Luận văn thạc sĩ về glycoprotein gp5 của virus PRRS ở lợn

Nghiên cứu biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp glycoprotein gp5 của virus PRRSV, góp phần hiểu rõ hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn.

• Tác giả: Hà Đăng Chiến
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Văn Sơn
• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Và Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp Glycoprotein (Gp5) Của Virus Gây Hội Chứng Rối Loạn Hô Hấp Và Sinh Sản Ở Lợn (Prrsv)
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Lý do chọn đề tài
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Nội dung nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Tổng quan về PRRS
• 2.1.1. Khái niệm PRRS
• 2.1.2. Cơ chế gây bệnh và các phương pháp lan truyền
• 2.1.3. Các biện pháp phòng bệnh
• 2.1.4. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.1.4.1. Trên thế giới
• 2.1.4.2. Tại Việt Nam
• 2.2. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)
• 2.2.1. Đặc tính sinh học của virus
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Hóa chất và môi trường
• 3.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Tạo dòng gen gp5
• 3.3.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5
• 3.3.3. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5
• 4.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5
• 4.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E. coli
• 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu glycoprotein gp5 từ virus PRRS

Nghiên cứu glycoprotein gp5 từ virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) là một lĩnh vực quan trọng trong công nghệ sinh học. Virus PRRS gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn, đặc biệt là ở Việt Nam. Việc hiểu rõ về glycoprotein gp5 sẽ giúp phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn.

1.1. Khái niệm về virus PRRS và glycoprotein gp5

Virus PRRS là một loại virus RNA gây bệnh cho lợn, trong đó glycoprotein gp5 đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh. Glycoprotein gp5 là một kháng nguyên chính, có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu glycoprotein gp5

Nghiên cứu glycoprotein gp5 không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của virus PRRS mà còn hỗ trợ trong việc phát triển vaccine và các phương pháp điều trị hiệu quả.

II. Vấn đề và thách thức trong nghiên cứu glycoprotein gp5

Mặc dù nghiên cứu glycoprotein gp5 đã đạt được nhiều tiến bộ, nhưng vẫn còn nhiều thách thức cần vượt qua. Virus PRRS có khả năng biến đổi gen cao, làm cho việc phát triển vaccine trở nên khó khăn. Ngoài ra, việc tinh sạch glycoprotein gp5 cũng gặp nhiều khó khăn do tính chất của protein này.

2.1. Khó khăn trong việc phát triển vaccine

Sự biến đổi gen của virus PRRS khiến cho các vaccine hiện tại không còn hiệu quả. Cần nghiên cứu để phát triển vaccine mới có khả năng chống lại các chủng virus khác nhau.

2.2. Thách thức trong quá trình tinh sạch glycoprotein

Quá trình tinh sạch glycoprotein gp5 gặp khó khăn do protein này có tính chất không ổn định và dễ bị phân hủy. Cần áp dụng các phương pháp tinh sạch tiên tiến để đạt được hiệu quả cao.

III. Phương pháp nghiên cứu glycoprotein gp5 hiệu quả

Để nghiên cứu glycoprotein gp5, các phương pháp hiện đại như PCR, sắc ký ái lực và phân tích Western blot được sử dụng. Những phương pháp này giúp xác định và tinh sạch glycoprotein gp5 một cách hiệu quả.

3.1. Sử dụng PCR để xác định gen gp5

Phương pháp PCR giúp nhân bản gen gp5 từ virus PRRS, tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sâu hơn về protein này.

3.2. Sắc ký ái lực trong tinh sạch glycoprotein

Sắc ký ái lực là một phương pháp hiệu quả để tinh sạch glycoprotein gp5, giúp loại bỏ các tạp chất và thu được protein tinh khiết.

IV. Ứng dụng thực tiễn của glycoprotein gp5 trong chăn nuôi

Glycoprotein gp5 có nhiều ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh PRRS. Việc phát triển vaccine dựa trên glycoprotein gp5 có thể giúp giảm thiểu thiệt hại cho ngành chăn nuôi lợn.

4.1. Chẩn đoán bệnh PRRS bằng glycoprotein gp5

Glycoprotein gp5 có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh bệnh PRRS, giúp phát hiện sớm và quản lý dịch bệnh hiệu quả.

4.2. Vaccine dựa trên glycoprotein gp5

Vaccine tái tổ hợp dựa trên glycoprotein gp5 có thể cung cấp khả năng miễn dịch tốt hơn cho lợn, giúp ngăn chặn sự lây lan của virus PRRS.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu glycoprotein gp5

Nghiên cứu glycoprotein gp5 từ virus PRRS là một lĩnh vực đầy tiềm năng. Việc phát triển các phương pháp mới trong nghiên cứu và ứng dụng glycoprotein gp5 sẽ góp phần quan trọng trong việc kiểm soát bệnh PRRS trong tương lai.

5.1. Tương lai của vaccine PRRS

Vaccine dựa trên glycoprotein gp5 có thể trở thành giải pháp hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh PRRS, giúp bảo vệ đàn lợn và nâng cao năng suất chăn nuôi.

5.2. Nghiên cứu tiếp theo về glycoprotein gp5

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về glycoprotein gp5 để hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động và phát triển các ứng dụng mới trong chẩn đoán và điều trị bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), thường gọi là bệnh "tai xanh", là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất đối với ngành chăn nuôi toàn cầu. Thiệt hại kinh tế hàng năm tại Mỹ ước tính lên đến 560 triệu USD, trong khi tại Trung Quốc, đợt dịch năm 2007 đã buộc phải tiêu hủy trên 20 triệu con lợn. Tại Việt Nam, virus PRRS được ghi nhận từ năm 1997 với tỷ lệ huyết thanh dương tính tại khu vực phía Nam đạt khoảng 25% (596 trên 2.308 mẫu xét nghiệm) và bùng phát mạnh vào tháng 3 năm 2007 khiến hơn 31.750 con lợn mắc bệnh.

Virus PRRS thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có tính hướng tế bào đặc biệt cao đối với đại thực bào phế nang, phá hủy tới 40% tế bào miễn dịch thiết yếu này và gây suy giảm miễn dịch nghiêm trọng. Trong hệ gen của virus, glycoprotein 5 (GP5) mã hóa bởi khung đọc mở ORF5 là protein vỏ chủ chốt mang các epitope trung hòa quan trọng nhất. Tuy nhiên, việc nuôi cấy virus PRRS trên môi trường tế bào gặp nhiều rào cản kỹ thuật do tính đặc hiệu khắt khe và nguy cơ lây lan mầm bệnh sống.

Luận văn tập trung vào mục tiêu dòng hóa thành công gen mã hóa GP5, thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp và tối ưu hóa quy trình biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp GP5 trên hệ thống vi khuẩn Escherichia coli. Nghiên cứu được triển khai tại Phòng Công nghệ DNA ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học và Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, hoàn thành vào năm 2015. Kết quả đạt được cung cấp nguồn kháng nguyên tái tổ hợp chuẩn hóa với độ tinh sạch cao, làm tiền đề sản xuất sinh phẩm chẩn đoán nhanh và phát triển vaccine tái tổ hợp thế hệ mới, góp phần giảm thiểu chi phí dịch tễ cho ngành chăn nuôi lợn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng sinh học phân tử về cấu trúc hệ gen Arterivirus và công nghệ DNA tái tổ hợp. Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dương dài khoảng 15 kb, mã hóa cho các protein cấu trúc và phi cấu trúc. Khung lý thuyết tập trung vào ba khái niệm then chốt:

1. Kháng nguyên vỏ Glycoprotein 5 (GP5): Protein vỏ có khối lượng tự nhiên khoảng 25 kDa, chứa 3 vị trí N-glycosyl hóa (N34, N44, N51) và vùng trung hòa chính tại các acid amin từ 36 đến 52, đóng vai trò quyết định trong việc kích thích tạo kháng thể trung hòa và tương tác màng tế bào vật chủ.
2. Hệ thống biểu hiện pET: Mô hình plasmid biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter T7 cực mạnh, cho phép tổng hợp protein ngoại lai chiếm từ 10% đến 30% tổng protein tế bào. Vector pET-32a(+) tích hợp đoạn gen mã hóa Thioredoxin (Trx, 19,5 kDa) giúp tăng cường độ hòa tan, hạn chế hình thành thể vùi bất hoạt và gắn kèm đuôi 6xHis-tag hỗ trợ tinh sạch.
3. Sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC): Cơ chế tương tác đặc hiệu giữa các gốc histidine của phân tử tái tổ hợp với ion kim loại Ni2+ cố định trên giá thể Sepharose, giúp phân tách chọn lọc protein mục tiêu ra khỏi dịch chiết tế bào.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm sử dụng trình tự gen mã hóa GP5 kích thước 650 bp được thiết kế dựa trên mã số chuẩn HQ540655 từ Ngân hàng gen quốc tế, thực hiện dòng hóa trong vector pBT và biểu hiện trên vector pET-32a(+) với hai dòng vi khuẩn chủ Escherichia coli DH5α và BL21 (DE3).

Cỡ mẫu nghiên cứu bao gồm việc sàng lọc các khuẩn lạc đơn sau biến nạp trên môi trường thạch LB có bổ sung 100 mg/ml carbenicillin kết hợp hệ chỉ thị màu X-gal/IPTG. Phương pháp chọn mẫu là lấy ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng độc lập, tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật colony-PCR để xác nhận sự hiện diện của đoạn chèn mục tiêu trước khi nhân dòng và biểu hiện ở quy mô nuôi cấy 50 ml.

Phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật PCR chu trình nhiệt 30 chu kỳ với nhiệt độ gắn mồi 58°C trong 30 giây; phản ứng cắt mở vòng bằng hai enzyme cắt giới hạn SacI và HindIII ủ ở 37°C trong 5 giờ. Lý do lựa chọn enzyme SacI và HindIII là tạo đầu dính so le đặc hiệu, đảm bảo gen gp5 được ghép nối chính xác theo đúng khung đọc dịch mã sau promoter T7 và đoạn dung hợp Trx/His-tag. Sản phẩm protein sau cảm ứng được phân tích qua điện di gel polyacrylamide SDS-PAGE 12,5% ở dòng điện 20 - 22 mA và thẩm tách miễn dịch Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag pha loãng 1:1.000 lần. Toàn bộ lộ trình thực nghiệm diễn ra liên tục từ năm 2014 đến 2015.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình triển khai thực nghiệm đã ghi nhận bốn kết quả then chốt với độ tin cậy và độ lặp lại cao:

1. Dòng hóa và tạo dòng vector tái tổ hợp chính xác: Phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt đã nhân bản thành công đoạn gen gp5 kích thước 650 bp (0,65 kb). Điện di kiểm tra khuẩn lạc colony-PCR trên 100% mẫu khuẩn lạc trắng được chọn đều xuất hiện băng DNA đặc hiệu 650 bp. Sau khi chuyển vào vector biểu hiện pET-32a(+), phản ứng cắt kiểm tra bằng enzyme SacI và HindIII giải phóng chính xác hai phân đoạn: khung vector pET-32a(+) mạch thẳng kích thước khoảng 6 kb và đoạn chèn gp5 kích thước 0,65 kb.
2. Biểu hiện vượt trội protein dung hợp Trx-GP5: Trong điều kiện cảm ứng bằng chất cảm ứng IPTG nồng độ 0,1 mM tại 30°C trong 5 giờ ở mật độ quang OD600 đạt 0,6, chủng E. coli BL21 (DE3) mang vector tái tổ hợp đã biểu hiện mạnh mẽ protein dung hợp có khối lượng phân tử khoảng 43 kDa. Khối lượng này hoàn toàn khớp với tính toán lý thuyết khi kết hợp đoạn Trx (19,5 kDa) với protein GP5 (24 - 25 kDa).
3. Xác nhận tính đặc hiệu bằng Western blot: Phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag pha loãng 1:1.000 lần đã ghi nhận một vạch tín hiệu duy nhất, đậm nét tại vị trí 43 kDa trong dịch chiết tế bào vi khuẩn cảm ứng, trong khi mẫu đối chứng âm không xuất hiện tín hiệu.
4. Tinh sạch đạt độ đồng nhất cao qua cột Ni-NTA: Khảo sát dải nồng độ Imidazole từ 20 mM đến 100 mM (gồm các mức 20, 40, 60, 80 và 100 mM) xác định tại nồng độ 100 mM Imidazole, lượng protein tái tổ hợp thu được đạt mật độ cao nhất, loại bỏ trên 90% các protein tạp của tế bào chủ.

Thảo luận kết quả

Các dữ liệu thực nghiệm được minh chứng rõ ràng thông qua hệ thống hình ảnh điện di gel agarose 1% và điện di protein SDS-PAGE 12,5%, cho phép so sánh định lượng độ đậm của băng protein mục tiêu với thang chuẩn khối lượng phân tử protein của hãng Thermo Scientific. Kết quả khảo sát nồng độ Imidazole có thể được biểu diễn dưới dạng biểu đồ cột thể hiện sự tăng dần về hàm lượng và độ sạch của protein GP5 thu nhận theo nồng độ chất rửa giải từ 20 mM đến 100 mM, chứng minh hiệu quả phân tách chọn lọc của chất mang Ni-NTA.

Việc dung hợp với Thioredoxin đóng vai trò quyết định giúp protein GP5 giữ được cấu trúc hòa tan trong pha lỏng của tế bào sau khi siêu âm phá mẫu, hạn chế tối đa hiện tượng tạo thể vùi bất hoạt vốn là trở ngại lớn khi biểu hiện protein màng kỵ nước trên vi khuẩn. Kích thước phân tử 43 kDa của protein dung hợp Trx-GP5 hoàn toàn tương thích với các công bố quốc tế về biểu hiện protein vỏ PRRSV trên hệ thống vector pET. Kết quả này chứng minh quy trình công nghệ tái tổ hợp hoàn toàn khả thi, cung cấp nguồn kháng nguyên sạch vượt trội so với phương pháp phân lập từ nuôi cấy virus sống trên đại thực bào phổi lợn vốn có năng suất thấp và rủi ro an toàn sinh học cao.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm hoàn thiện và nâng cao khả năng ứng dụng thực tiễn của quy trình công nghệ, các giải pháp cụ thể được đề xuất như sau:

1. Mở rộng quy mô lên men bán công nghiệp: Chuyển đổi quy trình nuôi cấy từ bình tam giác phòng thí nghiệm 50 ml sang hệ thống bioreactor tự động dung tích 5 đến 10 lít. Kiểm soát liên tục độ pH ở mức 7,0 và độ bão hòa oxy hòa tan để nâng cao mật độ tế bào vi khuẩn và tăng hiệu suất thu nhận protein tái tổ hợp thêm khoảng 40% trong vòng 6 tháng, do nhóm nghiên cứu công nghệ vi sinh đảm nhiệm.
2. Tối ưu hóa phản ứng cắt tách phân đoạn Thioredoxin: Ứng dụng enzyme Enterokinase chuyên biệt để cắt liên kết giữa phân đoạn Trx và GP5 tại vị trí nhận biết đặc hiệu trên cấu trúc pET-32a(+), thu nhận protein GP5 tự nhiên kích thước 25 kDa với độ tinh sạch trên 95%, hoàn thành trong thời gian 3 tháng dưới sự thực hiện của các chuyên gia tinh sạch protein.
3. Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán ELISA: Ứng dụng protein GP5 tái tổ hợp tinh sạch làm kháng nguyên phủ bề mặt đĩa phản ứng để chế tạo bộ kit ELISA phát hiện kháng thể kháng virus PRRS, hướng tới mục tiêu đạt độ nhạy trên 98% và độ đặc hiệu trên 95% khi kiểm tra trên 500 mẫu huyết thanh thực địa trong lộ trình 12 tháng do Viện Thú y chủ trì.
4. Thử nghiệm khả năng sinh miễn dịch trên động vật: Tiến hành đánh giá hiệu lực tạo kháng thể trung hòa của protein GP5 kết hợp chất trợ nhiễm trên mô hình chuột thí nghiệm và đàn lợn thực nghiệm, làm tiền đề cho việc sản xuất vaccine tái tổ hợp thế hệ mới trong giai đoạn 18 đến 24 tháng dưới sự phối hợp giữa Cục Thú y và các đơn vị sản xuất dược phẩm sinh học thú y.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn sâu rộng cho bốn nhóm đối tượng:

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học phân tử: Nắm bắt chi tiết quy trình thiết kế vector biểu hiện pET-32a(+), kỹ thuật tạo đầu dính bằng enzyme SacI/HindIII và phương pháp biểu hiện protein dung hợp kích thước 43 kDa trong E. coli BL21 (DE3).
2. Chuyên gia phát triển sinh phẩm và kit chẩn đoán thú y: Tiếp cận thông số kỹ thuật chuẩn hóa về tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực Ni-NTA ở nồng độ 100 mM Imidazole và quy trình thẩm tách Western blot pha loãng 1:1.000 để làm kháng nguyên chuẩn trong các test chẩn đoán.
3. Doanh nghiệp sản xuất vaccine và dược phẩm sinh học: Ứng dụng giải pháp sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp an toàn sinh học thay thế cho phương pháp nuôi cấy virus sống phức tạp, giúp cắt giảm từ 30% đến 50% chi phí sản xuất và loại trừ hoàn toàn nguy cơ phát tán virus ra môi trường.
4. Học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Thú y, Công nghệ sinh học: Khai thác tài liệu làm nguồn tham khảo phương pháp luận thực nghiệm, cách bố trí phản ứng PCR, kỹ thuật điện di SDS-PAGE và kỹ năng biện luận kết quả sinh học phân tử chuẩn mực.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao nghiên cứu lại chọn protein GP5 của virus PRRS làm đối tượng biểu hiện tái tổ hợp?
Protein GP5 có kích thước khoảng 25 kDa, là glycoprotein phong phú nhất trên bề mặt vỏ virus PRRS và chứa các epitope trung hòa chủ chốt tại vị trí acid amin từ 36 đến 52. Đây là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ tạo ra kháng thể trung hòa virus.

Vai trò của đoạn dung hợp Thioredoxin trong vector biểu hiện pET-32a(+) là gì?
Thioredoxin là một protein có khối lượng 19,5 kDa, chiếm khoảng 40% tổng protein tế bào vi khuẩn. Khi dung hợp với GP5, Trx đóng vai trò hỗ trợ cuộn gập cấu trúc, gia tăng đáng kể độ hòa tan của protein ngoại lai, ngăn ngừa sự hình thành thể vùi kỵ nước và nâng cao hiệu suất biểu hiện lên mức khối lượng 43 kDa.

Nồng độ Imidazole nào đạt hiệu quả tối ưu trong quá trình tinh sạch qua cột sắc ký ái lực Ni-NTA?
Nồng độ 100 mM Imidazole cho kết quả tối ưu nhất trong dải khảo sát từ 20 mM đến 100 mM. Tại nồng độ này, Imidazole cạnh tranh hiệu quả với chuỗi 6xHis-tag để giải phóng toàn bộ protein tái tổ hợp Trx-GP5 với độ tinh sạch cao nhất, đồng thời tiết kiệm hóa chất và thuận tiện cho quá trình loại muối bằng thẩm tách.

Làm thế nào để xác nhận tính chính xác và đặc hiệu của protein tái tổ hợp thu được?
Nghiên cứu sử dụng kết hợp hai phương pháp: điện di SDS-PAGE 12,5% để xác định kích thước dải phân tử 43 kDa trùng khớp với lý thuyết, và kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blot với kháng thể kháng His-tag ở độ pha loãng 1:1.000 để khẳng định protein được dịch mã chính xác theo đúng khung đọc thiết kế.

Kháng nguyên GP5 tái tổ hợp có thể thay thế virus PRRS tự nhiên trong chẩn đoán và sản xuất vaccine không?
Kháng nguyên GP5 tái tổ hợp hoàn toàn có khả năng thay thế virus tự nhiên do vẫn bảo tồn nguyên vẹn cấu trúc không gian của các epitope trung hòa. Giải pháp này khắc phục triệt để khó khăn khi nuôi cấy virus PRRS trên đại thực bào phổi lợn, đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối và tối ưu hóa chi phí sản xuất.

Kết luận

• Tách dòng thành công đoạn gen gp5 kích thước 650 bp từ cơ sở dữ liệu quốc tế HQ540655 vào vector tách dòng pBT.
• Thiết kế hoàn chỉnh vector biểu hiện tái tổ hợp pET-32a(+)/gp5 dưới sự kiểm soát của promoter T7 đặc hiệu.
• Biểu hiện thành công protein dung hợp Trx-GP5 khối lượng 43 kDa trong chủng vi khuẩn Escherichia coli BL21 (DE3) dưới cảm ứng 0,1 mM IPTG ở 30°C trong 5 giờ.
• Khẳng định tính đặc hiệu tuyệt đối của protein tái tổ hợp thông qua phản ứng lai Western blot với kháng thể kháng His-tag.
• Tinh sạch thành công protein tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực Ni-NTA với nồng độ rửa giải tối ưu 100 mM Imidazole, đạt độ tinh khiết cao.

Luận văn đã đóng góp một quy trình công nghệ hoàn chỉnh và có tính tái lập cao trong việc sản xuất kháng nguyên GP5 tái tổ hợp, mở ra hướng đi bền vững cho công tác phòng chống dịch tai xanh. Trong lộ trình từ 12 đến 24 tháng tới, các cơ quan nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm cần đẩy mạnh thử nghiệm lâm sàng và mở rộng quy mô lên men. Quý đối tác và các nhà khoa học quan tâm vui lòng kết nối để trao đổi chuyên môn và hợp tác chuyển giao công nghệ ứng dụng vào thực tiễn chăn nuôi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu cho quá trình miễn dịch không xảy ra đƣợc, cơ thể lợn rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đƣờng hô hấp nhƣ Mycoplasma hyopneumoniae, P. Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] khi xác định một số vi khuẩn kế phát gây chết lợn trong vùng dịch PRRS ở huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên năm 2010 đã cho thấy lợn mắc PRRS thƣờng kế phát bệnh do các nhóm vi khuẩn đƣờng hô hấp và đƣờng ruột nhƣ A. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail], Escherichia coli, Salmonella sp, Clostridium perfringens. Kết quả phân lập đƣợc vi khuẩn A.

pleuropneumoniae với tỷ lệ cao nhất 63.33% và thấp nhất là P. Các tác giả nhận định các nhóm vi khuẩn kế phát trên đã làm cho dịch PRRS trầm trọng và phức tạp hơn. * Các biện pháp phòng bệnh Hiện nay chƣa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc phòng bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện đang là hai biện pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động phòng chống dịch, cần thực hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng, chống dịch nhƣ: Phát hiện sớm, bao vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành, các cấp và ngƣời dân tham gia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính quyền các cấp từ Trung ƣơng tới các địa phƣơng.

Trƣờng hợp có tỷ lệ lợn trong đàn kiểm tra huyết thanh dƣơng tính cao thì tiêu hủy là phƣơng pháp hiệu quả. Tuy nhiên, phƣơng pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống thuần. Điều này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con lợn mang trùng mà chƣa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách. Các biện pháp quản lý không đƣợc kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn sẽ tồn tại [35].

* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam + Trên thế giới Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nƣớc và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai xanh lƣu hành. Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phƣơng ở nhiều nƣớc trên thế giới, kể cả các nƣớc có ngành chăn nuôi lợn phát triển nhƣ Mỹ, Hà Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 6 Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức. và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế cho ngƣời chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27]. Nhƣ hàng năm Mỹ phải chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD.

Các nƣớc trong khu vực có tỷ lệ bệnh Tai xanh lƣu hành rất cao. Ở Trung Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% - 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là 97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5]. Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của Trung Quốc đã đƣợc phát hành vào tháng 12/2007, kể từ năm 2006, đàn lợn của Trung Quốc đã bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi "Hội chứng sốt cao ở lợn" do nhiều nguyên nhân, trong đó chủ yểu là virus PRRS và các loại mầm bệnh này đã làm hàng triệu lợn bị ốm, chết và phải tiêu hủy.

Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã khẳng định chủng virusPRRS gây bệnh tại nƣớc này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 acid amin trong gen). Năm 2007, các tỉnh Anhui, Hunan, Guangdong, Shandong, Liaoning, Jilin và một số tỉnh khác bị ảnh hƣởng nặng buộc Trung Quốc phải tiêu hủy tới 20 triệu lợn để ngăn chặn dịch lây lan. Trƣớc diễn biến phức tạp của dịch Tai xanh, Bộ Nông Nghiệp Trung Quốc đang thực hiện chƣơng trình phòng chống bệnh rất quy mô, riêng chƣơng trình nghiên cứu, sản xuất vaccine đã đƣợc cam kết chi khoảng 280 triệu Nhân dân tệ tƣơng đƣơng với 36,5 triệu USD [25]. Tại Hồng Kông và Đài Loan đã xác định có cả hai chủng Châu Âu và Bắc Mỹ cùng lƣu hành, đặc biệt trong cùng một con lơn ở Hồng Kông đã xác định nhiễm cả hai chủng nêu trên; dịch Tai xanh cũng đƣợc thông báo ở Thái Lan từ các năm 2000 - 2007.

Thông báo cho biết các virus gây bệnh Tai xanh đƣợc phân lập từ nhiều địa phƣơng thuộc nƣớc này gồm cả chủng dòng châu Âu và chủng dòng Bắc Mỹ. Trong đó, số virus thuộc chủng dòng châu Âu chiếm 66,42%, còn các virus thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phần lớn ở những quốc gia này hiện còn đang lƣu hành virus gây bệnh Tai xanh chủng châu Âu hoặc Bắc Mỹ, là những chủng virus cổ điển độc lực thấp [13]. Tháng 9/2007, Nga là nƣớc thứ 3 đã báo cáo chính thức có dịch bệnh Tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây [16].

+ Tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanh dƣơng tính với PRRS và cả đàn đƣợc tiêu hủy ngay [6]. Tuy nhiên, theo điều tra ở một số địa bàn thuộc thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33%) có lƣu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm 2003, tỷ lệ huyết thanh dƣơng tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung ở Cần Thơ là 66,86%. Nhƣ vậy, PRRS đã đƣợc phát hiện ở Việt Nam từ năm 1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trƣớc tháng 3 năm 2007 chƣa phát hiện các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn.

Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở các nƣớc láng giềng. Theo thông báo của các tổ chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nƣớc trong khu vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chƣa có những nghiên cứu cụ thể về tốc độ lây lan của virus, nhƣng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần thứ nhất (tháng 3, 4 năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dƣơng có dịch thì sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hƣng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng.

Số lợn mắc bệnh 31.750 con, số lợn chết và xử lý 7. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV) Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy các chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tƣơng đồng về amino acid từ 99% đến 99,7% so với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều bị mất 30 axít amin. Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nƣớc ta hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực cao giống chủng ở Trung Quốc [16].

Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nƣớc từ năm 2009 đến nay đã nhận định PRRSV tại Việt Nam hiện nay đƣợc xác định thuộc chủng Bắc Mỹ dòng Trung Quốc [3], [8], [10], [14].  Đặc tính sinh học của virus Virus gây PRRS rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi. Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%). Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng.

Do vậy lợn mắc PRRS thƣờng dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát. Virus không gây ngƣng kết với các loại hồng cầu gà, dê, thỏ, chuột, hồng cầu type O của ngƣời. Virus phát triển tốt trên môi trƣờng tế bào đại thực bào phế nang lợn, trên tế bào dòng CL 2621, tế bào MA 140 với bệnh tích phá huỷ tế bào, sau 2- 6 ngày tế bào co tròn, tập trung thành cụm dày lên, nhân co lại cuối cùng bong ra [17]. Tuy có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhƣng các chủng virus Bắc Mỹ và các chủng virus Châu Âu lại cùng gây ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau.

Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thƣơng đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, ngƣời ta chia ra hai nhóm virus là nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp. Nhóm virus có độc lực cao thƣờng gây ra các tổn thƣơng ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp. Năm 2007, Kegong Tian và Yu khi nghiên cứu về sự biến đổi về độc lực của PRRSV tại Trung Quốc cho Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] 9 rằng virus đã có sự biến đổi về độc lực và hậu quả lợn nhiễm virus này có tỷ lệ chết cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh [34].  Sức đề kháng và khả năng gây bệnh của virus + Sức đề kháng của virus.

Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ -20 đến -70 o C; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở 37oC chịu đƣợc 48 giờ, 56oC bị chết sau một giờ, virus thích hợp ở pH 5 -7. Với các chất sát trùng thông thƣờng và môi trƣờng có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Dƣới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [10], [12]. + Khả năng gây bệnh của virus Ngƣời và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm.

Virus có thể nhân lên ở loài động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng nên rất khó khống chế [18].