Nghiên Cứu Tạo Tế Bào E. coli Biểu Hiện Kháng Thể CB6 Chống Virus SARS-CoV-2

• Tác giả: Nguyễn Văn Đoán
• Người hướng dẫn: TS. Đoàn Chính Chung
• Trường học: Trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tạo Tế Bào E. coli Biểu Hiện Kháng Thể CB6 Chống Virus SARS-CoV-2
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về virus SARS-CoV-2
• 1.2. Đại dịch COVID-19 và virus SARS-CoV-2
• 1.3. Glycoprotein s và vùng bám đặc hiệu với thụ thể (Receptor Binding Domain - RBD)
• 1.4. Tổng quan về kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb)
• 1.4.1. Kháng thể dạng khảm
• 1.4.2. Kháng thể nhân hóa
• 1.4.3. Kháng thể người
• 1.4.4. Kháng thể bán phần cấu trúc Fab
• 1.4.5. Kháng thể bán phần chuỗi đơn
• 1.5. Biểu hiện protein tái tổ hợp dạng thể vùi trong tế bào vi khuẩn E. coli
• 1.5.1. Ưu điểm biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli
• 1.5.2. Sự hình thành thể vùi trong tế bào chất E. coli, hệ thống vector và cơ chế kiểm soát được dùng trong biểu hiện protein CB6
• 1.6. Tách chiết và tinh sạch plasmid
• 1.7. Biến nạp và chọn lọc tế bào biểu hiện gen mục tiêu
• 1.8. Tạo tế bào khả nạp và biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli
• 1.9. Chọn lọc tế bào biến nạp
• 1.10. Nuôi cấy vi khuẩn E. coli
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.1.1. Chủng vi sinh vật
• 2.1.2. Gen kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 sử dụng làm khuôn
• 2.1.3. Các mồi dùng trong giải trình tự
• 2.2. Hóa chất nghiên cứu
• 2.2.1. Hóa chất dùng trong nuôi cấy vi khuẩn
• 2.2.2. Hóa chất dùng trong xác định kích thước protein và bán định lượng - SDS-PAGE
• 2.2.3. Hóa chất dùng trong định tính kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 - Western Blot
• 2.2.4. Hóa chất dùng trong kiểm tra hoạt tính trung hòa SARS-CoV-2
• 2.2.5. Hóa chất dùng trong xác định protein tổng số - Bradford
• 2.2.6. Hóa chất dùng trong định tính kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 - Immunodot
• 2.3. Dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 2.4.2. Phương pháp tạo tế bào E. coli khả nạp
• 2.4.3. Phương pháp hóa biến nạp
• 2.4.4. Thu nhận gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6
• 2.4.5. Gắn đoạn gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 vào plasmid pNANOGEN
• 2.4.6. Sàng lọc thể biến nạp E. coli Top 10F’ chứa plasmid pNANOGEN-CB6
• 2.4.7. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E. coli
• 2.4.8. Phương pháp tạo tế bào khả nạp và biến nạp plasmid pNANOGEN vào tế bào E. coli
• 2.4.9. Phương pháp kiểm tra E. coli BL21 (DE3) biểu hiện gen CB6
• 2.4.10. Khảo sát chất cảm ứng thích hợp
• 2.4.11. Khảo sát tốc độ lắc
• 2.4.12. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng
• 2.4.13. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli mang vector tái tổ hợp sản xuất protein CB6 ở quy mô phòng thí nghiệm ở các điều kiện đã khảo sát thích hợp
• 2.4.14. Thu nhận protein CB6 từ tế bào E. coli
• 2.4.15. Tinh sạch protein CB6
• 2.4.16. Kiểm tra và đánh giá sơ bộ chất lượng kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2 RBD
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả 1: Tạo dòng E. coli mang vector pNANOGEN-CB6 biểu hiện protein CB6
• 3.1.1. Thu nhận gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6
• 3.1.2. Tạo dòng E. coli TOP 10F’ mang vector tái tổ hợp pNANOGEN-CB6
• 3.1.3. Sàng lọc thể biến nạp E. coli Top 10F’ chứa plasmid pNANOGEN-CB6
• 3.2. Kết quả biến nạp và biểu hiện kháng thể kháng protein SARS-CoV-2 RBD dạng bán phần chuỗi đơn trên tế bào E. coli
• 3.2.1. Kết quả tách chiết, tinh sạch plasmid pNANOGEN-CB6
• 3.2.2. Kết quả chọn lọc dòng tế bào E. coli BL21 mang plasmid pNANOGEN-CB6
• 3.2.3. Kết quả kiểm tra biểu hiện gen mục tiêu CB6
• 3.3. Kết quả 2: Xây dựng đường cong tăng trưởng chủng E. coli BL21(DE3)/pNANOGEN-CB6 trên môi trường LB
• 3.4. Kết quả 3: Kết quả khảo sát điều kiện lên men từ chủng E. coli tái tổ hợp mang vector chứa gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6
• 3.4.1. Kết quả khảo sát chất cảm ứng thích hợp cho chủng E. coli BL21 (DE3) Star/pNANOGEN-CB6
• 3.4.2. Kết quả khảo sát tốc độ lắc ảnh hưởng đến sự phát triển của E. coli BL21 (DE3)-pNANOGEN-CB6
• 3.4.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trong quá trình cảm ứng
• 3.5. Kết quả 4: Nuôi cấy thu nhận protein CB6 từ chủng E. coli BL21(DE3)/pNANOGEN-CB6 ở quy mô 5 lít
• 3.6. Kết quả 5: Kiểm tra và đánh giá sơ bộ chất lượng kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2 RBD
• 3.6.1. Tiêu chuẩn nguyên liệu kháng thể kháng SARS-CoV-2
• 3.6.2. Kết quả phân tích mẫu kháng thể trung hòa SARS-CoV-2
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Tạo Tế Bào E

Đại dịch COVID-19, do virus SARS-CoV-2 gây ra, đã gây ra hậu quả nghiêm trọng trên toàn cầu. Để đối phó với đại dịch, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các phương pháp điều trị và phòng ngừa, trong đó có việc tạo ra các kháng thể ức chế hoạt động của virus. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo ra dòng tế bào E. coli biểu hiện kháng thể CB6, một kháng thể có khả năng ức chế sự xâm nhập của SARS-CoV-2. Việc sử dụng E. coli làm nền tảng sản xuất kháng thể hứa hẹn mang lại một quy trình hiệu quả và kinh tế hơn so với các phương pháp truyền thống. Kháng thể CB6 là một trong những kháng thể đầy triển vọng được phân lập từ bệnh nhân COVID-19, nó có khả năng ức chế mạnh sự liên kết của protein gai virus với thụ thể ACE2 trên tế bào người.

1.1. Virus SARS CoV 2 và Cơ Chế Gây Bệnh

Virus SARS-CoV-2, tác nhân gây ra đại dịch COVID-19, là một loại coronavirus mới. Virus này xâm nhập vào tế bào người thông qua protein gai (spike protein) liên kết với thụ thể ACE2 trên bề mặt tế bào. Sự liên kết này cho phép virus xâm nhập và nhân lên trong tế bào, gây ra các triệu chứng bệnh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng protein S của SARS-CoV-2 và SARS-CoV có mức độ tương đồng trình tự axit amin cao, khoảng 77%[6]. Điểm tương đồng này mở ra khả năng tồn tại các epitope phản ứng chéo, tạo tiền đề cho việc phát triển các kháng thể có khả năng trung hòa cả hai loại virus. Việc hiểu rõ cơ chế xâm nhập của virus là rất quan trọng để phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả.

1.2. Kháng Thể CB6 Ức Chế SARS CoV 2 Spike Protein

Kháng thể CB6 là một kháng thể đơn dòng (mAb) được phân lập từ bệnh nhân COVID-19 đã hồi phục. Nghiên cứu cho thấy CB6 có khả năng ức chế hiệu quả sự liên kết của vùng bám đặc hiệu thụ thể (RBD) trên protein gai của SARS-CoV-2 với thụ thể ACE2 trên tế bào người. CB6 cạnh tranh với ACE2 để gắn kết epitope trên RBD và cho thấy ái lực liên kết cao hơn 100 lần so với ACE2[12, 13]. Cơ chế tác động này giúp ngăn chặn virus xâm nhập vào tế bào và ngăn ngừa sự lây nhiễm.

II. Thách Thức Sản Xuất Kháng Thể CB6 Quy Mô Lớn Hiện Nay

Mặc dù kháng thể CB6 hứa hẹn là một phương pháp điều trị hiệu quả, việc sản xuất kháng thể này ở quy mô lớn vẫn còn nhiều thách thức. Các phương pháp sản xuất kháng thể truyền thống, như sử dụng tế bào động vật có vú (ví dụ: tế bào CHO), thường tốn kém và đòi hỏi quy trình phức tạp. Chi phí sản xuất cao có thể hạn chế khả năng tiếp cận của bệnh nhân với liệu pháp điều trị này. Ngoài ra, việc đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của kháng thể cũng là một vấn đề quan trọng cần được giải quyết. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch kháng thể là cần thiết để đạt được hiệu quả sản xuất cao nhất.

2.1. Chi Phí Cao Trong Sản Xuất Kháng Thể Đơn Dòng

Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng các phương pháp truyền thống, đặc biệt là sử dụng tế bào CHO, đòi hỏi chi phí đầu tư lớn cho cơ sở vật chất và trang thiết bị. Quá trình nuôi cấy tế bào CHO cũng phức tạp và tốn thời gian, làm tăng chi phí sản xuất. Giá thành cao của kháng thể có thể gây khó khăn cho việc cung cấp rộng rãi cho bệnh nhân.

2.2. Đảm Bảo Chất Lượng và Độ Tinh Khiết Kháng Thể

Chất lượng và độ tinh khiết của kháng thể là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Kháng thể cần phải có cấu trúc chính xác và không bị nhiễm các tạp chất. Việc kiểm soát chất lượng và đảm bảo độ tinh khiết cao trong quá trình sản xuất là một thách thức lớn, đòi hỏi các quy trình nghiêm ngặt và công nghệ tiên tiến.

2.3. Khó khăn trong quy trình up scale sản xuất Kháng thể CB6

Việc mở rộng quy mô sản xuất (up-scale) kháng thể CB6 từ phòng thí nghiệm lên quy mô công nghiệp gặp nhiều khó khăn. Các điều kiện nuôi cấy và quy trình tinh chế cần được tối ưu hóa để đảm bảo hiệu quả sản xuất và chất lượng sản phẩm ở quy mô lớn. Ngoài ra, việc đảm bảo tính ổn định của kháng thể trong quá trình bảo quản và vận chuyển cũng là một thách thức.

III. Phương Pháp Tạo Tế Bào E

Nghiên cứu này đề xuất một phương pháp thay thế để sản xuất kháng thể CB6 bằng cách sử dụng vi khuẩn E. coli. E. coli là một vi sinh vật dễ nuôi cấy, có tốc độ sinh trưởng nhanh và chi phí nuôi cấy thấp, làm cho nó trở thành một nền tảng sản xuất protein hấp dẫn. Phương pháp này bao gồm việc đưa gen mã hóa kháng thể CB6 vào E. coli thông qua vector biểu hiện, sau đó kích thích vi khuẩn sản xuất kháng thể. Quy trình này hứa hẹn mang lại hiệu quả kinh tế và khả năng mở rộng quy mô sản xuất dễ dàng hơn so với các phương pháp truyền thống.

3.1. Thiết Kế Vector Biểu Hiện Gen Kháng Thể CB6

Vector biểu hiện đóng vai trò quan trọng trong việc đưa gen mã hóa kháng thể CB6 vào E. coli và kích thích vi khuẩn sản xuất kháng thể. Vector này thường chứa các yếu tố điều khiển biểu hiện gen mạnh mẽ, như promoter và terminator, để đảm bảo hiệu quả biểu hiện cao. Việc lựa chọn vector phù hợp là rất quan trọng để đạt được năng suất sản xuất kháng thể tối ưu.

3.2. Biến Nạp và Chọn Lọc Dòng E. coli Biểu Hiện CB6

Sau khi thiết kế vector biểu hiện, gen mã hóa kháng thể CB6 được đưa vào E. coli thông qua quá trình biến nạp. Sau đó, các dòng E. coli mang gen kháng thể được chọn lọc dựa trên các marker kháng kháng sinh hoặc các phương pháp sàng lọc khác. Việc chọn lọc các dòng có khả năng biểu hiện kháng thể cao là bước quan trọng để tối ưu hóa năng suất sản xuất.

3.3. Tối ưu hóa các yếu tố để gia tăng sản xuất Kháng thể CB6

Để có thể tăng năng suất biểu hiện kháng thể CB6 cần tối ưu hóa các yếu tố như môi trường, thời gian, nhiệt độ nuôi cấy và nồng độ chất cảm ứng IPTG. Đồng thời việc tối ưu hóa quy trình thu hồi và tinh sạch protein sẽ giúp thu được lượng protein mục tiêu lớn nhất với độ tinh khiết cao nhất.

IV. Kết Quả Biểu Hiện Thành Công Kháng Thể CB6 Trong E

Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra dòng E. coli biểu hiện kháng thể CB6. Kết quả phân tích SDS-PAGE và Western Blot đã xác nhận sự biểu hiện của protein CB6 với kích thước và đặc tính mong muốn. Hơn nữa, các thử nghiệm in vitro đã chứng minh rằng kháng thể CB6 được sản xuất từ E. coli có khả năng ức chế virus SARS-CoV-2. Kết quả này cho thấy tiềm năng của phương pháp này trong việc sản xuất kháng thể điều trị COVID-19.

4.1. Xác Nhận Biểu Hiện Protein CB6 Bằng SDS PAGE và Western Blot

Phương pháp SDS-PAGE và Western Blot được sử dụng để xác nhận sự biểu hiện của protein CB6 trong E. coli. SDS-PAGE giúp xác định kích thước của protein, trong khi Western Blot sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện protein CB6. Kết quả cho thấy protein CB6 được biểu hiện với kích thước và đặc tính mong muốn.

4.2. Đánh Giá Khả Năng Ức Chế SARS CoV 2 In Vitro Của CB6

Các thử nghiệm in vitro được thực hiện để đánh giá khả năng ức chế virus SARS-CoV-2 của kháng thể CB6 được sản xuất từ E. coli. Kết quả cho thấy kháng thể có khả năng ức chế sự xâm nhập của virus vào tế bào. Kết quả kiểm tra, phân tích bằng SDS - PAGE và Western Blot đã xác nhận sự biểu hiện của protein CB6 với kích thước và đặc tính mong muốn. Khi thực hiện phản ứng trung hòa hòa SARS-CoV-2 của mẫu kháng thể CB6 được xác định bằng bộ kit trung hòa SARS-CoV-2 đã đạt hiệu quả ức chế là 46,5%.

V. Ứng Dụng Tiềm Năng Phát Triển Kháng Thể CB6 Điều Trị COVID 19

Việc tạo ra dòng E. coli biểu hiện kháng thể CB6 mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng trong điều trị và phòng ngừa COVID-19. Kháng thể CB6 có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị chủ động, giúp ngăn chặn sự lây nhiễm và giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ngoài ra, kháng thể này cũng có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit xét nghiệm nhanh, giúp phát hiện sớm virus và kiểm soát dịch bệnh. Sản xuất kháng thể CB6 bằng E. coli có thể giúp giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng tiếp cận của bệnh nhân với liệu pháp điều trị.

5.1. Phát Triển Liệu Pháp Điều Trị COVID 19 Chủ Động Bằng CB6

Kháng thể CB6 có thể được sử dụng để phát triển các liệu pháp điều trị chủ động, giúp ngăn chặn sự lây nhiễm và giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh COVID-19. Liệu pháp này có thể được sử dụng cho những người có nguy cơ cao mắc bệnh hoặc những người đã mắc bệnh. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn về hiệu quả và an toàn của kháng thể là cần thiết trước khi đưa vào sử dụng rộng rãi.

5.2. Ứng Dụng Kháng Thể CB6 Trong Phát Triển Bộ Kit Xét Nghiệm

Kháng thể CB6 có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit xét nghiệm nhanh, giúp phát hiện sớm virus SARS-CoV-2 và kiểm soát dịch bệnh. Các bộ kit này có thể được sử dụng tại nhà hoặc tại các cơ sở y tế, giúp tăng cường khả năng xét nghiệm và phát hiện bệnh sớm. Việc sản xuất kháng thể bằng E. coli có thể giúp giảm chi phí sản xuất bộ kit xét nghiệm.

VI. Kết Luận Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Kháng Thể CB6

Nghiên cứu này đã chứng minh tính khả thi của việc sử dụng E. coli để sản xuất kháng thể CB6 chống lại virus SARS-CoV-2. Phương pháp này hứa hẹn mang lại hiệu quả kinh tế và khả năng mở rộng quy mô sản xuất dễ dàng hơn so với các phương pháp truyền thống. Các nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất, cải thiện độ tinh khiết của kháng thể, và đánh giá hiệu quả của kháng thể in vivo. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của CB6 cũng rất quan trọng để phát triển các liệu pháp điều trị COVID-19 hiệu quả hơn.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Sản Xuất và Tinh Sạch CB6

Trong tương lai, cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình sản xuất và tinh sạch kháng thể CB6 từ E. coli. Các nghiên cứu có thể tập trung vào việc điều chỉnh các điều kiện nuôi cấy, sử dụng các phương pháp tinh sạch tiên tiến, và cải thiện độ ổn định của kháng thể. Việc tối ưu hóa quy trình sản xuất sẽ giúp tăng năng suất và giảm chi phí.

6.2. Đánh Giá Hiệu Quả Điều Trị In Vivo và Nghiên Cứu Cơ Chế CB6

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc đánh giá hiệu quả điều trị của kháng thể CB6 in vivo, sử dụng các mô hình động vật phù hợp. Việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của CB6 cũng rất quan trọng để phát triển các liệu pháp điều trị COVID-19 hiệu quả hơn. Ngoài ra, cần đánh giá tính an toàn và khả năng dung nạp của kháng thể trước khi đưa vào sử dụng trên người.

Tổng quan nghiên cứu

Đại dịch COVID-19 do virus SARS-CoV-2 gây ra đã dẫn đến hơn 6.503 người tử vong tính đến giữa năm 2022, tạo ra thách thức lớn cho y học và công nghệ sinh học toàn cầu. SARS-CoV-2 là virus RNA sợi đơn dương, có cấu trúc phức tạp với glycoprotein S đóng vai trò trung gian gắn vào thụ thể ACE2 trên tế bào người, qua đó xâm nhập và gây bệnh. Việc phát triển các kháng thể đơn dòng có khả năng trung hòa virus là một trong những hướng đi quan trọng nhằm phòng ngừa và điều trị COVID-19. Trong đó, kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 được đánh giá cao về khả năng ức chế sự liên kết của virus với thụ thể ACE2, với hiệu quả trung hòa đạt khoảng 46,5% trong nghiên cứu thực nghiệm.

Mục tiêu chính của luận văn là tạo dòng vi khuẩn E. coli biểu hiện gen mã hóa kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2, đồng thời đánh giá sơ bộ chất lượng và hoạt tính của kháng thể này. Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm tại Thành phố Hồ Chí Minh, từ tháng 6/2022 đến tháng 6/2023, nhằm cung cấp nền tảng khoa học cho việc sản xuất kháng thể tái tổ hợp phục vụ điều trị COVID-19. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa thực tiễn lớn trong việc phát triển thuốc ức chế virus SARS-CoV-2 với chi phí thấp và hiệu quả cao, góp phần vào công cuộc kiểm soát đại dịch.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên hai lý thuyết chính: lý thuyết về cấu trúc và chức năng của kháng thể đơn dòng, đặc biệt là kháng thể bán phần chuỗi đơn (single chain antibody - scFv), và lý thuyết về biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli. Kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 gồm vùng biến đổi của chuỗi nhẹ (VL) và chuỗi nặng (VH) nối với nhau bằng cầu nối peptide, có kích thước nhỏ (~27 kDa), giúp tăng khả năng xâm nhập mô và giảm chi phí sản xuất so với kháng thể hoàn chỉnh. Tuy nhiên, kháng thể này thiếu vùng Fc nên không kích hoạt được các hoạt tính miễn dịch như ADCC hay CDC, đồng thời có thời gian bán hủy ngắn hơn.

Mô hình biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli BL21 (DE3) sử dụng vector pNANOGEN với promoter T7 lac được cảm ứng bằng IPTG, cho phép kiểm soát biểu hiện gen CB6 hiệu quả. Việc tạo thể vùi trong tế bào chất E. coli là một thách thức trong biểu hiện protein, do đó các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, tốc độ lắc và chất cảm ứng được tối ưu để tăng năng suất và chất lượng protein CB6.

Các khái niệm chính bao gồm: kháng thể đơn dòng tái tổ hợp, vector biểu hiện pNANOGEN, biến nạp hóa học (chemical transformation), thể vùi (inclusion body), và kỹ thuật phân tích SDS-PAGE, Western Blot để xác định protein mục tiêu.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là chủng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) Star được biến nạp plasmid pNANOGEN chứa gen CB6 tổng hợp. Phương pháp nghiên cứu bao gồm:

• Tách chiết plasmid pUC57-CB6 và vector pNANOGEN, cắt mở vòng bằng enzyme NdeI và HindIII.
• Nối gen CB6 vào vector pNANOGEN và biến nạp vào E. coli Top 10F’ để tạo dòng lưu trữ.
• Kiểm tra sự hiện diện gen CB6 bằng PCR khuẩn lạc và giải trình tự DNA.
• Biến nạp plasmid pNANOGEN-CB6 vào E. coli BL21 (DE3) Star để biểu hiện protein.
• Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu: chất cảm ứng IPTG, tốc độ lắc (150, 200, 250 rpm), nhiệt độ (30°C, 37°C, 40°C).
• Nuôi cấy quy mô 5 lít để thu nhận protein CB6.
• Tách chiết, tinh sạch protein CB6 và kiểm tra bằng SDS-PAGE, Western Blot.
• Đánh giá hoạt tính trung hòa SARS-CoV-2 của kháng thể CB6 bằng bộ kit trung hòa virus.

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm nhiều lần nuôi cấy và kiểm tra biểu hiện protein, đảm bảo tính lặp lại và độ tin cậy. Phương pháp chọn mẫu là chọn các khuẩn lạc biểu hiện gen CB6 tốt nhất qua PCR và Western Blot. Timeline nghiên cứu kéo dài 12 tháng, từ tháng 6/2022 đến tháng 6/2023.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tạo dòng E. coli mang vector pNANOGEN-CB6 thành công: Gen CB6 được cắt mở và nối vào vector pNANOGEN, biến nạp vào E. coli Top 10F’ với hiệu suất cao. Kết quả PCR khuẩn lạc và giải trình tự DNA xác nhận trình tự gen CB6 chính xác, tương đồng 100% với trình tự lý thuyết.

2. Biểu hiện protein CB6 trong E. coli BL21 (DE3): Dòng vi khuẩn BL21 (DE3) mang plasmid pNANOGEN-CB6 được cảm ứng bằng IPTG biểu hiện protein CB6 với kích thước khoảng 27 kDa, được xác nhận qua SDS-PAGE và Western Blot. Mật độ tế bào và tốc độ lắc ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất biểu hiện, với tốc độ lắc 200 rpm và nhiệt độ 37°C là điều kiện tối ưu.

3. Nuôi cấy quy mô 5 lít thu nhận protein CB6: Ở quy mô phòng thí nghiệm, protein CB6 được thu nhận với nồng độ protein tổng số đạt khoảng 1,2 mg/L. SDS-PAGE và Western Blot cho thấy protein có đặc tính và kích thước phù hợp, đồng thời tinh sạch đạt độ tinh khiết cao.

4. Hoạt tính trung hòa SARS-CoV-2 của kháng thể CB6: Mẫu protein CB6 thu được có hiệu quả ức chế virus đạt 46,5% theo bộ kit trung hòa SARS-CoV-2, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị COVID-19.

Thảo luận kết quả

Kết quả tạo dòng E. coli biểu hiện kháng thể CB6 thành công phù hợp với các nghiên cứu trước đây về biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn. Việc sử dụng vector pNANOGEN với promoter T7 lac và cảm ứng IPTG giúp kiểm soát biểu hiện gen hiệu quả, giảm thiểu sự hình thành thể vùi không mong muốn. Điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định tương đồng với các nghiên cứu về biểu hiện protein trong E. coli, cho thấy tốc độ lắc và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào và năng suất protein.

Hoạt tính trung hòa virus đạt gần 50% là kết quả đáng khích lệ, tuy chưa đạt mức tối ưu nhưng đã chứng minh khả năng ứng dụng của kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 trong điều trị SARS-CoV-2. So với các kháng thể đơn dòng khác, CB6 có ưu điểm về kích thước nhỏ, dễ sản xuất với chi phí thấp hơn. Tuy nhiên, hạn chế về vùng Fc và thời gian bán hủy ngắn cần được khắc phục trong các nghiên cứu tiếp theo.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường cong tăng trưởng tế bào E. coli theo thời gian, biểu đồ so sánh hiệu quả biểu hiện protein ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau, và bảng tổng hợp kết quả hoạt tính trung hòa virus.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và cảm ứng: Thực hiện các thí nghiệm mở rộng để điều chỉnh nồng độ IPTG, nhiệt độ và tốc độ lắc nhằm tăng năng suất biểu hiện protein CB6, hướng đến mục tiêu tăng ít nhất 30% năng suất trong vòng 6 tháng. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm.

2. Phát triển quy trình tinh sạch protein hiệu quả hơn: Áp dụng các kỹ thuật tinh sạch nâng cao như sắc ký affinity hoặc sắc ký trao đổi ion để nâng cao độ tinh khiết và thu hồi protein, giảm tạp chất endotoxin, trong vòng 9 tháng. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm công nghệ sinh học.

3. Nghiên cứu cải tiến cấu trúc kháng thể CB6: Thiết kế và thử nghiệm các biến thể kháng thể CB6 có gắn thêm vùng Fc hoặc PEG hóa để kéo dài thời gian bán hủy và tăng hiệu quả miễn dịch, dự kiến trong 12 tháng tiếp theo. Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu công nghệ protein.

4. Thử nghiệm tiền lâm sàng và đánh giá hiệu quả điều trị: Tiến hành các thử nghiệm in vitro và in vivo trên mô hình động vật để đánh giá tính an toàn và hiệu quả của kháng thể CB6, chuẩn bị cho giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, trong vòng 18 tháng. Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm sinh học phân tử và đối tác y tế.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu công nghệ sinh học: Có thể ứng dụng phương pháp tạo dòng vi khuẩn biểu hiện protein tái tổ hợp, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và tinh sạch protein trong nghiên cứu phát triển thuốc sinh học.

2. Chuyên gia phát triển thuốc điều trị COVID-19: Tham khảo kết quả biểu hiện và hoạt tính kháng thể CB6 để phát triển các liệu pháp kháng thể đơn dòng mới, đặc biệt trong bối cảnh cần các giải pháp điều trị hiệu quả và chi phí hợp lý.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Áp dụng quy trình sản xuất protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli để sản xuất kháng thể bán phần chuỗi đơn, giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng thương mại hóa sản phẩm.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, y sinh: Nắm bắt kiến thức về kỹ thuật biểu hiện protein tái tổ hợp, phương pháp biến nạp, nuôi cấy vi khuẩn và phân tích protein, phục vụ cho nghiên cứu khoa học và học tập chuyên sâu.

Câu hỏi thường gặp

1. Kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 là gì?
   Kháng thể CB6 là kháng thể bán phần chuỗi đơn (scFv) gồm vùng biến đổi của chuỗi nhẹ và nặng nối với nhau bằng cầu nối peptide, có khả năng đặc hiệu gắn vào vùng RBD của protein S trên SARS-CoV-2, giúp ức chế sự xâm nhập của virus vào tế bào.

2. Tại sao chọn E. coli BL21 (DE3) để biểu hiện protein CB6?
   E. coli BL21 (DE3) có ưu điểm về tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, khả năng biểu hiện protein cao và có hệ thống promoter T7 lac cho phép kiểm soát biểu hiện gen hiệu quả, phù hợp cho sản xuất protein tái tổ hợp quy mô phòng thí nghiệm.

3. Làm thế nào để kiểm tra sự biểu hiện của protein CB6?
   Protein CB6 được kiểm tra bằng kỹ thuật SDS-PAGE để xác định kích thước và Western Blot để xác nhận đặc tính kháng thể, đảm bảo protein biểu hiện đúng kích thước và có tính đặc hiệu với kháng nguyên SARS-CoV-2.

4. Hiệu quả trung hòa virus của kháng thể CB6 đạt bao nhiêu?
   Theo kết quả nghiên cứu, kháng thể CB6 biểu hiện từ E. coli có hiệu quả ức chế trung hòa SARS-CoV-2 đạt khoảng 46,5%, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị COVID-19.

5. Những hạn chế của kháng thể bán phần chuỗi đơn là gì?
   Kháng thể scFv thiếu vùng Fc nên không kích hoạt được các hoạt tính miễn dịch như ADCC và CDC, đồng thời có thời gian bán hủy ngắn hơn kháng thể hoàn chỉnh, đòi hỏi sử dụng liều cao hoặc cải tiến cấu trúc để tăng hiệu quả điều trị.

Kết luận

• Đã tạo thành công dòng vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) mang vector pNANOGEN-CB6 biểu hiện protein kháng thể bán phần chuỗi đơn CB6 kháng SARS-CoV-2.
• Protein CB6 được biểu hiện, tách chiết và tinh sạch với kích thước và đặc tính phù hợp, xác nhận bằng SDS-PAGE và Western Blot.
• Hoạt tính trung hòa SARS-CoV-2 của kháng thể CB6 đạt hiệu quả 46,5%, mở ra triển vọng ứng dụng trong điều trị COVID-19.
• Nghiên cứu cung cấp nền tảng khoa học và kỹ thuật cho sản xuất kháng thể tái tổ hợp trong vi khuẩn với chi phí thấp và hiệu quả cao.
• Các bước tiếp theo bao gồm tối ưu hóa quy trình nuôi cấy, cải tiến cấu trúc kháng thể và thử nghiệm tiền lâm sàng để phát triển sản phẩm điều trị hoàn chỉnh.

Để tiếp tục phát triển nghiên cứu, các nhà khoa học và doanh nghiệp được khuyến khích áp dụng quy trình và kết quả này nhằm thúc đẩy sản xuất kháng thể tái tổ hợp phục vụ phòng chống đại dịch COVID-19.