễm sắc thể 11q13.2, gồm 6 exon mã hóa protein 330 amino acid (37 kDa), mang vùng tương tự PPIase ở đầu N và 3 vùng lặp TPR (mỗi vùng 34 amino acid), kết thúc bằng xoắn α-7. Protein AIP tương đồng 100% với tinh tinh, 94% với chuột nhắt và 93% với chuột cống; tương tác với 20 protein trong tế bào. Khoảng 70 dạng đột biến gen AIP đã được mô tả liên quan đến bệnh u tuyến yên (chiếm 40% u tiết hormone sinh trưởng và 13% u tuyến thể to ở người dưới 30 tuổi). Động vật mất chức năng gen AIP bị giảm tới 60% biểu hiện gen AhR, làm tăng CYP1A1, CYP1A2 và giảm CYP1B1.
• Về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam: Tác giả Nông Văn Hải và cs (2015) đã nghiên cứu biến đổi gen, nhiễm sắc thể trên gia đình nạn nhân chất da cam/dioxin ở các gen p53, CYP1A1, AhR, CYP1B1, hOGG1, GSTM1, GSTT1, MSH2. Đề tài cấp Nhà nước KHCN-33/11-15 (TS. Nguyễn Đăng Tôn chủ nhiệm) giải mã hệ gen theo mô hình bộ ba (bố - mẹ - con). Đề tài NAFOSTED 106-YS.34 phân tích exome ở con/cháu nạn nhân bị thiểu năng trí tuệ.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án lựa chọn giải quyết là: Chưa có công trình nào tại Việt Nam khảo sát đầy đủ đa hình trên toàn bộ 11 exon của gen AhR và toàn bộ 6 exon của gen AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin; đồng thời chưa có dữ liệu đối chiếu đa hình hai gen này cùng các gen liên quan thông qua giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) trên đối tượng có nồng độ dioxin máu cao.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án xây dựng cơ sở lý thuyết dựa trên mô hình sinh học phân tử về con đường chuyển hóa phối tử qua thụ thể AhR:

• Phức hệ điều hòa trong tế bào chất gồm thụ thể AhR, hai phân tử protein sốc nhiệt HSP90, co-chaperone p23 và protein AIP.
• Sự tương tác ligand - receptor kích hoạt quá trình chuyển vị nhân, tạo phức hệ dị hợp tử AhR/ARNT nhận diện vị trí XRE (5'-GCGTG-3') hoặc phức hệ AhR/KLF6 nhận diện vị trí NC-XRE (5'-GGGA-3').
• Cơ chế gây tổn thương DNA gián tiếp của dioxin thông qua chuyển hóa sinh gốc tự do oxy hóa (ROS), dẫn đến đứt gãy sợi đơn (SSB), đứt gãy sợi đôi (DSB) và các đột biến gen.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm được thiết kế theo mô hình mô tả cắt ngang có phân tích so sánh:

• Cỡ mẫu nghiên cứu xác định theo công thức: $$n = \frac{Z^2_{1-\alpha/2} \times p \times (1-p)}{d^2}$$ Với mức ý nghĩa $\alpha = 0,05$ ($Z_{1-\alpha/2} = 1,96$), sai số cho phép $d = 0,1$, tỷ lệ ước tính $p = 0,43$ (theo tần suất đa hình exon 10 gen AhR ở quần thể Nam Á của Craig J. Rowlands và cs, 2010), tính toán được $n = 94,16$ mẫu. Nghiên cứu lựa chọn 94 đối tượng phơi nhiễm và 20 đối tượng đối chứng. Mẫu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) lựa chọn 01 cá thể phơi nhiễm có nồng độ dioxin máu cao (19,65 ppt).
• Tách chiết và kiểm tra DNA: Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần bằng kit thương mại QIAamp DNA Blood Mini Kit và QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN). Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng đo mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260 nm, tỷ số $A_{260}/A_{280}$ đạt trong khoảng 1,8 - 2,0 trên máy NanoDrop 2000c. Kiểm tra nồng độ huỳnh quang bằng Qubit dsDNA HS Assay trên máy Qubit 2.0. Điện di kiểm tra trên gel agarose nồng độ 0,8% và 1% nhuộm Ethidium bromide, ghi hình bằng hệ thống GelDoc (Bio-Rad).
• Khuếch đại PCR và giải trình tự gen Sanger: Mồi khuếch đại 11 exon gen AhR và 6 exon gen AIP được thiết kế bằng công cụ Primer-BLAST dựa trên cơ sở dữ liệu Ensembl, tổng hợp bởi hãng IDT. Thành phần phản ứng PCR (tổng thể tích 25 µl) gồm 16,7 µl nước khử ion, 3,0 µl dung dịch đệm 10X, 1,0 µl dNTP (10 mM), 1,0 µl mồi xuôi (10 pM), 1,0 µl mồi ngược (10 pM), 0,3 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) và 2,0 µl DNA khuôn (40 - 100 ng/µl). Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega). Phản ứng chu kỳ giải trình tự thực hiện bằng kit BigDye Terminator v3.1 (ABI). Sản phẩm sau phản ứng được tinh sạch bằng EDTA 125 mM và ethanol 100%, biến tính mẫu trong dung dịch formamide Hi-Di ở 95°C trong 2 phút và phân tích điện di mao quản trên máy ABI 3500 Genetic Analyzer.
• Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES): Phân cắt 3 µg DNA tổng số thành các đoạn kích thước 150 - 200 bp trên máy siêu âm Covaris E210. Tinh sạch đoạn cắt bằng hạt từ AMPure XP Bead. Làm bằng hai đầu, gắn adenin và gắn adaptor bằng bộ kit SureSelectXT Human All Exon Kit. Khuếch đại phân đoạn gắn adaptor bằng enzyme Herculase II Fusion DNA Polymerase. Đánh giá thư viện bằng DNA 1000 LabChip trên máy Agilent 2100 Bioanalyzer. Lai làm giàu với thư viện bắt giữ SureSelect Human All Exon 50M Library ở 65°C trong 24 giờ. Bắt giữ đoạn lai bằng hạt từ gắn streptavidin Dynabeads MyOne Streptavidin T1. Khuếch đại thư viện sau bắt giữ và tiến hành giải trình tự trên hệ thống giải trình tự thế hệ mới Illumina NextSeq-500.
• Xử lý số liệu và tin sinh học: So sánh dữ liệu trình tự với cơ sở dữ liệu dbSNP, Ensembl, Protein Data Bank (PDB) và Human Genetic Variation Database (HGVD).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 1 tổng thuật các dữ liệu lý thuyết và thực nghiệm về đặc tính tồn lưu, đường xâm nhập và cơ chế gây độc của dioxin đối với cơ thể người. Phân tích cấu trúc phân tử của thụ thể AhR (gen dài 50 kb trên nhiễm sắc thể 7p21.1 gồm 11 exon, mã hóa 848 amino acid) và protein AIP (gen trên nhiễm sắc thể 11q13.2 gồm 6 exon, mã hóa 330 amino acid). Chương này trình bày chi tiết hai con đường truyền tín hiệu: con đường cổ điển qua phức hệ AhR/ARNT tương tác trình tự XRE (5'-GCGTG-3') hoạt hóa phiên mã các gen CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, GST, UDPGT; và con đường không cổ điển qua phức hệ AhR/KLF6 tương tác trình tự NC-XRE (bốn đoạn lặp 5'-GGGA-3') trên gen PAI-1, p21Cip1. Đồng thời phân tích vai trò của protein AIP trong việc ổn định AhR tại bào chất và chống thoái biến bởi proteasome, cũng như mối liên hệ giữa đột biến AIP với các bệnh lý khối u ở người. Tổng quan chỉ ra khoảng trống về thiếu hụt dữ liệu khảo sát toàn bộ vùng mã hóa của hai gen AhR và AIP trên đối tượng phơi nhiễm dioxin tại Việt Nam.

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 trình bày tiêu chuẩn lựa chọn mẫu nghiên cứu gồm 94 đối tượng phơi nhiễm dioxin trên 5 năm tại sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng, cùng 20 đối tượng đối chứng tại Hà Đông, Hà Nội. Tác giả chuẩn hóa quy trình phân tích trong phòng thí nghiệm, công bố chi tiết hệ thống cặp mồi và điều kiện luân nhiệt cho từng phản ứng khuếch đại gen AhR và AIP.

Tên gen	Exon khuếch đại	Kích thước sản phẩm PCR (bp)	Nhiệt độ gắn mồi (°C) / Số chu kỳ
AhR	Exon 1	995	55°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 2	762	55°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 3	710	60°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 4	723	60°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 5	305	60°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 6	900	55°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 7 - 8	1426	63°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 9	690	60°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 10	1532	63°C / 27 chu kỳ
AhR	Exon 11	1530	55°C / 27 chu kỳ
AIP	Exon 1	466	62°C / 30 chu kỳ
AIP	Exon 2	408	62°C / 30 chu kỳ
AIP	Exon 3	673	62°C / 30 chu kỳ
AIP	Exon 4 - 5 - 6	1325	65°C / 30 chu kỳ

Chương này cũng thiết lập chi tiết quy trình tinh sạch sản phẩm PCR, giải trình tự Sanger tự động trên máy ABI 3500 và quy trình WES từ khâu phân cắt DNA bằng sóng siêu âm Covaris E210, gắn adaptor, làm giàu thư viện bắt giữ đến giải trình tự trên hệ thống Illumina NextSeq-500.

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Chỉ số sinh học của đối tượng: Ghi nhận sự phân bố về độ tuổi, giới tính, chỉ số khối cơ thể (BMI) và cơ cấu bệnh tật liên quan dioxin trong nhóm nghiên cứu theo phân loại lâm sàng của Bộ Y tế.
• Phân tích tính đa hình gen AhR: Khuếch đại và đọc trình tự thành công 11 exon của gen AhR bằng phương pháp Sanger. Kết quả ghi nhận các đa hình đơn nucleotide trên gen AhR, tập trung chủ yếu ở exon 10. Luận án phân tích tần suất allele và kiểu gen của đa hình rs2066853 (với ba kiểu gen GG, GA, AA) ở nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm dioxin, cũng như ở nhóm có nồng độ dioxin trong máu cao mắc ung thư và không mắc ung thư. Luận án xác định các đa hình rs3802082, rs75519181 và biến thể c.1459A>G (p.N487D). Trong đó, đa hình rs75519181 được ghi nhận là lần đầu tiên phát hiện trên quần thể người Việt Nam khi so sánh với cơ sở dữ liệu HGVD.
• Phân tích tính đa hình gen AIP: Khuếch đại và giải trình tự 6 exon của gen AIP. Kết quả xác định 3 đa hình gồm rs2276020, rs641081 và rs138902236; cùng biến thể c.682C>A (p.Q228K). Đa hình rs138902236 chưa từng được công bố trên quần thể người Việt Nam. Đặc biệt, luận án phát hiện 01 đột biến mới c.124C>A (p.H42N) tại exon 2 gen AIP. Kết quả mô phỏng cấu trúc không gian protein AIP cho thấy đột biến c.124C>A làm thay đổi acid amin histidine thành asparagine tại vị trí codon 42, làm thay đổi cấu hình vùng PPIase ở đầu N của protein AIP.
• Giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES): Thực hiện thành công trên đối tượng cựu chiến binh có nồng độ dioxin huyết thanh 19,65 ppt. Đối chiếu kết quả kiểu gen của AhR và AIP từ dữ liệu WES với kết quả giải trình tự Sanger cho thấy sự tương thích hoàn toàn. Từ dữ liệu WES, luận án đã sàng lọc và xác định được 34 biến thể di truyền ở một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin qua con đường thụ thể AhR.

Kết quả và những đóng góp mới

Theo công bố của tác giả trong luận án, các kết quả và đóng góp mới bao gồm:

1. Là nghiên cứu mới ở Việt Nam về giải trình tự, phân tích đa hình toàn bộ 11 exon gen AhR trên đối tượng nạn nhân phơi nhiễm dioxin. Xác định 01 đa hình (rs75519181) chưa được công bố có trên quần thể người Việt Nam.
2. Nghiên cứu toàn bộ 6 exon gen AIP phát hiện 01 đột biến mới c.124C>A (p.H42N) và 01 đa hình (rs138902236) chưa được công bố có trên quần thể người Việt Nam.
3. Bước đầu nghiên cứu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao, xác định được 34 biến thể di truyền ở một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin.
4. Góp phần làm cơ sở cho các nghiên cứu ở mức phân tử về ảnh hưởng của dioxin và các chất ô nhiễm môi trường độc hại.

Về mặt kiến nghị ứng dụng, tác giả đề xuất tiếp tục khai thác các chỉ dấu biến thể gen AhR và AIP đã phát hiện làm căn cứ sinh học phục vụ nghiên cứu độc học di truyền, hỗ trợ công tác đánh giá nguy cơ sức khỏe và định hướng chẩn đoán các tổn thương bệnh lý ở người phơi nhiễm dioxin.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt hạn chế, văn bản luận án nêu rõ:

• Do giới hạn về nguồn lực và phạm vi nghiên cứu, phương pháp giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) mới bước đầu thực hiện trên 01 mẫu đối tượng có nồng độ dioxin trong máu cao.
• Cỡ mẫu nghiên cứu cắt ngang gồm 94 mẫu phơi nhiễm và 20 mẫu đối chứng còn ở quy mô hẹp, chưa đủ để phân tích tương quan thống kê đa biến sâu sắc giữa từng biến thể di truyền hiếm gặp với từng dạng bệnh lý chuyên biệt trong danh mục bệnh tật do dioxin gây ra.

Về hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng phạm vi giải trình tự WES trên số lượng đối tượng phơi nhiễm dioxin lớn hơn, kết hợp phân nhóm bệnh lý cụ thể.
• Tiến hành các nghiên cứu thực nghiệm sinh học chức năng (in vitro) nhằm đánh giá tác động cơ học trực tiếp của đột biến mới c.124C>A (p.H42N) đối với khả năng liên kết của protein AIP với thụ thể AhR và các protein thành phần trong tế bào chất.

Giá trị tham khảo

Luận án mang lại giá trị tham khảo cụ thể cho các nhóm đối tượng học thuật và ứng dụng:

• Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học thuộc các chuyên ngành Di truyền học, Sinh học phân tử, Độc học môi trường và Công nghệ sinh học y sinh có thể khai thác hệ thống dữ liệu về cơ chế phân tử của thụ thể AhR và quy trình kỹ thuật phòng thí nghiệm.
• Các nhà nghiên cứu và cơ quan quản lý chính sách thuộc lĩnh vực khắc phục hậu quả chất độc hóa học/dioxin sau chiến tranh (như Văn phòng Ban Chỉ đạo 33, Hội Nạn nhân chất độc da cam/dioxin Việt Nam) có thể tham khảo nguồn dữ liệu phân tử thực tế trên đối tượng phơi nhiễm tại các điểm nóng sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa.
• Phần đáng tham khảo nhất trong luận án gồm: danh mục các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho 11 exon gen AhR và 6 exon gen AIP (Bảng 2.1, Bảng 2.2); quy trình chuẩn bị thư viện giải trình tự exome thế hệ mới bằng hóa chất SureSelectXT trên hệ thống Illumina; và số liệu phân bố tần suất allele, kiểu gen các đa hình rs2066853, rs75519181, rs2276020, rs641081, rs138902236 đối chiếu với cơ sở dữ liệu HGVD.

Câu hỏi thường gặp

• Câu hỏi 1: Thụ thể AhR và protein AIP có vai trò phân tử như thế nào trong cơ chế đáp ứng độc tính của dioxin?
  • Trả lời: Thụ thể AhR là yếu tố phiên mã chuyên biệt liên kết với dioxin và các hợp chất hydrocarbon thơm. Khi không có phối tử, AhR nằm trong tế bào chất dưới dạng bất hoạt, liên kết với hai phân tử HSP90, p23 và protein AIP. Protein AIP giữ vai trò duy trì sự ổn định, định vị AhR trong bào tương và chống lại sự phân hủy bởi proteasome. Khi dioxin gắn vào, phức hệ được hoạt hóa, chuyển vị vào nhân tế bào và liên kết với ARNT để bám lên trình tự XRE (5'-GCGTG-3'), kích hoạt phiên mã các gen giải độc pha 1 và pha 2 như CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1.
• Câu hỏi 2: Cỡ mẫu 94 đối tượng phơi nhiễm được tính toán dựa trên cơ sở khoa học nào?
  • Trả lời: Cỡ mẫu được xác định theo công thức tính mẫu nghiên cứu cắt ngang với độ tin cậy 95% ($\alpha = 0,05$; $Z = 1,96$), khoảng sai lệch $d = 0,1$, và tỷ lệ ước tính $p = 0,43$ (dựa trên tần suất đa hình exon 10 gen AhR ở quần thể người Nam Á theo nghiên cứu của Craig J. Rowlands và cs, 2010). Kết quả tính toán cho ra $n = 94,16$, từ đó chọn 94 đối tượng phơi nhiễm dioxin trên 5 năm tại sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng đã có xét nghiệm nồng độ dioxin trong huyết thanh.
• Câu hỏi 3: Luận án đã phát hiện những biến thể di truyền và đột biến gen mới nào trên gen AhR và gen AIP?
  • Trả lời: Trên gen AhR, luận án phát hiện đa hình rs75519181 tại exon 10 chưa từng được công bố trên quần thể người Việt Nam. Trên gen AIP, nghiên cứu phát hiện 01 đột biến mới c.124C>A (p.H42N) tại exon 2 làm thay đổi acid amin histidine thành asparagine tại vị trí 42 của protein AIP, đồng thời phát hiện đa hình rs138902236 lần đầu tiên được ghi nhận xuất hiện ở quần thể người Việt Nam khi so sánh với cơ sở dữ liệu biến thể di truyền người HGVD.
• Câu hỏi 4: Quy trình giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) được thực hiện trên đối tượng nào và đạt kết quả ra sao?
  • Trả lời: Kỹ thuật WES được thực hiện trên mẫu máu toàn phần của 01 cựu chiến binh sinh năm 1930, từng chiến đấu tại Quảng Trị giai đoạn 1970 - 1972, có nồng độ dioxin trong máu cao là 19,65 ppt và có con gái bị dị tật bẩm sinh, thiểu năng trí tuệ. Kết quả WES hoàn toàn tương thích với kết quả giải trình tự Sanger trên các exon của gen AhR và AIP; đồng thời phát hiện 34 biến thể di truyền thuộc các gen liên quan đến con đường tín hiệu tác động của dioxin thông qua thụ thể AhR.
• Câu hỏi 5: Con đường tín hiệu không cổ điển của thụ thể AhR khác biệt gì so với con đường cổ điển?
  • Trả lời: Khác với con đường cổ điển (AhR kết hợp ARNT liên kết vị trí XRE có lõi 5'-GCGTG-3' để biểu hiện họ enzyme CYP), ở con đường không cổ điển, AhR liên kết với yếu tố ức chế khối u KLF6 cùng sự tham gia của CPS1 để bám vào vị trí NC-XRE (mang bốn lần lặp lại trình tự 5'-GGGA-3') trên promoter gen PAI-1 và gen p21Cip1 (CDKN1), tham gia điều hòa chu trình tế bào và tái tạo gan. Ngoài ra, phức hệ AhR/ARNT còn tương tác trực tiếp với thụ thể estrogen ERα và ERβ để liên kết vào vị trí EREs trên promoter các gen phụ thuộc estrogen.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thị Kim Dung đã giải trình tự toàn bộ 11 exon của gen AhR và 6 exon của gen AIP trên 94 đối tượng nạn nhân phơi nhiễm dioxin tại các điểm nóng Đà Nẵng, Biên Hòa cùng 20 mẫu đối chứng. Công trình đã phát hiện 01 đột biến mới c.124C>A (p.H42N) trên gen AIP và hai biến thể di truyền rs75519181 (gen AhR), rs138902236 (gen AIP) lần đầu tiên được ghi nhận trên quần thể người Việt Nam. Kết quả bước đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES) trên đối tượng có nồng độ dioxin máu cao 19,65 ppt đã xác thực độ chính xác của phương pháp giải trình tự và sàng lọc được 34 biến thể di truyền liên quan con đường thụ thể AhR, cung cấp cơ sở dữ liệu sinh học phân tử phục vụ đánh giá ảnh hưởng sức khỏe do phơi nhiễm dioxin.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Dioxin là một trong số các chất ô nhiễm môi trƣờng, gây tổn thƣơng đa dạng và phức tạp đối với cơ thể con ngƣời, làm phát sinh nhiều bệnh lý đặc biệt là ung thƣ. Ngày nay, ô nhiễm dioxin do tồn lƣu sau chiến tranh và phát sinh từ các hoạt động sống của con ngƣời. Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) là thụ thể chuyên biệt cho hydrocarbon thơm, trong đó có dioxin và nhiều chất độc hại từ môi trƣờng, gọi chung là phối tử (ligand). Khi AhR đƣợc hoạt hóa bởi phối tử, gây điều hòa biểu hiện các gen tham gia nhiều quá trình sinh lý quan trọng của cơ thể nhƣ: trao đổi chất và giải độc, đáp ứng miễn dịch, sinh trƣởng tế bào, tăng sinh tế bào, chết tế bào theo chƣơng trình.Các cá thể khác nhau, mặc dù phơi nhiễm với các chất độc hại từ môi trƣờng nhƣ nhau, nhƣng lại chịu ảnh hƣởng cũng nhƣ có nguy cơ với ung thƣ là khác nhau, điều này có liên quan đến đa hình các gen AhR và AIP (Aryl hydrocarbon receptor Interacting Protein), là những gen quan trọng trong con đƣờng chuyển hóa các chất ngoại sinh.

Do vậy, nghiên cứu đa hình gen AhR và AIP ở những ngƣời phơi nhiễm dioxin là cần thiết, làm cơ sở cho các nghiên cứu về ảnh hƣởng của dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng ở mức phân tử, đặc biệt trong bối cảnh đánh giá nguy cơ sức khỏe con ngƣời sống trong môi trƣờng phơi nhiễm dioxin và các chất ô nhiễm môi trƣờng độc hại. Trên thế giới, các nghiên cứu về gen AhR và AIP chủ yếu trên ngƣời không phơi nhiễm dioxin. Nghiên cứu ảnh hƣởng mức độ phân tử của dioxin phần lớn trên mô hình động vật thực nghiệm và tế bào nuôi cấy, đánh giá cơ chế tác động thông qua gây độc dioxin cấp tính, trong thời gian ngắn, chƣa có nhiều nghiên cứu trên các đối tƣợng bị phơi nhiễm dioxin trong thời gian dài. Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về gen trên đối tƣợng phơi nhiễm dioxin nhƣ các gen: p53, CYP1A1, CYP1B1, hOGG1, GSTM1, SOD.Tuy nhiên chƣa có nghiên cứu nào về gen AIP cũng nhƣ đa hình trên toàn bộ exon gen AhR ở những ngƣời phơi nhiễm dioxin.

Cho đến nay, ảnh hƣởng tác động của dioxin cũng nhƣ 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] các chất ô nhiễm môi trƣờng qua con đƣờng tín hiệu AhR vẫn đƣợc coi là phức tạp, chƣa đƣợc biết đầy đủ, có nhiều kết quả trái chiều nhau. Mặt khác, hiện nay cũng chƣa có nhiều dữ liệu về các gen chịu ảnh hƣởng bởi tác động của dioxin. Gần đây, giải mã gen thế hệ mới cho phép giải mã toàn bộ hệ gen (genome) cũng nhƣ hệ gen biểu hiện (exome) ở ngƣời, phát hiện đƣợc các đa hình và đột biến ở nhiều gen. Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin”.

Mục tiêu nghiên cứu: 1. Xác định đa hình gen AhR và AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin; Tìm hiểu mối liên quan giữa các đa hình gen với dioxin. Bƣớc đầu giải trình tự toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES - whole exome sequencing) ở ngƣời có nồng độ dioxin trong máu cao để xác định đa hình các gen AhR, AIP và một số gen liên quan đến cơ chế tác động của dioxin. Nội dung nghiên cứu: 1.

Giải trình tự nucleotide toàn bộ 11 exon của gen AhR và 06 exon của gen AIP ở các nạn nhân phơi nhiễm dioxin. Phân tích, đánh giá đa hình các gen AhR, AIP và mối liên quan giữa các đa hình gen với dioxin. Phân tích ảnh hƣởng của đa hình gen AhR và AIP tới cấu trúc và chức năng protein 3.