Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Của Bacteriophage Chủng K Đặc Trưng Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli

• Tác giả: Vũ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS TS. Đồng Văn Quyền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Của Bacteriophage Chủng K Đặc Trưng Staphylococcus aureus Ở Escherichia coli
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2016
• Địa điểm: Thái Nguyên

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
• DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
• DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích nghiên cứu
• 1.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 1.3.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 2.1. Cơ sở thực tiễn và cơ sở khoa học của đề tài
• 2.2. Tình trạng kháng kháng sinh
• 2.2.1. Tình hình kháng kháng sinh trên thế giới
• 2.2.2. Tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam
• 2.3. Các phương pháp điều trị bệnh do vi khuẩn
• 2.4. Tổng quan về thực khuẩn thể (bacteriophage)
• 2.5. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện
• 2.5.1. Vector biểu hiện
• 2.5.2. Hệ thống biểu hiện E.
• 3. PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Hóa chất và sinh phẩm
• 3.3. Trang thiết bị
• 3.4. Môi trường và dung dịch làm việc
• 3.5. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
• 3.6. Nội dung nghiên cứu
• 3.7. Phương pháp nghiên cứu
• 3.7.1. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn
• 3.7.2. Phương pháp điện di trên gel Agarose
• 3.7.3. Thu nhận DNA từ gel agarose (thôi gel)
• 3.7.4. Gắn đoạn gen mã hóa lysin vào vector biểu hiện
• 3.7.5. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến E.
• 3.7.6. Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
• 3.7.7. Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
• 3.7.8. Phương pháp biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.
• 3.7.9. Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide
• 3.7.10. Phương pháp biểu hiện- xác định trạng thái tồn tại của lysin
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Thiết kế vector biểu hiện
• 4.2. Kết quả thiết kế vector pET32(a+) mang gen lysK
• 4.3. Chọn lọc các dòng plasmid mang gen lysK bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn
• 4.4. Kiểm tra chiều gắn khung đọc của đoạn chèn trong vector pET32a(+)
• 4.5. Biểu hiện gene mã hóa lysin trong vi khuẩn
• 4.6. Biểu hiện lysin phage trong vi khuẩn E.
• 4.7. Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Biểu Hiện Lysin Phage K Giới Thiệu

Nghiên cứu biểu hiện lysin của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong Escherichia coli mở ra hướng đi mới trong cuộc chiến chống lại tình trạng kháng kháng sinh. Sự gia tăng các chủng vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là S. aureus, đòi hỏi các giải pháp thay thế hiệu quả. Lysin, enzyme phân giải peptidoglycan của vi khuẩn, hứa hẹn là một vũ khí tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện gen lysin của phage K trong E. coli, một hệ thống biểu hiện được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử. Mục tiêu là tạo ra protein lysin tái tổ hợp, có khả năng tiêu diệt S. aureus một cách đặc hiệu. Thành công của nghiên cứu này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các liệu pháp điều trị nhiễm trùng mới, giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh truyền thống. Dẫn chứng từ tài liệu gốc cho thấy sự cấp thiết của việc tìm kiếm các giải pháp thay thế kháng sinh do tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Lysin Phage K

Tình trạng kháng kháng sinh đang trở thành mối đe dọa toàn cầu, đặc biệt là đối với các vi khuẩn như Staphylococcus aureus. Việc nghiên cứu và phát triển các phương pháp điều trị thay thế, như sử dụng protein lysin từ bacteriophage, là vô cùng quan trọng. Lysin có khả năng phá vỡ cấu trúc tế bào vi khuẩn một cách đặc hiệu, mở ra tiềm năng lớn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do S. aureus gây ra. Nghiên cứu này tập trung vào việc biểu hiện lysin của phage K, một chủng bacteriophage đặc hiệu cho S. aureus, nhằm tạo ra một công cụ hiệu quả để chống lại vi khuẩn này.

1.2. Mục Tiêu Và Phạm Vi Của Đề Tài Nghiên Cứu

Đề tài tập trung vào việc biểu hiện lysin tái tổ hợp của bacteriophage chủng K đặc hiệu Staphylococcus aureus trong vi khuẩn E. coli BL21 starTM (DE3). Các mục tiêu cụ thể bao gồm thiết kế vector biểu hiện mang gen lysin, biểu hiện thành công gen lysin trong E. coli, và tối ưu hóa một số điều kiện biểu hiện lysin phage. Phạm vi nghiên cứu giới hạn trong việc biểu hiện gen và đánh giá sơ bộ hoạt tính của protein lysin tái tổ hợp. Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về ứng dụng của lysin trong điều trị nhiễm trùng S. aureus.

II. Thách Thức Kháng Kháng Sinh Giải Pháp Lysin Phage K

Tình trạng kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus đang gây ra những thách thức lớn trong điều trị nhiễm trùng. Các chủng MRSA (Methicillin-resistant S. aureus) ngày càng phổ biến, khiến việc điều trị trở nên khó khăn và tốn kém. Lysin phage, với cơ chế tác động khác biệt so với kháng sinh, có thể là một giải pháp tiềm năng. Cơ chế ly giải của lysin dựa trên việc phá vỡ cấu trúc peptidoglycan của tế bào vi khuẩn, một mục tiêu mà vi khuẩn khó có thể phát triển cơ chế kháng lại. Nghiên cứu này nhằm mục đích khai thác tiềm năng của lysin từ bacteriophage chủng K để đối phó với tình trạng kháng kháng sinh của S. aureus. Việc biểu hiện lysin trong E. coli là một bước quan trọng để sản xuất protein lysin với số lượng lớn, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt tính và ứng dụng.

2.1. Thực Trạng Kháng Kháng Sinh Của Staphylococcus Aureus

Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất, gây ra nhiều loại nhiễm trùng từ nhẹ đến nghiêm trọng. Tuy nhiên, sự gia tăng của các chủng kháng kháng sinh, đặc biệt là MRSA, đang làm giảm hiệu quả của các phương pháp điều trị truyền thống. Theo báo cáo của WHO, khả năng kháng thuốc kháng sinh không còn là dự đoán cho tương lai, nó đang xảy ra, trên khắp thế giới, gây ra nhiều rủi ro trong khả năng điều trị những bệnh nhiễm trùng phổ biến trong cộng đồng và bệnh viện. Điều này đòi hỏi sự tìm kiếm các giải pháp thay thế, trong đó lysin phage nổi lên như một ứng cử viên đầy hứa hẹn.

2.2. Ưu Điểm Của Lysin Phage So Với Kháng Sinh

Lysin phage có một số ưu điểm so với kháng sinh truyền thống. Thứ nhất, lysin có cơ chế tác động đặc hiệu, chỉ tấn công vào peptidoglycan của vi khuẩn mục tiêu, giảm thiểu tác động đến hệ vi sinh vật có lợi. Thứ hai, vi khuẩn khó có thể phát triển cơ chế kháng lại lysin do mục tiêu tác động là cấu trúc peptidoglycan, một thành phần thiết yếu của tế bào vi khuẩn. Thứ ba, lysin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn nhanh chóng, ngay cả khi vi khuẩn đang ở trạng thái không hoạt động. Những ưu điểm này khiến lysin phage trở thành một lựa chọn hấp dẫn để thay thế hoặc bổ sung cho kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng.

III. Phương Pháp Biểu Hiện Lysin Phage K Quy Trình Chi Tiết

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp sinh học phân tử để biểu hiện gen lysin của bacteriophage chủng K trong Escherichia coli. Quy trình bao gồm các bước chính: thiết kế vector biểu hiện, gắn gen lysin vào vector, biến nạp vector vào E. coli, và cảm ứng biểu hiện protein lysin. Vector biểu hiện được sử dụng là pET32a(+), một vector phổ biến cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với số lượng lớn. E. coli BL21 starTM (DE3) được sử dụng làm vật chủ biểu hiện do khả năng biểu hiện protein cao và dễ dàng kiểm soát. Quá trình biểu hiện được tối ưu hóa bằng cách điều chỉnh các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ IPTG (chất cảm ứng), và thời gian biểu hiện. Kết quả biểu hiện được đánh giá bằng phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide.

3.1. Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen Lysin Phage K

Việc thiết kế vector biểu hiện là bước quan trọng để đảm bảo biểu hiện thành công gen lysin. Vector pET32a(+) được lựa chọn vì có hệ thống kiểm soát biểu hiện mạnh mẽ và khả năng tạo ra protein tái tổ hợp với thẻ His, giúp dễ dàng tinh sạch. Gen lysin được khuếch đại bằng PCR từ DNA của bacteriophage chủng K, sau đó được cắt bằng enzyme giới hạn và gắn vào vector pET32a(+). Quá trình này tạo ra vector tái tổ hợp mang gen lysin, sẵn sàng cho bước biến nạp vào E. coli.

3.2. Biểu Hiện Protein Lysin Trong Escherichia Coli

Sau khi vector tái tổ hợp được biến nạp vào E. coli, quá trình biểu hiện protein lysin được kích hoạt bằng cách thêm IPTG vào môi trường nuôi cấy. IPTG gắn vào protein ức chế, giải phóng gen lysin khỏi sự kiểm soát và cho phép RNA polymerase phiên mã gen. E. coli sau đó dịch mã mRNA thành protein lysin. Các điều kiện biểu hiện, như nhiệt độ và nồng độ IPTG, được tối ưu hóa để đạt được hiệu quả biểu hiện cao nhất. Protein lysin được thu nhận từ tế bào E. coli và tinh sạch bằng sắc ký ái lực niken.

3.3. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Biểu Hiện Lysin Phage

Để tối đa hóa lượng protein lysin được biểu hiện, các điều kiện biểu hiện cần được tối ưu hóa. Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ IPTG, và thời gian biểu hiện được điều chỉnh và đánh giá ảnh hưởng đến hiệu quả biểu hiện. Nhiệt độ thấp hơn thường giúp giảm tốc độ biểu hiện, cho phép protein lysin gấp nếp đúng cách và tăng tính ổn định. Nồng độ IPTG tối ưu cần được xác định để cân bằng giữa hiệu quả biểu hiện và độc tính của IPTG đối với tế bào E. coli. Thời gian biểu hiện cũng cần được điều chỉnh để đạt được lượng protein lysin cao nhất mà không gây ảnh hưởng đến sự sống của tế bào.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Biểu Hiện Thành Công Lysin Phage K

Nghiên cứu đã biểu hiện thành công protein lysin của bacteriophage chủng K trong Escherichia coli. Kết quả điện di protein cho thấy sự xuất hiện của một băng protein có kích thước phù hợp với protein lysin tái tổ hợp. Protein lysin được tinh sạch bằng sắc ký ái lực niken và được xác định bằng phương pháp Western blot. Hoạt tính kháng khuẩn của protein lysin được đánh giá bằng cách thử nghiệm khả năng tiêu diệt Staphylococcus aureus trong ống nghiệm. Kết quả cho thấy protein lysin có khả năng tiêu diệt S. aureus một cách hiệu quả, chứng minh tiềm năng của nó trong việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra.

4.1. Xác Nhận Biểu Hiện Protein Lysin Bằng Điện Di

Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE) là phương pháp được sử dụng để xác nhận sự biểu hiện của protein lysin. Mẫu protein từ tế bào E. coli sau khi cảm ứng biểu hiện được điện di và so sánh với mẫu đối chứng (tế bào E. coli không cảm ứng). Sự xuất hiện của một băng protein mới trong mẫu cảm ứng, có kích thước phù hợp với protein lysin tái tổ hợp, là bằng chứng cho thấy protein lysin đã được biểu hiện thành công.

4.2. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Protein Lysin

Hoạt tính kháng khuẩn của protein lysin được đánh giá bằng cách thử nghiệm khả năng tiêu diệt Staphylococcus aureus trong ống nghiệm. Protein lysin được ủ với S. aureus trong một khoảng thời gian nhất định, sau đó số lượng tế bào S. aureus sống sót được đếm. Nếu protein lysin có hoạt tính kháng khuẩn, số lượng tế bào S. aureus sống sót sẽ giảm đáng kể so với mẫu đối chứng (không có protein lysin). Kết quả này chứng minh rằng protein lysin có khả năng tiêu diệt S. aureus và có tiềm năng trong việc điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn này gây ra.

V. Ứng Dụng Lysin Phage K Hướng Đi Mới Điều Trị Nhiễm Trùng

Kết quả nghiên cứu mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng lysin phage để điều trị nhiễm trùng do Staphylococcus aureus. Lysin có thể được sử dụng như một loại thuốc kháng khuẩn mới, thay thế hoặc bổ sung cho kháng sinh truyền thống. Ngoài ra, lysin cũng có thể được sử dụng trong các sản phẩm khử trùng, giúp ngăn ngừa sự lây lan của S. aureus trong bệnh viện và cộng đồng. Nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc đánh giá tính an toàn và hiệu quả của lysin trên mô hình động vật, cũng như phát triển các phương pháp sản xuất lysin với quy mô lớn.

5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Lysin Trong Y Học

Lysin có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng trong y học, đặc biệt là trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh. Lysin có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu và hiệu quả. Ngoài ra, lysin cũng có thể được sử dụng trong các liệu pháp kết hợp, tăng cường hiệu quả của kháng sinh truyền thống và giảm nguy cơ phát triển kháng thuốc.

5.2. Ứng Dụng Lysin Trong Ngành Công Nghiệp Thực Phẩm

Lysin cũng có tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, giúp kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm. Lysin có thể được sử dụng để khử trùng bề mặt thực phẩm, ngăn ngừa sự lây lan của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm. Ngoài ra, lysin cũng có thể được sử dụng trong các sản phẩm bảo quản thực phẩm tự nhiên, thay thế cho các chất bảo quản hóa học.

VI. Kết Luận Triển Vọng Nghiên Cứu Lysin Phage K Tương Lai

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của lysin từ bacteriophage chủng K trong việc chống lại Staphylococcus aureus. Việc biểu hiện thành công protein lysin trong E. coli là một bước quan trọng để phát triển các liệu pháp điều trị nhiễm trùng mới. Nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình biểu hiện, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của lysin trên mô hình động vật, và phát triển các phương pháp sản xuất lysin với quy mô lớn. Ứng dụng lysin hứa hẹn sẽ mang lại những đột phá trong điều trị nhiễm trùng và kiểm soát sự lây lan của vi khuẩn kháng kháng sinh.

6.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Lysin Phage K

Các hướng nghiên cứu tiếp theo về lysin phage K bao gồm: tối ưu hóa quá trình biểu hiện để tăng sản lượng protein lysin, cải thiện tính ổn định và hoạt tính của lysin, đánh giá tính an toàn và hiệu quả của lysin trên mô hình động vật, và phát triển các phương pháp sản xuất lysin với quy mô lớn. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của lysin và khả năng phát triển kháng thuốc của vi khuẩn.

6.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Lysin Trong Tương Lai

Nghiên cứu về lysin có tầm quan trọng đặc biệt trong bối cảnh tình trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng. Lysin có thể là một giải pháp tiềm năng để thay thế hoặc bổ sung cho kháng sinh truyền thống, giúp điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng thuốc. Việc phát triển các liệu pháp dựa trên lysin sẽ góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng và giảm gánh nặng kinh tế do nhiễm trùng gây ra.