Luận văn nghiên cứu biểu hiện lysin của bacteriophage chủng k đặc hiệu staphylococcus aureus ở escherichia coli

Nghiên cứu biểu hiện lysin của bacteriophage chủng k đặc hiệu Staphylococcus aureus ở Escherichia coli, mở ra hướng đi mới trong điều trị nhiễm khuẩn.

• Tác giả: Vũ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Của Bacteriophage Chủng K Đặc Trưng Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài
• 2.2. Tình trạng kháng kháng sinh
• 2.2.1. Tình hình kháng kháng sinh trên thế giới
• 2.2.2. Tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam
• 2.3. Các phương pháp điều trị bệnh do vi khuẩn
• 2.4. Tổng quan về thực khuẩn thể (bacteriophage)
• 2.5. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện
• 2.5.1. Vector biểu hiện
• 2.5.2. Hệ thống biểu hiện E.
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.3. Trang thiết bị
• 3.4. Môi trường và dung dịch làm việc
• 3.5. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
• 3.7.2. Phương pháp điện di trên gel Agarose
• 3.7.3. Thu nhận DNA từ gel agarose (thôi gel)
• 3.7.4. Gắn đoạn gen mã hóa lysin vào vector biểu hiện
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
• 3.7.8. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.
• 3.7.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
• 3.7.10. Phương pháp biểu hiện- xác định trạng thái tồn tại của lysin
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thiết kế vector biểu hiện
• 4.2. Kết quả thiết kế vector pET32(a+) mang gen lysK
• 4.3. Chọn lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 4.4. Kiểm tra chiều gắn khung đọc của đoạn chèn trong vector pET32a(+)
• 4.5. Biểu hiện gene mã hóa lysin trong vi khuẩn
• 4.6. Biểu hiện lysin phage trong vi khuẩn E.
• 4.7. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Phage K Giới Thiệu

Nghiên cứu biểu hiện lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong Escherichia coli mở ra hướng đi mới trong cuộc chiến chống lại tình trạng kháng kháng sinh. Sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là S. aureus, đòi hỏi các giải pháp thay thế hiệu quả. Lysin, enzyme phân giải peptidoglycan của vi khuẩn, hứa hẹn là một vũ khí tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện gen lysin của phage K trong E. coli, một hệ thống biểu hiện được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử. Mục tiêu là tạo ra protein lysin tái tổ hợp, có khả năng tiêu diệt S. aureus một cách đặc hiệu. Thành công của nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các liệu pháp điều trị nhiễm trùng mới, giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh truyền thống. Dẫn chứng từ tài liệu gốc cho thấy sự cấp thiết của việc tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh do tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Lysin Phage K

Tình trạng kháng kháng sinh đang trở thành mối đe dọa toàn cầu, đặc biệt là đối với các vi khuẩn như Staphylococcus aureus. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị thay thế, như sử dụng protein lysin từ bacteriophage, là vô cùng quan trọng. Lysin có khả năng phá vỡ cấu trúc tế bào vi khuẩn một cách đặc hiệu, mở ra tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do S. aureus gây ra. Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện lysin của phage K, một chủng bacteriophage đặc hiệu cho S. aureus, nhằm tạo ra một công cụ hiệu quả để chống lại vi khuẩn này.

1.2. Mục Tiêu Và Phạm Vi Của Đề Tài Nghiên Cứu

Đề tài tập trung vào việc biểu hiện lysin tái tổ hợp của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong vi khuẩn E. coli BL21 starTM (DE3). Các mục tiêu cụ thể bao gồm thiết kế vector biểu hiện mang gen lysin, biểu hiện thành công gen lysin trong E. coli, và tối ưu hóa một số điều kiện biểu hiện lysin phage. Phạm vi nghiên cứu giới hạn trong việc biểu hiện gen và đánh giá sơ bộ hoạt tính của protein lysin tái tổ hợp. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng của lysin trong điều trị nhiễm trùng S. aureus.

II. Thách Thức Kháng Kháng Sinh Giải Pháp Lysin Phage K

Tình trạng kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus đang gây ra những thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng. Các chủng MRSA (Methicillin-resistant S. aureus) ngày càng phổ biến, khiến việc điều trị trở nên khó khăn và tốn kém. Lysin phage, với cơ chế tác động khác biệt so với kháng sinh, có thể là một giải pháp tiềm năng. Cơ chế ly giải của lysin dựa trên việc phá vỡ cấu trúc peptidoglycan của tế bào vi khuẩn, một mục tiêu mà vi khuẩn khó có thể phát triển cơ chế kháng lại. Nghiên cứu này nhằm mục đích khai thác tiềm năng của lysin từ bacteriophage chủng K để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh của S. aureus. Việc biểu hiện lysin trong E. coli là một bước quan trọng để sản xuất protein lysin với số lượng lớn, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính và ứng dụng.

2.1. Thực Trạng Kháng Kháng Sinh Của Staphylococcus Aureus

Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất, gây ra nhiều loại nhiễm trùng từ nhẹ đến nghiêm trọng. Tuy nhiên, sự gia tăng của các chủng kháng kháng sinh, đặc biệt là MRSA, đang làm giảm hiệu quả của các phương pháp điều trị truyền thống. Theo báo cáo của WHO, khả năng kháng thuốc kháng sinh không còn là dự đoán cho tương lai, nó đang xảy ra, trên khắp thế giới, gây ra nhiều rủi ro trong khả năng điều trị những bệnh nhiễm trùng phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện. Điều này đòi hỏi sự tìm kiếm các giải pháp thay thế, trong đó lysin phage nổi lên như một ứng cử viên đầy hứa hẹn.

2.2. Ưu Điểm Của Lysin Phage So Với Kháng Sinh

Lysin phage có một số ưu điểm so với kháng sinh truyền thống. Thứ nhất, lysin có cơ chế tác động đặc hiệu, chỉ tấn công vào peptidoglycan của vi khuẩn mục tiêu, giảm thiểu tác động đến hệ vi sinh vật có lợi. Thứ hai, vi khuẩn khó có thể phát triển cơ chế kháng lại lysin do mục tiêu tác động là cấu trúc peptidoglycan, một thành phần thiết yếu của tế bào vi khuẩn. Thứ ba, lysin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn nhanh chóng, ngay cả khi vi khuẩn đang ở trạng thái không hoạt động. Những ưu điểm này khiến lysin phage trở thành một lựa chọn hấp dẫn để thay thế hoặc bổ sung cho kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng.

III. Phương Pháp Biểu Hiện Lysin Phage K Quy Trình Chi Tiết

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp sinh học phân tử để biểu hiện gen lysin của bacteriophage chủng K trong Escherichia coli. Quy trình bao gồm các bước chính: thiết kế vector biểu hiện, gắn gen lysin vào vector, biến nạp vector vào E. coli, và cảm ứng biểu hiện protein lysin. Vector biểu hiện được sử dụng là pET32a(+), một vector phổ biến cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với số lượng lớn. E. coli BL21 starTM (DE3) được sử dụng làm vật chủ biểu hiện do khả năng biểu hiện protein cao và dễ dàng kiểm soát. Quá trình biểu hiện được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ IPTG (chất cảm ứng), và thời gian biểu hiện. Kết quả biểu hiện được đánh giá bằng phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide.

3.1. Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen Lysin Phage K

Việc thiết kế vector biểu hiện là bước quan trọng để đảm bảo biểu hiện thành công gen lysin. Vector pET32a(+) được lựa chọn vì có hệ thống kiểm soát biểu hiện mạnh mẽ và khả năng tạo ra protein tái tổ hợp với thẻ His, giúp dễ dàng tinh sạch. Gen lysin được khuếch đại bằng PCR từ DNA của bacteriophage chủng K, sau đó được cắt bằng enzyme giới hạn và gắn vào vector pET32a(+). Quá trình này tạo ra vector tái tổ hợp mang gen lysin, sẵn sàng cho bước biến nạp vào E. coli.

3.2. Biểu Hiện Protein Lysin Trong Escherichia Coli

Sau khi vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, quá trình biểu hiện protein lysin được kích hoạt bằng cách thêm IPTG vào môi trường nuôi cấy. IPTG gắn vào protein ức chế, giải phóng gen lysin khỏi sự kiểm soát và cho phép RNA polymerase phiên mã gen. E. coli sau đó dịch mã mRNA thành protein lysin. Các điều kiện biểu hiện, như nhiệt độ và nồng độ IPTG, được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả biểu hiện cao nhất. Protein lysin được thu nhận từ tế bào E. coli và tinh sạch bằng sắc ký ái lực niken.

3.3. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Biểu Hiện Lysin Phage

Để tối đa hóa lượng protein lysin được biểu hiện, các điều kiện biểu hiện cần được tối ưu hóa. Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ IPTG, và thời gian biểu hiện được điều chỉnh và đánh giá ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện. Nhiệt độ thấp hơn thường giúp giảm tốc độ biểu hiện, cho phép protein lysin gấp nếp đúng cách và tăng tính ổn định. Nồng độ IPTG tối ưu cần được xác định để cân bằng giữa hiệu quả biểu hiện và độc tính của IPTG đối với tế bào E. coli. Thời gian biểu hiện cũng cần được điều chỉnh để đạt được lượng protein lysin cao nhất mà không gây ảnh hưởng đến sự sống của tế bào.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Biểu Hiện Thành Công Lysin Phage K

Nghiên cứu đã biểu hiện thành công protein lysin của bacteriophage chủng K trong Escherichia coli. Kết quả điện di protein cho thấy sự xuất hiện của một băng protein có kích thước phù hợp với protein lysin tái tổ hợp. Protein lysin được tinh sạch bằng sắc ký ái lực niken và được xác định bằng phương pháp Western blot. Hoạt tính kháng khuẩn của protein lysin được đánh giá bằng cách thử nghiệm khả năng tiêu diệt Staphylococcus aureus trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy protein lysin có khả năng tiêu diệt S. aureus một cách hiệu quả, chứng minh tiềm năng của nó trong việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra.

4.1. Xác Nhận Biểu Hiện Protein Lysin Bằng Điện Di

Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) là phương pháp được sử dụng để xác nhận sự biểu hiện của protein lysin. Mẫu protein từ tế bào E. coli sau khi cảm ứng biểu hiện được điện di và so sánh với mẫu đối chứng (tế bào E. coli không cảm ứng). Sự xuất hiện của một băng protein mới trong mẫu cảm ứng, có kích thước phù hợp với protein lysin tái tổ hợp, là bằng chứng cho thấy protein lysin đã được biểu hiện thành công.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Protein Lysin

Hoạt tính kháng khuẩn của protein lysin được đánh giá bằng cách thử nghiệm khả năng tiêu diệt Staphylococcus aureus trong ống nghiệm. Protein lysin được ủ với S. aureus trong một khoảng thời gian nhất định, sau đó số lượng tế bào S. aureus sống sót được đếm. Nếu protein lysin có hoạt tính kháng khuẩn, số lượng tế bào S. aureus sống sót sẽ giảm đáng kể so với mẫu đối chứng (không có protein lysin). Kết quả này chứng minh rằng protein lysin có khả năng tiêu diệt S. aureus và có tiềm năng trong việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra.

V. Ứng Dụng Lysin Phage K Hướng Đi Mới Điều Trị Nhiễm Trùng

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng lysin phage để điều trị nhiễm trùng do Staphylococcus aureus. Lysin có thể được sử dụng như một loại thuốc kháng khuẩn mới, thay thế hoặc bổ sung cho kháng sinh truyền thống. Ngoài ra, lysin cũng có thể được sử dụng trong các sản phẩm khử trùng, giúp ngăn ngừa sự lây lan của S. aureus trong bệnh viện và cộng đồng. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá tính an toàn và hiệu quả của lysin trên mô hình động vật, cũng như phát triển các phương pháp sản xuất lysin với quy mô lớn.

5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Lysin Trong Y Học

Lysin có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh. Lysin có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu và hiệu quả. Ngoài ra, lysin cũng có thể được sử dụng trong các liệu pháp kết hợp, tăng cường hiệu quả của kháng sinh truyền thống và giảm nguy cơ phát triển kháng thuốc.

5.2. Ứng Dụng Lysin Trong Ngành Công Nghiệp Thực Phẩm

Lysin cũng có tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, giúp kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm. Lysin có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt thực phẩm, ngăn ngừa sự lây lan của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Ngoài ra, lysin cũng có thể được sử dụng trong các sản phẩm bảo quản thực phẩm tự nhiên, thay thế cho các chất bảo quản hóa học.

VI. Kết Luận Triển Vọng Nghiên Cứu Lysin Phage K Tương Lai

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của lysin từ bacteriophage chủng K trong việc chống lại Staphylococcus aureus. Việc biểu hiện thành công protein lysin trong E. coli là một bước quan trọng để phát triển các liệu pháp điều trị nhiễm trùng mới. Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình biểu hiện, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của lysin trên mô hình động vật, và phát triển các phương pháp sản xuất lysin với quy mô lớn. Ứng dụng lysin hứa hẹn sẽ mang lại những đột phá trong điều trị nhiễm trùng và kiểm soát sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Lysin Phage K

Các hướng nghiên cứu tiếp theo về lysin phage K bao gồm: tối ưu hóa quá trình biểu hiện để tăng sản lượng protein lysin, cải thiện tính ổn định và hoạt tính của lysin, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của lysin trên mô hình động vật, và phát triển các phương pháp sản xuất lysin với quy mô lớn. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của lysin và khả năng phát triển kháng thuốc của vi khuẩn.

6.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Lysin Trong Tương Lai

Nghiên cứu về lysin có tầm quan trọng đặc biệt trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Lysin có thể là một giải pháp tiềm năng để thay thế hoặc bổ sung cho kháng sinh truyền thống, giúp điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc. Việc phát triển các liệu pháp dựa trên lysin sẽ góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm gánh nặng kinh tế do nhiễm trùng gây ra.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh hiện là thách thức nghiêm trọng đối với y tế toàn cầu và chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Báo cáo giám sát toàn cầu năm 2014 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ghi nhận hiện tượng vi khuẩn đề kháng kháng sinh xuất hiện trên diện rộng, làm suy giảm nghiêm trọng hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm trùng phổ biến trong bệnh viện lẫn ngoài cộng đồng. Trong số các tác nhân gây bệnh, tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) là cầu khuẩn Gram dương gây ra nhiều bệnh lý nguy hiểm như viêm da, nhiễm trùng huyết, viêm phổi, viêm ruột cấp và ngộ độc thực phẩm với tỷ lệ tử vong cao.

Khả năng kháng thuốc của S. aureus diễn ra nhanh chóng: vi khuẩn bắt đầu kháng penicillin từ năm 1944 thông qua việc tiết enzyme $\beta$-lactamase, và tỷ lệ kháng thuốc gia tăng liên tục từ 2% năm 1972 lên 63% năm 2004 tại Hoa Kỳ. Hiện nay, hơn 95% chủng tụ cầu vàng đã kháng penicillin, đồng thời xuất hiện phổ biến các chủng S. aureus kháng methicillin (MRSA) và kháng vancomycin (VRSA). Trước nguy cơ này, việc tìm kiếm các liệu pháp kháng khuẩn mới có cơ chế tác động đặc hiệu và khó bị vi khuẩn đề kháng là hướng nghiên cứu cấp thiết.

Một trong những hướng tiếp cận tiềm năng là sử dụng lysin (endolysin hoặc murein hydrolase) có nguồn gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage). Lysin là enzyme thủy phân liên kết peptidoglycan ở thành tế bào vi khuẩn Gram dương trong giai đoạn cuối của chu kỳ sinh tan (lytic). Khi tác dụng ngoại sinh dưới dạng protein tái tổ hợp, lysin có khả năng phá hủy vách tế bào và ly giải vi khuẩn mục tiêu một cách nhanh chóng, có tính đặc hiệu cao, không làm xáo trộn hệ vi sinh vật có lợi và chưa ghi nhận hiện tượng vi khuẩn hình thành tính kháng thuốc.

Khóa luận "Nghiên cứu biểu hiện Lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus ở Escherichia coli" do sinh viên Vũ Thị Trang thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu sau:

1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa lysin của thực khuẩn thể đặc hiệu vi khuẩn Staphylococcus aureus.
2. Biểu hiện thành công gen mã hóa lysin trong vi khuẩn Escherichia coli chủng BL21 Star™ (DE3).
3. Tối ưu hóa một số điều kiện biểu hiện lysin phage trong hệ thống E. coli.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Đoạn gen lysK mã hóa enzyme lysin của thực khuẩn thể chủng K đặc hiệu S. aureus, ban đầu được dòng hóa trong vector pCR2.1.
• Phạm vi không gian: Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Khóa luận được tiến hành từ tháng 12 năm 2015 đến tháng 05 năm 2016.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận xây dựng trên nền tảng lý thuyết về sinh học phân tử của thực khuẩn thể, cấu trúc peptidoglycan của vi khuẩn Gram dương và công nghệ DNA tái tổ hợp. Về phân loại thực khuẩn thể, tác giả tổng hợp hệ thống phân loại của Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) và phân loại theo Ackermann (2009) dựa trên cấu trúc hình thái virion và loại axit nucleic:

Họ thực khuẩn thể	Bản chất hệ gen	Đặc điểm hình thái
Myoviridae	DNA chuỗi kép thẳng	Đầu hình đa diện đều (110 $\times$ 80 nm), đuôi co rút được, có đĩa gốc và gai
Siphoviridae	DNA chuỗi kép thẳng	Đầu đường kính 60 nm, đuôi dài không co rút được (dài đến 570 nm)
Podoviridae	DNA chuỗi kép thẳng	Đầu đường kính 60 nm, đuôi ngắn (17 $\times$ 8 nm) với 6 sợi lông đuôi
Microviridae	DNA chuỗi đơn khép vòng	Virion hình đa diện (25–27 nm) có bướu ở 12 đỉnh, không có vỏ ngoài
Corticoviridae	DNA chuỗi kép khép vòng	Virion đường kính 60 nm, lipid nằm giữa các lớp vỏ protein, không có đuôi
Leviviridae	RNA chuỗi đơn (+)	Capsid đa diện, đường kính 24 nm
Cystoviridae	RNA chuỗi kép	Virion đồng đều, đường kính 75 nm, bao bọc bởi vỏ ngoài lipid

Về mặt cấu trúc enzyme, lysin của thực khuẩn thể vi khuẩn Gram dương thường gồm hai domain chức năng: domain xúc tác đầu N (mang hoạt tính phân cắt các liên kết như $N$-acetylmuramidase, $N$-acetyl-$\beta$-D-glucosaminidase, $N$-acetylmuramoyl-L-alanine amidase hoặc endopeptidase) và domain liên kết vách tế bào đầu C giúp gắn đặc hiệu vào carbohydrate trên vách vi khuẩn chủ.

Để biểu hiện protein lysin tái tổ hợp, tác giả sử dụng hệ thống vector pET32a(+) (hãng Novagen, kích thước 5,9 kb) mang promoter T7 mạnh, gen kháng ampicillin (bla), đoạn trình tự trxA mã hóa thioredoxin (116 axit amin) giúp tăng độ hòa tan và hỗ trợ tạo cầu disunfua cho protein ngoại lai, cùng đoạn mã hóa 6$\times$His-tag thuận lợi cho tinh sạch. Chủng vi khuẩn chủ được lựa chọn là E. coli BL21 Star™ (DE3), mang đột biến gen rne (bất hoạt RNase E giúp tăng độ bền mRNA ngoại lai) và có nồng độ protease nội bào/ngoại bào thấp.

Khóa luận áp dụng các phương pháp thực nghiệm sinh học phân tử cụ thể:

• Phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn: Cắt mở vòng vector biểu hiện pET32a(+) và cắt tách đoạn gen lysK từ vector pCR2.1 bằng cặp enzyme giới hạn BamHI và XhoI (10 $\mu$l tổng thể tích phản ứng: 5 $\mu$l plasmid 150 $\mu$g, 1 $\mu$l Buffer 3 10X, 1 $\mu$l BamHI 1U, 1 $\mu$l XhoI 1U, 2 $\mu$l H₂O; ủ ở 37°C trong 2 giờ hoặc qua đêm).
• Điện di trên gel agarose 1%: Kiểm tra kích thước đoạn DNA trong đệm TAE 1X (pha từ TAE 50X gồm Tris base, acid acetic glacial, EDTA), nhuộm ethidium bromide (EtBr) và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại.
• Thu nhận DNA từ gel (thôi gel): Tinh sạch đoạn gen và vector mở vòng bằng bộ kit S.P™ free UV (Invitrogen).
• Gắn nối đoạn gen vào vector biểu hiện: Phản ứng nối bằng T4 DNA ligase (Invitrogen) ở 22°C trong 1 giờ hoặc 14°C qua đêm (hỗn hợp gồm 2 $\mu$l vector pET32a(+), 4 $\mu$l gen lysK, 1 $\mu$l T4 DNA ligase, 1 $\mu$l Buffer T4 ligase 10X, 2 $\mu$l H₂O).
• Biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli: Chuẩn bị tế bào khả biến bằng dung dịch CaCl₂ 100 mM lạnh; biến nạp bằng kỹ thuật sốc nhiệt ở 42°C trong 1 phút 30 giây; phục hồi trong môi trường LB lỏng ở 37°C trong 1 giờ; chọn lọc trên đĩa thạch LB bổ sung ampicillin (100 $\mu$g/ml) và IPTG (100 $\mu$g/ml).
• Tách chiết plasmid: Sử dụng bộ kit của hãng Thermo Scientific qua các bước ly giải kiềm và ly tâm cột lọc.
• Xác định trình tự gen: Thực hiện theo phương pháp kết thúc chuỗi dideoxy của Sanger trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Sequencer (Applied Biosystems) sử dụng bộ kit BigDye® Terminator v3.1 (chu trình nhiệt: 96°C/1 phút; 25 chu kỳ: 96°C/10 giây, 50°C/5 giây, 60°C/4 phút; kết thúc ở 4°C).
• Biểu hiện và điện di protein: Cảm ứng sinh tổng hợp protein bằng chất cảm ứng IPTG, thu sinh khối tế bào và phân tích sự có mặt của protein tái tổ hợp bằng phương pháp điện di protein biến tính SDS-PAGE trên gel polyacrylamide (gel gom 4%, gel tách 12,5%, nhuộm màu bằng Coomassie Brilliant Blue).

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Tác giả đặt vấn đề về sự gia tăng của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, đặc biệt là tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) kháng methicillin (MRSA), dẫn đến nhu cầu tìm kiếm các tác nhân kháng khuẩn sinh học mới. Chương này xác định rõ mục đích biểu hiện lysin tái tổ hợp của thực khuẩn thể chủng K đặc hiệu S. aureus trong E. coli BL21 Star™ (DE3); nêu 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể; xác lập ý nghĩa khoa học trong việc tạo cơ sở nghiên cứu phát triển kháng sinh sinh học thế hệ mới và ý nghĩa thực tiễn trong việc tạo nguồn enzyme lysin tái tổ hợp.

Phần 2: Tổng quan nghiên cứu

Chương này tổng thuật toàn diện các tài liệu khoa học liên quan:

• Tình hình kháng kháng sinh: Dữ liệu từ Center for Disease Dynamics, Economics & Policy (CDDEP) và WHO năm 2014 ghi nhận 39/69 quốc gia xảy ra tình trạng kháng thuốc đối với các mầm bệnh nguy hiểm; tỷ lệ S. aureus kháng methicillin ở mức trên 50% tại 5/6 khu vực của WHO. Tại Việt Nam, tỷ lệ kháng của các cầu khuẩn Gram dương và trực khuẩn Gram âm ở mức cao (Streptococcus pneumoniae kháng penicillin 71,4%, kháng erythromycin 92,1%).
• Các phương pháp điều trị thay thế: Đánh giá 7 nhóm giải pháp mới gồm peptide kháng khuẩn (AMPs), liệu pháp chống độc tính (can thiệp quorum sensing, hệ tiết loại III), liệu pháp kháng thể đơn dòng, vaccine, kết hợp kháng sinh với chất ức chế $\beta$-lactamase, vật liệu sinh học phủ ion bạc và liệu pháp sử dụng phage/lysin phage.
• Sinh học thực khuẩn thể và lysin: Phân tích lịch sử phát hiện phage từ Twort (1915) và d’Hérelle (1917), phân loại theo Ackermann (2009), cơ chế chu trình sinh tan (lytic) và tiềm tan (lysogenic). Khái quát cấu trúc phân tử của lysin chủng K (LysK), đặc tính phân cắt thành tế bào vi khuẩn, tính an toàn sinh học và các nghiên cứu ứng dụng lysin (LysGH15, $\lambda$SA2-E-LysK-SH3, CF-301) trong y học, thú y (điều trị viêm vú bò) và bảo quản thực phẩm.
• Hệ thống biểu hiện: Phân tích các đặc điểm di truyền của vector pET32a(+) và tế bào chủ E. coli BL21 Star™ (DE3).

Phần 3: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục sinh phẩm, hóa chất, chủng vi sinh vật, vector, hệ thống máy móc thiết bị, công thức môi trường nuôi cấy (LB lỏng, LB đặc) và các hệ đệm điện di DNA (TAE 1X, đệm tra mẫu 5X), điện di protein SDS-PAGE (gel tách 12,5%, gel cô 4%), cùng hệ đệm dùng trong tinh sạch protein (Native Purification Buffer, Native Lysis Buffer, Native Binding Buffer chứa 10 mM Imidazole, Native Washing Buffer chứa 40 mM Imidazole, Native Elution Buffer chứa 300 mM Imidazole, 500 mM NaCl, pH 7,0). Trình bày chi tiết quy trình 9 phương pháp thực nghiệm từ cắt, gắn, biến nạp, tách chiết DNA, giải trình tự Sanger đến cảm ứng biểu hiện và điện di protein.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Nội dung chương tập trung vào các kết quả thực nghiệm đạt được:

• Thiết kế và chọn lọc vector biểu hiện pET32a(+)-lysK: Tách thành công đoạn gen lysK từ plasmid pCR2.1 và gắn vào vị trí nhận biết của BamHI và XhoI trên vector pET32a(+). Kiểm tra các dòng plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn (lập bản đồ giới hạn) và điện di trên gel agarose 1%.
• Xác định trình tự gen: Phân tích kết quả giải trình tự nucleotide của dòng plasmid tái tổ hợp chọn lọc trên máy ABI PRISM 3100, so sánh trình tự nucleotide và suy diễn chuỗi axit amin để khẳng định gen lysK được chèn đúng khung đọc mở (in-frame) phía sau promoter T7 và đoạn mã hóa thioredoxin/His-tag, không xuất hiện đột biến dịch khung hay đột biến điểm sai lệch.
• Biểu hiện protein lysin tái tổ hợp trong E. coli BL21 Star™ (DE3): Phân tích kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy sự xuất hiện của băng protein tái tổ hợp ở kích thước dự kiến (khoảng 65–70 kDa, bao gồm khối lượng của LysK kết hợp với đoạn dung hợp Trx-tag và His-tag) sau khi cảm ứng bằng IPTG.
• Khảo sát tối ưu hóa điều kiện biểu hiện: Đánh giá ảnh hưởng của các dải nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau và các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau lên mức độ biểu hiện và trạng thái tồn tại (dạng hòa tan so với dạng thể vùi) của protein lysin tái tổ hợp.

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các kết quả đạt được về mặt thiết kế cấu trúc di truyền, biểu hiện protein và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, đồng thời đề xuất các nội dung nghiên cứu tiếp theo để hoàn thiện sản phẩm.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

• Thiết kế thành công vector tái tổ hợp pET32a(+) mang gen lysK mã hóa lysin của thực khuẩn thể chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus thông qua hai vị trí cắt enzyme giới hạn BamHI và XhoI.
• Biến nạp cấu trúc plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng BL21 Star™ (DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt CaCl₂.
• Khẳng định độ chính xác của cấu trúc chèn bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn và giải trình tự gen Sanger trên hệ thống tự động ABI PRISM 3100 Avant.
• Biểu hiện thành công protein dung hợp Trx-His-LysK trong chủng vi khuẩn E. coli BL21 Star™ (DE3) dưới sự cảm ứng của IPTG, kiểm chứng qua bản gel điện di SDS-PAGE với kích thước phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết.
• Xác định được điều kiện cảm ứng IPTG và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhằm gia tăng tỷ lệ protein lysin ở trạng thái hòa tan trong tế bào chất của vi khuẩn chủ.

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Tiếp tục tối ưu hóa quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực ion kim loại cố định (IMAC) với cột Ni-NTA dựa trên các hệ đệm đệm rửa và đệm thôi đã thiết lập (Native Binding Buffer 10 mM Imidazole, Native Washing Buffer 40 mM Imidazole, Native Elution Buffer 300 mM Imidazole).
• Tiến hành các thử nghiệm in vitro để đánh giá hoạt tính ly giải tế bào vi khuẩn của lysin tái tổ hợp đối với các chủng tụ cầu vàng chuẩn và các chủng S. aureus phân lập lâm sàng, đặc biệt là các chủng kháng methicillin (MRSA).
• Nghiên cứu độ bền nhiệt, pH tối thích và hoạt tính kháng khuẩn kết hợp giữa lysin tái tổ hợp với các kháng sinh thông thường.

Đóng góp học thuật

Đề tài là một trong những công trình nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam thực hiện thành công quy trình dòng hóa và biểu hiện gen mã hóa lysin của bacteriophage đặc hiệu tụ cầu vàng trong hệ thống biểu hiện nhân sơ E. coli BL21 Star™ (DE3). Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm về thiết kế vector và điều kiện cảm ứng biểu hiện, đóng góp tư liệu cho định hướng phát triển các chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh truyền thống.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Trong phạm vi thời gian và điều kiện thực hiện của một khóa luận tốt nghiệp đại học, nghiên cứu mới hoàn thành ở bước tạo dòng, xác định trình tự, biểu hiện protein tái tổ hợp và khảo sát sơ bộ điều kiện cảm ứng; chưa thực hiện tinh sạch triệt để protein qua cột sắc ký và chưa tiến hành thử nghiệm hoạt tính lytic kháng khuẩn trực tiếp trên các chủng vi khuẩn sống.
• Hướng mở rộng: Tinh sạch thu nhận protein lysin đơn dòng có độ tinh khiết cao, loại bỏ đoạn tag dung hợp nếu cần thiết; kiểm tra phổ kháng khuẩn trên nhiều chủng tụ cầu vàng khác nhau; thử nghiệm hiệu quả diệt khuẩn trên mô hình động vật thực nghiệm hoặc trong các nền mẫu thực phẩm (sữa, thịt).

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Sinh học phân tử và Dược học. Các nội dung có giá trị tham khảo cao bao gồm:

• Quy trình chuẩn về thiết kế vector biểu hiện pET32a(+) sử dụng enzyme giới hạn BamHI và XhoI.
• Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến và biến nạp sốc nhiệt bằng dung dịch CaCl₂.
• Quy trình giải trình tự gen Sanger trên hệ thống ABI PRISM 3100 với kit BigDye® Terminator v3.1.
• Phương pháp khảo sát và tối ưu hóa biểu hiện protein tái tổ hợp hòa tan bằng chất cảm ứng IPTG trong chủng E. coli BL21 Star™ (DE3).

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng vector và chủng vi khuẩn nào để biểu hiện protein lysin? Khóa luận sử dụng vector biểu hiện pET32a(+) của hãng Novagen (kích thước 5,9 kb, mang promoter T7, gen kháng ampicillin và đoạn mã hóa thioredoxin) và tế bào chủ là Escherichia coli chủng BL21 Star™ (DE3) mang đột biến gen rne.

2. Cặp enzyme giới hạn nào được chọn để đưa gen lysK vào vector biểu hiện? Tác giả sử dụng cặp enzyme giới hạn BamHI và XhoI để cắt đoạn gen lysK ra khỏi vector tách dòng pCR2.1 và cắt mở vòng vector pET32a(+), giúp gắn gen ngoại lai theo đúng chiều đọc mã di truyền.

3. Vai trò của đoạn trình tự trxA trên vector pET32a(+) là gì? Trình tự trxA mã hóa protein thioredoxin (116 axit amin), có chức năng làm tăng độ hòa tan của protein ngoại lai biểu hiện trong E. coli, hỗ trợ hình thành cầu nối disunfua trong quá trình gấp cuộn protein và bảo vệ protein mới tổng hợp trước sự phân hủy nhiệt độ.

4. Vì sao chủng vi khuẩn E. coli BL21 Star™ (DE3) phù hợp cho việc biểu hiện gen lysK? Chủng vi khuẩn này mang đột biến ở gen rne làm bất hoạt enzyme RNase E nội bào, giúp hạn chế sự phân hủy mRNA ngoại lai và kéo dài thời gian tồn tại của bản phiên mã. Ngoài ra, chủng có mức enzyme protease nội bào và ngoại bào thấp, giúp giảm thiểu sự phân giải protein tái tổ hợp.

5. Cơ chế ly giải vi khuẩn của enzyme lysin bacteriophage có điểm gì khác biệt so với kháng sinh truyền thống? Lysin tác động trực tiếp và nhanh chóng từ bên ngoài để thủy phân các liên kết hóa học đặc thù trong lớp peptidoglycan của thành tế bào vi khuẩn Gram dương, gây áp lực thẩm thấu làm vỡ tế bào. Do cơ chế này nhắm vào cấu trúc vách tế bào thiết yếu được bảo tồn qua tiến hóa, vi khuẩn rất khó hình thành cơ chế đề kháng như đối với các loại kháng sinh trao đổi chất.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Vũ Thị Trang đã thiết kế thành công vector biểu hiện pET32a(+) mang gen lysK mã hóa lysin của thực khuẩn thể chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp trong chủng E. coli BL21 Star™ (DE3). Nghiên cứu đã kiểm tra tính chính xác của cấu trúc chèn bằng phương pháp cắt giới hạn và giải trình tự gen tự động Sanger, đồng thời xác lập các điều kiện cảm ứng IPTG phù hợp để thu nhận protein tái tổ hợp. Đây là công trình thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, đóng góp dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng lysin thực khuẩn thể trong điều trị vi khuẩn kháng thuốc.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Từ khi Alexander Fleming (1881-1955) tìm ra kháng sinh penicillin cho đến nay, con số chất kháng sinh được nghiên cứu đã lên tới trên 5. Sự ra đời của kháng sinh được xem là thần dược mang lại sự sống cho hàng trăm triệu người trên thế giới. Số lượng kháng sinh mới được phát triển, bào chế ngày càng tăng để bắt kịp sự xuất hiện của các loại vi khuẩn gây bệnh mới. Tuy nhiên, vi sinh vật gây bệnh trở nên kháng với các loại thuốc điều trị là một vấn đề ngày càng lớn trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Khả năng kháng lại kháng sinh của vi sinh vật de dọa ngày càng cao việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm… gây ra. Ngày nay, khoảng 70% vi khuẩn gây nhiễm trùng có mặt tại các bệnh viện có khả năng kháng ít nhất một trong những loại thuốc thường được sử dụng để điều trị. Nguy cơ xuất hiện các chủng siêu vi khuẩn có khả năng kháng tất cả các loại kháng sinh hiện có là mối lo sợ của nhân loại và là thách thức lớn đối với giới khoa học. áo cáo giám sát toàn cầu về kháng kháng sinh năm 2014 của WHO cho thấy khả năng kháng thuốc kháng sinh không còn là một dự đoán cho tương lai, nó đang xảy ra, trên khắp thế giới, gây ra nhiều rủi ro trong khả năng điều trị những bệnh nhiễm trùng phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện.

Vi khuẩn tụ cầu (Staphylococcus) là một tác nhân gây ra rất nhiều loại bệnh nặng và có khả năng kháng kháng sinh rất cao. Nhiễm khuẩn tụ cầu có thể được chữa trị bằng kháng sinh bình thường, nhưng nhiều trường hợp vi khuẩn trở lên kháng thuốc, nhiễm vào các cơ quan nội tạng gây tử vong và những di chứng nặng nề khác. aureus) là một tác nhân gây viêm, ngộ độc thực phẩm và hội chứng sốc độc với tỷ lệ tử vong cao (Noble WC et al. Năm 1941, tất cả các tụ cầu khuẩn vàng gây bệnh dễ dàng bị diệt bởi kháng sinh penicillin, nhưng chỉ 3 năm sau tụ cầu khuẩn vàng đã trở nên kháng thuốc.

Các 2 Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh của Mỹ cho biết năm 1972 chỉ có 2% trường hợp viêm nhiễm khuẩn tụ cầu vàng kháng thuốc, nhưng năm 2004 con số này là 63%. Cũng tương tự một số vi khuẩn khác, S. aureus tiết ra β lactamase để chống kháng sinh ampicillin, hoặc axetyl transferase để chống kháng sinh chloramphenicol… Một số thống kê cho thấy hiện nay có hơn 95% loài vi khuẩn kháng thuốc penicillin, thậm chí có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh, điển hình như S.aureus kháng methicillin (MRSA). Đứng trước nguy cơ trên, nhiều nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu các loại kháng sinh có nguồn gốc khác từ động vật, thực vật, côn trùng.

để tìm ra loại kháng sinh mới an toàn, có hiệu lực cao và khó bị vi khuẩn kháng lại. Một trong các chiến lược hiệu quả đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu để chống lại các vi khuẩn kháng thuốc đó là sử dụng lysin. Lysins, còn được gọi là endolysins hoặc murein hydrolases, là enzyme thủy phân peptidoglycan của các phage trong giai đoạn cuối cùng của chu kỳ ly giải tế bào. Khi tác dụng ngoại sinh (như lysin tái tổ hợp được tinh sạch) lên các vi khuẩn Gram dương gây ly giải nhanh chóng và tiêu diệt tế bào vi khuẩn (Loresser MJ, 2005).Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh tiềm năng lớn của các enzym này để kiểm soát và điều trị bệnh nhiễm trùng bề mặt niêm mạc và nhiễm trùng toàn thân.

Ngoài ra, lysin cũng có tiềm năng trong phát hiện và loại bỏ các tác nhân gây nhiễm độc thực phẩm. Các kết quả trên mở ra hướng nghiên cứu tiềm năng trong ứng dụng bacteriophage lysins tái tổ hợp như loại thuốc mới, một vũ khí mạnh trong cuộc chiến chống lại hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn (Fenton M et al. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu biểu hiện Lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus ở Escherichia coli”. Mục đích nghiên cứu Biểu hiện được lysin tái tổ hợp của Bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong vi khuẩn E.

coli BL21 starTM ( DE3). Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa lysin của thực khuẩn thể vi khuẩn Staphylococcus aureus. - Biểu hiện thành công gen mã hóa lysin trong E .coli chủng BL21 starTM (DE3). - Tối ưu một số điều kiện biểu hiện lysin phage trong E.

Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển được kháng sinh thế hệ mới thay thế, bổ sung cho kháng sinh trong việc điều trị vi khuẩn gây bệnh. Ý nghĩa thực tiễn Tạo được lysin tái tổ hợp có nguồn gốc từ bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus. 4 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.

Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài 2. Tình trạng kháng kháng sinh 2. Tình hình kháng kháng sinh trên thế giới. Theo Trung tâm ệnh Dynamics, Kinh tế và Chính sách (Center for Disease Dynamics, Economics &Policy) và dự án Hợp tác toàn cầu về đề kháng kháng sinh (The Global Antibiotic Resistance Partnership) đã cùng đưa ra báo cáo mới về tình hình kháng sinh toàn thế giới 2015 đề cập đến tình trạng sử dụng kháng sinh và đề kháng kháng sinh ở người và vật nuôi.

Theo đó trình trạng sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh đang ở mức đáng báo động, có 39 quốc gia xảy ra tình trạng kháng thuốc trên tổng số 69 quốc gia sử dụng thuốc kháng sinh. Dữ liệu Resistance Map đề cập đến các bệnh nhiễm do 12 loại vi khuẩn nguy hiểm thường gặp trong đó có E.coli, Salmonella, Methicillin-resistant S.1: Vi khuẩn thƣờng gây nhiễm trùng trong bệnh viện và cộng đồng năm 2014 Khu vực Số nƣớc bị của WHO nhiễm có tình trên tổng số trạng Tác hại Tên loài vi khuẩn kháng 194 nƣớc kháng > kháng sinh thành viên 50% hoặc của WHO hơn Escherichia coli Nhiễm trùng Kháng cephalosporins 86 5/6 đường tiết niệu, Kháng fluoroquinolones 92 5/6 nhiễm trùng máu Viêm phổi, nhiễm Klebsiella pneumonia 87 6/6 trùng máu, nhiễm Kháng cephalosporins 71 2/6 trùng đường tiết Kháng carbapenems niệu Nhiễm trùng vết Staphylococcus aureus 85 5/6 thương, nhiễm Kháng methicillin MRSA trùng máu 5 2. Tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam. Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao.

Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy: Ở Việt Nam, các chủng Streptococcus pneumoniae - một trong những nguyên nhân thường gặp nhất gây nhiễm khuẩn hô hấp – kháng penicillin (71.4%) và kháng erythromycin (92.1%) – có tỉ lệ phổ biến cao nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP) năm 2000-2001, 75% các chủng pneumococci kháng với ba hoặc trên ba loại kháng sinh, 57% Haemophilus influenzae (một căn nguyên vi khuẩn phổ biến khác) phân lập từ bệnh nhi ở Hà Nội (2000-2002) kháng với ampicillin. Tỉ lệ tương tự cũng được báo cáo ở Nha Trang. Các vi khuẩn gram âm đa số là kháng kháng sinh (enterobacteriaceae): hơn 25% số chủng phân lập tại một bệnh viện Thành phố Hồ Chí Minh kháng với kháng sinh cephalosporin thế hệ 3, theo nghiên cứu năm 2000-2001. Theo báo cáo của một nghiên cứu khác năm 2009 cho thấy, 42% các chủng vi khuẩn gram âm kháng với ceftazidime, 63% kháng với gentamicin và 74% kháng với acid nalidixic tại cả bệnh viện và trong cộng đồng.

Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh cũng thể hiện rõ rệt. Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các chủng pneumococcus kháng với penicillin. Đến năm1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên 56%. Xu hướng tương tự cũng được báo cáo tại các tỉnh phía bắc Việt Nam (Bộ y tế - 2010).2 Staphylococcus aureus Chi Staphylococus là cầu khuẩn Gram dương, được giới thiệu trong cuốn Sổ tay Hệ thống vi khuẩn học của ergey.

Được chia làm 2 nhóm: Hiếu khí (Micrococcus, planococcus, và Deinococcus) và kị khí (Staphylococcus, Stomatococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Coprococus, và Sacina). Họ Micrococcaceae gồm 4 loài: Micrococcus, Stomatococus, Planococus, và Staphylococus. Thuộc tính khác biệt của cầu khuẩn Gram dương gồm sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt buộc, hiếu khí tùy ý hoặc vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện diện của cytochrome, sản phẩm 6 lên men kị khí chủ yếu từ carbohydrates, peptidoglycan, acid teichois trên thành tế bào, menaquinones (Scott EM et al. Sự phân loại của Staphylococus aures như sau: Giới: Procaryotae.

Họ: Micrococaceae Chi: Staphylococcus. Theo nhiều nghiên cứu ở Việt Nam, trong các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng (S. aureus) là loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và kháng lại kháng sinh mạnh nhất. Đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc thức ăn, gây nhiễm trùng bệnh viện… Tụ cầu vàng thường ký sinh ở mũi họng và có thể cả ở da.

Vi khuẩn này gây bệnh cho người bị suy giảm đề kháng hoặc chúng có nhiều yêu tố độc lực. Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp (Le Huy Chinh, 2001). Hình dạng và kích thƣớc Tụ cầu là những cầu khuẩn, có đường kính từ 0,8-1,0 μm và đứng thành hình chùm nho, bắt màu Gram dương, không có lông, không nha bào, thường không có vỏ (Lê Huy Chinh, 2001). Nuôi cấy Tụ cầu vàng thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển được ở nhiệt độ 10 – 450C và nồng độ muối cao tới 10%.

Thích hợp được ở điều kiện hiếu và kỵ khí. – Trên môi trường thạch thường, tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, đường kính 1-2 mm, nhẵn. Sau 24 giờ ở 370C, khuẩn lạc thường có màu vàng chanh. – Trên môi trường thạch máu, tụ cầu vàng phát triển nhanh, tạo tan máu hoàn toàn.

Tụ cầu vàng tiết ra 5 loại dung huyết tố (hemolysin): a, β, δ, e, y. 7 – Trên môi trường canh thang: tụ cầu vàng làm đục môi trường, để lâu nó có thể lắng cặn. Khả năng để kháng Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn không có nha bào khác. Nó bị diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút).

Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà vi khuẩn có thể phát triển. Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường.