Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Cần tây (Apium graveolens L.) là loài thực vật thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), được trồng phổ biến làm thực phẩm và được sử dụng trong y học cổ truyền tại nhiều quốc gia để điều trị bệnh gút và các bệnh lý xương khớp. Các nghiên cứu dược lý hiện đại đã chứng minh quả cần tây có tác dụng hạ acid uric huyết thanh, ức chế enzym xanthin oxidase (XO), chống viêm và giảm đau. Trong thành phần hóa học của quả cần tây, nhóm hợp chất flavonoid đóng vai trò quan trọng, tiêu biểu là hai hoạt chất chính: apigenin và luteolin. Hai hợp chất này đã được chứng minh có khả năng ức chế trực tiếp enzym xanthin oxidase và hạ acid uric máu qua các mô hình thực nghiệm in vivo.
Trong kỹ thuật chiết xuất dược liệu truyền thống, apigenin và luteolin thường được tách chiết bằng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol hoặc hexan. Mặc dù mang lại hiệu suất thu hồi tương đối cao, các dung môi hữu cơ tồn tại nhiều nhược điểm nghiêm trọng như tính độc hại đối với sức khỏe con người, nguy cơ cháy nổ cao và gây ô nhiễm môi trường. Việc ứng dụng các nguyên tắc hóa học xanh nhằm tìm kiếm các hệ dung môi thân thiện với môi trường đang trở thành xu hướng tất yếu. Nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự (2021) đã sử dụng hệ dung môi eutectic sâu (DES) để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây. Tuy nhiên, hệ DES vẫn tồn tại hạn chế về độ nhớt cao và áp suất hơi thấp, gây khó khăn cho quá trình thẩm thấu vào mô dược liệu và tinh chế sản phẩm sau chiết.
Để khắc phục những hạn chế trên, $\beta$-cyclodextrin ($\beta$-CD) hòa tan trong nước được lựa chọn như một dung môi xanh thế hệ mới. $\beta$-cyclodextrin có cấu trúc khoang kỵ nước và bề mặt ngoài ưa nước, có khả năng tạo phức bao với các phân tử hữu cơ kém tan như flavonoid, từ đó làm tăng độ tan, cải thiện độ ổn định và tăng hiệu suất chiết xuất mà không cần sử dụng dung môi hữu cơ độc hại.
Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ của sinh viên Bùi Thị Thơm (Trường Đại học Dược Hà Nội, năm 2022) được thực hiện nhằm giải quyết 2 mục tiêu cụ thể:
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây với sự hỗ trợ của $\beta$-cyclodextrin.
- So sánh khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây của $\beta$-cyclodextrin với các dung môi thông thường như methanol, ethanol 70% và nước.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Quả chín phơi khô của cây cần tây (Apium graveolens L.), thu hái tại huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định, Việt Nam. Mẫu thực vật có hoa được giám định và lưu trữ tiêu bản tại Phòng tiêu bản - Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội với số hiệu HNIP/18542/19.
- Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát các thông số kỹ thuật chiết xuất siêu âm ở nhiệt độ phòng (thời gian chiết, nồng độ $\beta$-CD, tỷ lệ dung môi/dược liệu); định lượng hoạt chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM); thực hiện tại Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội trong năm 2022.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận kết hợp cơ sở lý thuyết về hóa học hợp chất tự nhiên, hóa học supramolecular (hóa học siêu phân tử) của cyclodextrin và các phương pháp thống kê quy hoạch thực nghiệm hiện đại:
- Cơ sở lý thuyết về cyclodextrin: Cyclodextrin là các oligosaccharid mạch vòng tạo thành từ các đơn vị D-glucopyranose liên kết $\alpha$-(1,4)-glycosid dạng hình nón cụt. Trong đó, $\beta$-CD gồm 7 đơn vị glucose, có đường kính khoang trong từ 6,0 đến 6,6 Å và thể tích lỗ trống 262 ml/mol, rất tương thích về mặt không gian lập thể để tạo phức bao theo tỷ lệ 1:1 với các nhân polyphenol/flavonoid như apigenin và luteolin thông qua tương tác kỵ nước và lực Van der Waals. $\beta$-CD được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) xếp loại an toàn (GRAS) và được chấp thuận tại Châu Âu làm phụ gia thực phẩm (E459) với mức ADI là 5 mg/kg thể trọng/ngày.
- Phương pháp chiết xuất: Sử dụng kỹ thuật chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (bể siêu âm Elmasonic) ở nhiệt độ phòng, sau đó ly tâm dịch chiết với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch trong.
- Phương pháp định lượng HPLC-DAD: Định lượng đồng thời apigenin và luteolin trên hệ thống HPLC Shimadzu (bơm LC-20AD, đầu dò DAD SPD-M20A, bộ tiêm mẫu tự động SIL-20C, bộ điều nhiệt cột CTO-20A). Điều kiện sắc ký:
- Cột phân tích: Shim-pack GIS C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}; 5\text{ }\mu\text{m}$).
- Pha động: Acetonitril - Dung dịch acid phosphoric 0,1% (tỷ lệ 40:60, v/v).
- Bước sóng phát hiện: 335 nm.
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 20 $\mu$l.
- Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa:
- Phương pháp thay đổi từng yếu tố (OFAT): Sàng lọc sơ bộ ảnh hưởng đơn lẻ của thời gian chiết (10–60 phút), nồng độ $\beta$-CD (5–30 mg/ml) và tỷ lệ dung môi/dược liệu (15–30 ml/g).
- Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM): Thiết kế ma trận thực nghiệm Box-Behnken gồm 3 yếu tố độc lập ở 3 mức mã hóa (-1, 0, +1) với tổng cộng 18 thí nghiệm (gồm 6 thí nghiệm lặp tại tâm).
- Mô hình hóa và xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến (MLR) để thiết lập hàm đa thức bậc 2 trên phần mềm Design-Expert 13, phân tích phương sai (ANOVA) để kiểm tra độ tương thích của mô hình thông qua các chỉ số $p$-value, Lack of Fit, $R^2$, $R^2_{adjusted}$, $R^2_{predicted}$ và tối ưu hóa đa mục tiêu bằng phương pháp hàm kỳ vọng (Desirability function).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan
Chương này hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến đối tượng nghiên cứu và dung môi chiết xuất:
- Tổng quan về quả cần tây: Trình bày đặc điểm thực vật học, nguồn gốc và thành phần hóa học chính gồm tinh dầu (1,5–3% với các hợp chất đặc trưng nhóm phthalid như sedanenolid, 3-n-butyl phthalid), coumarin (khoảng 20 hợp chất furanocoumarin) và flavonoid (19 hợp chất đã được phân lập, chủ yếu là dẫn xuất của apigenin và luteolin). Tổng hợp dữ liệu dược lý chứng minh tác dụng ức chế XO, hạ acid uric huyết thanh trên chuột nhắt trắng, tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan và viêm khớp do tinh thể natri urat, tác dụng giảm đau cấp/mạn tính tương đương ibuprofen và naproxen. Đồng thời, chương 1 điểm lại các công trình chiết xuất apigenin và luteolin trước đó bằng enzym pectinase, chất lỏng ion và hệ dung môi eutectic (DES).
- Tổng quan về cyclodextrin: Phân tích chi tiết cấu trúc không gian hình nón cụt của các cyclodextrin tự nhiên ($\alpha$-CD, $\beta$-CD, $\gamma$-CD) và các dẫn xuất biến tính (HP-$\beta$-CD, methyl-$\beta$-CD, sulfobutyl ether-$\beta$-CD). Tổng kết bảng dữ liệu gồm 16 hợp chất flavonoid đã được chứng minh tạo phức bao thành công với cyclodextrin bằng các kỹ thuật phổ nghiệm (FT-IR, DSC, XRD, SEM, NMR, MS). Phân tích ưu thế của $\beta$-CD về mặt kinh tế, độ an toàn và khả năng ứng dụng làm dung môi chiết xuất xanh cho các hợp chất tự nhiên.
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương này trình bày chi tiết về nguồn gốc nguyên liệu, trang thiết bị, hóa chất và quy trình thực nghiệm:
- Nguyên liệu: Quả cần tây phơi khô, xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy mất khối lượng ($A% = 9,37%$). Bột dược liệu được chuẩn hóa qua rây kích thước mắt rây 250 $\mu$m.
- Thiết lập đường chuẩn HPLC: Xây dựng đường chuẩn tuyến tính cho apigenin và luteolin tại bước sóng 335 nm, thiết lập công thức tính toán hàm lượng hoạt chất ($X$, mg/g dược liệu khô tuyệt đối) dựa trên diện tích pic sắc ký, khối lượng cân ($m = 0,2000\text{ g}$), thể tích dung môi chiết ($V = 4\text{ ml}$) và độ ẩm $A%$.
- Quy hoạch thực nghiệm RSM: Mã hóa 3 biến độc lập: Thời gian chiết $X_1$ (30–60 phút), Nồng độ $\beta$-CD $X_2$ (10–30 mg/ml), Tỷ lệ dung môi/dược liệu $X_3$ (15–25 ml/g). Biến phụ thuộc (đáp ứng) là hàm lượng apigenin ($Y_1$, mg/g) và luteolin ($Y_2$, mg/g).
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm thu được từ quá trình khảo sát đơn yếu tố, tối ưu hóa đa biến và so sánh dung môi:
-
Kết quả khảo sát OFAT:
- Khảo sát thời gian (10–60 phút): Hàm lượng apigenin và luteolin tăng nhanh từ 10 đến 30 phút (apigenin từ 0,0601 lên 0,0984 mg/g; luteolin từ 0,3528 lên 0,6625 mg/g), sau đó đạt trạng thái bão hòa khuếch tán từ 30 đến 60 phút. Khoảng thời gian 30–60 phút được chọn cho RSM.
- Khảo sát nồng độ $\beta$-CD (5–30 mg/ml): Hàm lượng hoạt chất tăng dần và đạt đỉnh ở nồng độ 20 mg/ml, sau đó có xu hướng giảm nhẹ ở 30 mg/ml do độ nhớt dung dịch tăng cản trở sự thấm vào mô thực vật. Khoảng nồng độ 10–30 mg/ml được chọn cho RSM.
- Khảo sát tỷ lệ dung môi/dược liệu (15–30 ml/g): Tỷ lệ 20 ml/g cho hàm lượng chiết cao nhất. Tăng lên 30 ml/g làm giảm hiệu quả do hòa tan thêm nhiều tạp chất và làm loãng dịch chiết. Khoảng tỷ lệ 15–25 ml/g được chọn cho RSM.
-
Kết quả xây dựng và đánh giá mô hình hồi quy bậc 2: Phương trình hồi quy biểu diễn theo giá trị thực: $$\begin{aligned} Y_1 (\text{Apigenin}) = &-0,516215 + 0,012318 X_1 + 0,015003 X_2 + 0,010604 X_3 \ &- 0,000118 X_1^2 - 0,000348 X_2^2 \ Y_2 (\text{Luteolin}) = &-1,76136 + 0,049601 X_1 + 0,045620 X_2 + 0,039202 X_3 \ &+ 0,000605 X_1 X_3 - 0,000603 X_1^2 - 0,000882 X_2^2 - 0,001128 X_3^2 \end{aligned}$$
-
Phân tích phương sai (ANOVA): Cả hai mô hình đều có ý nghĩa thống kê cao ($p < 0,0001$; giá trị $F$ đạt 127,17 đối với $Y_1$ và 576,45 đối với $Y_2$). Kiểm định sự không phù hợp (Lack of Fit) đều không có ý nghĩa thống kê ($p = 0,4803$ cho apigenin và $p = 0,2595$ cho luteolin, đều $> 0,05$), chứng tỏ mô hình tương thích tốt với dữ liệu thực nghiệm.
-
Thông số chất lượng mô hình: $R^2$ của mô hình apigenin đạt $> 0,99$ ($R^2_{pred} = 0,9531$); $R^2$ của mô hình luteolin đạt $> 0,99$ ($R^2_{pred} = 0,9861$). Độ chênh lệch giữa $R^2_{adj}$ và $R^2_{pred}$ đều nhỏ hơn 0,1.
-
Tối ưu hóa và thẩm định: Điểm tối ưu lý thuyết (hàm kỳ vọng $D = 1,00$) gồm: thời gian 56,94 phút; nồng độ $\beta$-CD 24,81 mg/ml; tỷ lệ dung môi/dược liệu 24,35 ml/g. Điều kiện quy tròn thực nghiệm được chọn là: thời gian 57 phút, nồng độ $\beta$-CD 25 mg/ml, tỷ lệ dung môi/dược liệu 25 ml/g. Thực nghiệm lặp lại 3 lần cho kết quả thực nghiệm sát với dự đoán (độ chính xác đạt $99,32%$ cho apigenin và $99,36%$ cho luteolin, $RSD < 5%$).
-
So sánh hiệu quả chiết xuất giữa các dung môi: Tại điều kiện tối ưu, hiệu suất chiết xuất tăng theo thứ tự: Nước < Ethanol 70% < Methanol < $\beta$-CD. Dung dịch $\beta$-CD cho hàm lượng apigenin cao gấp 3 lần nước, gấp 2 lần ethanol 70% và methanol; hàm lượng luteolin cao gấp 2 lần nước, gấp 1,5 lần ethanol 70% và methanol.
Kết quả và đóng góp
Số liệu thực nghiệm chính
Bảng tổng hợp kết quả thẩm định mô hình tại điều kiện tối ưu hóa (57 phút, 25 mg/ml $\beta$-CD, 25 ml/g dung môi/dược liệu):
| Chỉ số đánh giá | Giá trị dự đoán lý thuyết | Giá trị thực nghiệm ($n=3$) | Độ chính xác của mô hình |
|---|---|---|---|
| Hàm lượng Apigenin (mg/g) | 0,146 | $0,147 \pm 0,004$ | $99,32%$ |
| Hàm lượng Luteolin (mg/g) | 0,776 | $0,781 \pm 0,008$ | $99,36%$ |
So sánh hiệu quả chiết xuất giữa dung môi $\beta$-CD và các dung môi đối chứng:
| Tiêu chí so sánh | Dung môi $\beta$-CD/Nước (Điều kiện tối ưu) | Dung môi Methanol | Dung môi Ethanol 70% | Dung môi Nước cất |
|---|---|---|---|---|
| Hàm lượng Apigenin | Cao nhất (~0,147 mg/g) | Bằng ~1/2 dung dịch $\beta$-CD | Bằng ~1/2 dung dịch $\beta$-CD | Bằng ~1/3 dung dịch $\beta$-CD |
| Hàm lượng Luteolin | Cao nhất (~0,781 mg/g) | Bằng ~1/1,5 dung dịch $\beta$-CD | Bằng ~1/1,5 dung dịch $\beta$-CD | Bằng ~1/2 dung dịch $\beta$-CD |
| Nhiệt độ chiết xuất | Nhiệt độ phòng (không gia nhiệt) | Thường cần hồi lưu/gia nhiệt | Thường cần gia nhiệt | Thường cần gia nhiệt |
| Tính an toàn & Môi trường | Không độc, không cháy nổ, chuẩn GRAS | Độc tính cao, dễ cháy, ô nhiễm | Dễ bay hơi, nguy cơ cháy nổ | An toàn, nhưng hiệu suất chiết thấp |
Đóng góp mới của khóa luận
- Tiên phong về mặt học thuật: Khóa luận là công trình nghiên cứu đầu tiên ứng dụng dung môi xanh $\beta$-cyclodextrin trong nước để chiết xuất đồng thời hai hoạt chất apigenin và luteolin từ quả cây cần tây (Apium graveolens L.).
- Ưu điểm kỹ thuật vượt trội: Quy trình chiết xuất đạt hiệu suất tương đương với hệ dung môi eutectic thế hệ mới (DES: betain - propylen glycol 1:8 trong nghiên cứu năm 2021 đạt 0,1532 mg/g apigenin và 0,7237 mg/g luteolin) nhưng vận hành hoàn toàn ở nhiệt độ phòng, không cần gia nhiệt, độ nhớt dịch chiết thấp, giúp tiết kiệm năng lượng, đơn giản hóa quy trình công nghệ và hạn chế tối đa nguy cơ phân hủy nhiệt của hoạt chất.
- Đóng góp ứng dụng: Cung cấp thông số công nghệ chuẩn xác và phương pháp định lượng HPLC đáng tin cậy phục vụ nghiên cứu bào chế các chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút từ dược liệu cần tây.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
- Hạn chế: Toàn bộ các khảo sát thực nghiệm trong khóa luận mới được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm với lượng mẫu nhỏ ($0,2000\text{ g}$ bột dược liệu/mẫu chiết) và sử dụng thiết bị chiết siêu âm gián đoạn dạng bể; chưa tiến hành khảo sát ở các mẻ chiết quy mô lớn hơn cũng như chưa thực hiện bước phân lập tinh chế cao chiết sau phức hợp để đánh giá độ ổn định của phức bao ở dạng rắn.
- Hướng nghiên cứu tiếp theo (theo kiến nghị của tác giả): Tiến hành nghiên cứu nâng cấp và thẩm định quy trình chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây có sự hỗ trợ của $\beta$-cyclodextrin ở quy mô pilot và quy mô sản xuất công nghiệp.
Giá trị tham khảo
Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao đối với các đối tượng và định hướng nghiên cứu sau:
- Sinh viên, học viên chuyên ngành Dược học, Hóa thực vật và Công nghệ chiết xuất: Tham khảo phương pháp luận khoa học trong việc ứng dụng hóa học xanh, kỹ thuật tạo phức bao phân tử với cyclodextrin để chiết xuất các hợp chất tự nhiên kém tan trong nước.
- Các nhà nghiên cứu quy hoạch thực nghiệm: Tham khảo quy trình từng bước áp dụng phương pháp thiết kế thí nghiệm Box-Behnken (RSM), phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), đánh giá chỉ số Lack of Fit và tối ưu hóa hàm kỳ vọng trên phần mềm Design-Expert.
- Cán bộ kiểm nghiệm và nghiên cứu phát triển sản phẩm (R&D): Tham khảo các thông số vận hành sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) phân tích đồng thời apigenin và luteolin trong nền mẫu thực vật phức tạp.
Câu hỏi thường gặp
1. Bộ thông số công nghệ tối ưu cho quá trình chiết xuất apigenin và luteolin trong khóa luận là gì?
Quá trình chiết xuất siêu âm hỗ trợ ở nhiệt độ phòng đạt hiệu suất cao nhất tại các giá trị thông số thực nghiệm: thời gian chiết xuất 57 phút, nồng độ $\beta$-cyclodextrin trong dung môi 25 mg/ml, và tỷ lệ dung môi/dược liệu 25 ml/g.
2. Hiệu suất chiết xuất bằng dung môi $\beta$-CD vượt trội hơn dung môi hữu cơ và nước như thế nào?
Ở cùng điều kiện tối ưu, dịch chiết $\beta$-CD cho hàm lượng apigenin cao gấp 3 lần so với chiết bằng nước cất, gấp 2 lần so với chiết bằng ethanol 70% và methanol. Hàm lượng luteolin thu được cao gấp 2 lần so với nước cất và gấp 1,5 lần so với ethanol 70% và methanol.
3. Vì sao dung dịch $\beta$-cyclodextrin trong nước lại làm tăng độ tan của apigenin và luteolin?
Apigenin và luteolin là các flavonoid tồn tại ở dạng aglycon (genin) có tính kỵ nước nên rất kém tan trong nước nguyên chất. Phân tử $\beta$-cyclodextrin có cấu trúc hình nón cụt với khoang bên trong kỵ nước có kích thước đường kính (6,0–6,6 Å) tương thích hoàn hảo để ôm trọn phân tử apigenin và luteolin tạo thành phức bao phân tử (tỷ lệ 1:1), trong khi bề mặt ngoài chứa các nhóm hydroxyl ưa nước giúp phức hợp này tan rất tốt trong môi trường nước.
4. Ưu điểm nổi bật của quy trình chiết xuất bằng $\beta$-CD so với hệ dung môi eutectic (DES) đã công bố trước đây là gì?
Mặc dù cho hàm lượng hoạt chất tương đương với hệ dung môi DES (betain:propylen glycol 1:8), quy trình sử dụng $\beta$-CD được thực hiện hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (không cần gia nhiệt) và dịch chiết có độ nhớt thấp, không gây cản trở quá trình thẩm thấu dung môi vào dược liệu, giúp tiết kiệm năng lượng và dễ dàng tinh chế sản phẩm hơn so với hệ DES có độ nhớt cao và áp suất hơi thấp.
5. Phương pháp định lượng apigenin và luteolin bằng HPLC được thiết lập với các thông số kỹ thuật nào?
Phương pháp HPLC sử dụng cột pha đảo Shim-pack GIS C18 ($250 \times 4,6\text{ mm}; 5\text{ }\mu\text{m}$), pha động đẳng dòng gồm Acetonitril và dung dịch acid phosphoric 0,1% (tỷ lệ thể tích 40:60), tốc độ dòng 0,5 ml/phút, thể tích tiêm 20 $\mu$l và phát hiện bằng đầu dò DAD ở bước sóng 335 nm.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Thị Thơm đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây (Apium graveolens L.) sử dụng dung môi xanh $\beta$-cyclodextrin trong nước kết hợp sóng siêu âm ở nhiệt độ phòng. Bằng phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken, đề tài đã xác định chính xác các điều kiện chiết xuất tối ưu (57 phút, nồng độ $\beta$-CD 25 mg/ml, tỷ lệ dung môi/dược liệu 25 ml/g), mang lại hàm lượng apigenin đạt 0,147 mg/g và luteolin đạt 0,781 mg/g với độ chính xác mô hình trên 99%. Kết quả nghiên cứu chứng minh tính ưu việt vượt trội của $\beta$-cyclodextrin so với các dung môi hữu cơ truyền thống về mặt hiệu suất chiết, tính an toàn sinh học và thân thiện với môi trường, tạo tiền đề vững chắc cho việc nghiên cứu triển khai sản xuất các chế phẩm hỗ trợ điều trị bệnh gút ở quy mô công nghiệp.