Tổng quan luận án

Đề tài luận án tiến sĩ hóa học "Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh thuộc nhóm fluoroquinolon trong mẫu huyết tương và nước tiểu" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Diệp, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Xuân Trường và GS. Trần Tứ Hiếu tại Viện Kỹ thuật Hóa học, Đại học Bách khoa Hà Nội (năm 2023, chuyên ngành Hóa học, mã số: 9440112).

Fluoroquinolon (FQL) là nhóm kháng sinh tổng hợp phổ rộng, có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đối với nhiều vi sinh vật Gram-âm và Gram-dương gây bệnh nặng ở đường hô hấp, tiết niệu, tiêu hóa, da và mô mềm. Cơ chế tác dụng chính là ức chế enzym ADN gyrase và topoisomerase IV, cản trở sao chép ADN và tác động lên mARN làm ngừng tổng hợp protein của vi khuẩn. Trong điều trị lâm sàng, việc sử dụng mức liều chuẩn có thể dẫn đến hiện tượng cá thể hóa nồng độ: phơi nhiễm quá mức gây tác dụng phụ nguy hiểm (như nguy cơ gây đột biến gen, độc tính trên gân khớp, chống chỉ định cho phụ nữ mang thai) hoặc không đạt nồng độ điều trị tối thiểu tại ổ nhiễm khuẩn, dẫn đến kháng thuốc hoặc thất bại điều trị. Việc giám sát nồng độ thuốc trong dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu) đóng vai trò then chốt trong hiệu chỉnh liều và đánh giá dược động học.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định: Tại thời điểm nghiên cứu, moxifloxacin (kháng sinh FQL thế hệ 4) chưa có chuyên luận phân tích trong Dược điển Việt Nam và chưa có công trình nào tại Việt Nam công bố quy trình định lượng hoạt chất này trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA hoặc quang phổ huỳnh quang (FLS). Đồng thời, chưa có quy trình phân tích đồng thời 4 kháng sinh FQL phổ biến thuộc các thế hệ 2, 3 và 4 (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trên cùng một hệ thống phân tích HPLC-FLD phù hợp với điều kiện trang thiết bị thực tế tại Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu: Phát triển các phương pháp phân tích định lượng kháng sinh fluoroquinolon trong nền mẫu dịch sinh học (huyết tương và nước tiểu) bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector mảng diot quang (HPLC-PDA) và detector huỳnh quang (HPLC-FLD).

Luận án đặt ra 3 mục tiêu kết quả cụ thể:

  1. Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA.
  2. Xây dựng quy trình xác định hàm lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp FLS (sử dụng hệ phức Europi kết hợp chất hoạt động bề mặt tạo mixen).
  3. Xây dựng quy trình xác định đồng thời bốn fluoroquinolon (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin) trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC-FLD hai kênh bước sóng.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: 4 kháng sinh nhóm fluoroquinolon gồm norfloxacin (NOR), ciprofloxacin (CIP), levofloxacin (LEVO) và moxifloxacin (MOXI).
  • Đối tượng phân tích: Nền mẫu dịch sinh học gồm huyết tương và nước tiểu (mẫu trắng từ người khỏe mạnh, mẫu thử tự tạo thêm chuẩn và mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh nhân sau 1, 2 và 3 giờ sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox chứa MOXI).
  • Phạm vi không gian thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích - Viện Kỹ thuật Hóa học (Đại học Bách khoa Hà Nội), Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN), Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ Dược (Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ), phối hợp thu thập mẫu bệnh phẩm lưu tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân Y 108 (Hà Nội).

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu và phương pháp phân tích nhóm quinolon và fluoroquinolon:

  1. Phương pháp tiêu chuẩn trong Dược điển:

    • Dược điển Việt Nam V quy định định lượng LEVO bằng HPLC-UV ($\lambda = 360$ nm) trên cột RP-C18 với pha động MeOH-đệm amoni acetat/đồng sulfat/L-isoleucin; định lượng NOR bằng phương pháp chuẩn độ điện thế với dung dịch $HClO_4$ 0,1N trong acid acetic khan; định lượng CIP bằng HPLC-UV ($\lambda = 278$ nm) với pha động ACN-acid phosphoric 0,245% (pH 3,0 điều chỉnh bằng triethylamin).
    • Dược điển Mỹ (USP 43) quy định định lượng MOXI trong chế phẩm bằng LC-UV ($\lambda = 293$ nm), cột L11, pha động chứa đệm tetrabutylammonium hydrogen sulfat/monobasic kali phosphat/acid phosphoric và methanol (72:28, v/v).

  2. Phương pháp điện hóa và điện di mao quản:

    • Các nghiên cứu của Silvina Kergaravat và cộng sự (2018) phát triển phương pháp von-ampe hòa tan trên điện cực màng Bitmut (BiFE) xác định MOXI và CIP; Jaber và cộng sự xác định enrofloxacin trên điện cực giọt thủy ngân tĩnh (HMDE) qua trung gian Cu(II); Radi và cộng sự xác định LEVO trong nước tiểu bằng von-ampe hòa tan hấp phụ anot trên điện cực glassy carbon; Yongnian Ni và cộng sự phân tích đồng thời OFL, NOR, CIP trong đệm Britton-Robinson (pH 3,78).
    • Các kỹ thuật điện di mao quản (CZE, MECC) được nghiên cứu bởi Zhou và cộng sự (dùng hydroxypropyl-$\beta$-cyclodextrin), Cho và cộng sự (dùng acid (+)-(18-crown-6)-tetracarboxylic và EDTA), Yu và cộng sự (dùng DM-$\beta$-CD), Horimai và cộng sự (dùng phức $\gamma$-CD-D-Phe-Zn(II)).

  3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS, LC-MS/MS):

    • Trần Thanh Trúc và cộng sự phân tích 8 quinolon trong thủy sản và thịt bằng LC-microQTOF; Cao Công Khánh và cộng sự định lượng đồng thời 14 quinolon bằng LC-MS/MS chế độ ESI(+) sử dụng thuốc thử cặp ion IPCC-MS3; các nghiên cứu tại Rio de Janeiro (Brazil) xử lý mẫu thức ăn trẻ em bằng kỹ thuật QuEChERS và phân tích 8 quinolon trên LC-MS/MS theo Quyết định 2002/657/EC của EURL.

  4. Phương pháp HPLC và quang phổ huỳnh quang trong dịch sinh học:

    • Nghiên cứu của Li Ming Du và cộng sự (2004) phát triển định lượng FQL qua phản ứng dịch chuyển điện tử với acid cloranilic (CL) và 7,7,8,8-tetracyanoquinodimetan (TCNQ), hoặc tạo phức với ion Europi ($Eu^{3+}$) kết hợp chất hoạt động bề mặt SDS/SDBS tạo mixen làm tăng cường độ huỳnh quang từ 15 đến 90 lần.
    • Các nghiên cứu xử lý mẫu dịch sinh học bằng kết tủa protein (PP) với ACN, MeOH, TCA, $HClO_4$; chiết lỏng - lỏng (LLE) bằng dichloromethane, chloroform, ethyl acetate; chiết pha rắn (SPE) trên cột silica pha đảo hoặc polymer hấp phụ pha đảo.
    • Các khảo sát tối ưu hóa pha động HPLC nhằm khắc phục hiện tượng kéo đuôi pic do tương tác của nhóm amin trong FQL với silanol tự do trên pha tĩnh silica: Nguyen và cộng sự dùng tetrabutylammonium bromide (TBAB); Gonzalez và cộng sự dùng n-octylamin; Liang và cộng sự dùng tetrabutylammonium acetate (TBAA) và SDS; Nemutlu và cộng sự dùng tetramethylammonium bromide (TMAB); Chamseddin và cộng sự khảo sát kích thước hạt cột pha đảo C18 (5 µm, 3 µm, 2,4 µm).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết:

  • Phát triển quy trình phân tích MOXI trong huyết tương trên thiết bị HPLC-PDA và phương pháp phổ huỳnh quang phân tử tạo phức mixen $Eu^{3+}$-MOXI-SDBS, bù đắp khoảng trống dữ liệu phân tích hoạt chất này tại Việt Nam.
  • Thiết lập quy trình HPLC-FLD hai kênh bước sóng cho phép định lượng đồng thời 4 kháng sinh FQL thuộc các thế hệ khác nhau trong cùng một điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu tối ưu hóa, đảm bảo độ nhạy, độ chọn lọc và tính khả thi trong điều kiện phòng thí nghiệm trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và đặc tính hóa lý của các chất phân tích

Nhóm fluoroquinolon có cấu trúc cơ bản gồm nhân quinolin hoặc naphthyridin, nhóm keto tại C-4 và nhóm carboxylic tại C-3 tạo tính acid. Nhóm thế piperazinyl hoặc pyrrolidinyl tại C-7 chứa các nguyên tử nitơ mang cặp electron tự do tạo tính base. Do đó, FQL là các chất lưỡng tính (zwitterion) với hai hằng số phân ly acid ($pKa_1$ và $pKa_2$). Tùy thuộc vào giá trị pH môi trường, FQL tồn tại ở 3 dạng cân bằng: cation ($pH < pKa_1$), ion lưỡng cực ($pKa_1 < pH < pKa_2$) và anion ($pH > pKa_2$).

Hoạt chất Công thức phân tử Khối lượng phân tử (g/mol) $pKa_1$ (acid) $pKa_2$ (base) Đặc điểm cấu trúc / Tính chất
Norfloxacin (NOR) $C_{16}H_{18}FN_3O_3$ 319,33 6,34 (hoặc 6,05) 8,75 (hoặc 8,51) Thế hệ 2; nhân quinolin, nhóm 1-ethyl, 7-piperazinyl. Độ tan tăng khi pH < 5 hoặc pH > 10.
Ciprofloxacin (CIP) $C_{17}H_{18}FN_3O_3$ 331,34 5,76 (hoặc 6,16) 8,68 (hoặc 8,62) Thế hệ 2; nhân quinolin, nhóm 1-cyclopropyl, 7-piperazinyl. Tan trong nước 36 mg/mL (25°C).
Levofloxacin (LEVO) $C_{18}H_{20}FN_3O_4$ 361,37 5,59 (hoặc 6,00) 7,94 (hoặc 8,60) Thế hệ 3; đồng phân quay trái S-(-) của ofloxacin; cấu trúc vòng oxazin gắn liền nhân quinolin.
Moxifloxacin (MOXI) $C_{21}H_{24}FN_3O_4$ 401,43 6,25 (hoặc 6,20) 9,29 (hoặc 9,14) Thế hệ 4; nhóm 8-methoxy làm giảm độc tính quang học, nhóm 7-diazabicyclononyl.

Đặc tính quang học của FQL bắt nguồn từ hệ electron $\pi$ liên hợp trong vòng thơm. Cường độ hấp thụ và huỳnh quang phụ thuộc mạnh vào trạng thái ion hóa và dung môi. Trong môi trường trung tính và acid yếu, dạng cation và ion lưỡng cực phát huỳnh quang mạnh, trong khi dạng anion phát xạ yếu. Moxifloxacin có khả năng tạo phức càng cua với ion kim loại đất hiếm Europi ($Eu^{3+}$); khi bổ sung chất hoạt động bề mặt anion Natri dodecyl benzen sulfonat (SDBS), các cấu trúc mixen hình thành giúp bao bọc phức chất, hạn chế quá trình tắt huỳnh quang do va chạm dung môi, làm tăng mạnh cường độ phát xạ huỳnh quang tại bước sóng đặc trưng.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  1. Hệ thống thiết bị phân tích:

    • Hệ thống HPLC-PDA Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD-M10vp; cột sắc ký MRC-ODS C18 ($250 \times 4,5$ mm, 5 µm).
    • Thiết bị sắc ký HPLC Shimadzu Auto sampler SIL-20AC XR, detector huỳnh quang RF-20A, lò cột CTO-10AS; cột sắc ký YMC-pack ODS-A C18 ($150 \times 4,6$ mm, 5 µm) và SUPELCO C18 ($250 \times 4,6$ mm, 5 µm).
    • Máy quang phổ huỳnh quang Nanolog (Horiba, Hoa Kỳ) trang bị đèn Xenon 450 W và bộ đơn sắc kép; máy đo huỳnh quang Brolight 6102; máy quang phổ UV-Vis Agilent 8453.
    • Thiết bị phụ trợ: Máy ly tâm MRC Scientific Instrument, máy đo pH HANNA, cân phân tích Shimadzu AUW220D (độ chính xác 0,00001 g), máy lắc Vortex ZX-Classic, máy rung siêu âm BRANSONIC, thiết bị cô quay chân không BÜCHI.

  2. Hóa chất và chất chuẩn:

    • Chất chuẩn đối chiếu từ Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh: Moxifloxacin hydrochlorid (độ tinh khiết 97,0%), Levofloxacin (98,2%), Norfloxacin (99,54%), Ciprofloxacin hydrochlorid (98,3%).
    • Hóa chất: $Eu_2O_3$, SDBS, $KH_2PO_4$, $H_3PO_4$, $CH_3COONH_4$, $CH_3COOH$, HCOOH, HCl, Triethylamin (TEA), $CH_2Cl_2$, $CHCl_3$, ethyl acetate; dung môi HPLC gồm Acetonitril (ACN), Methanol (MeOH) và nước cất 2 lần.

  3. Phương pháp xử lý mẫu dịch sinh học:

    • Xử lý mẫu huyết tương: Khảo sát phương pháp kết tủa protein (PP) bằng dung môi hữu cơ (MeOH, ACN) và acid trichloroacetic (TCA 20%). Máu toàn phần chống đông bằng EDTA được ly tâm tách huyết tương, bảo quản ở -20°C, rã đông trước khi phân tích.
    • Xử lý mẫu nước tiểu: Khảo sát phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) với các hệ dung môi hữu cơ ($CH_2Cl_2$, $CHCl_3$, ethyl acetate) và phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên cột pha đảo C18.

  4. Đánh giá độ tin cậy phương pháp:

    • Thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn của ICH và AOAC: độ đặc hiệu/chọn lọc, khoảng tuyến tính và hệ số tương quan ($R^2$), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL), giới hạn định lượng của phương pháp (MQL), độ đúng (hiệu suất thu hồi qua phương pháp thêm chuẩn), độ chính xác (độ lặp lại RSD%).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày tổng quan lý thuyết và thực tiễn về nhóm kháng sinh fluoroquinolon:

  • Lịch sử phát triển từ acid nalidixic (1962) đến các dẫn xuất fluoroquinolon thế hệ 2, 3 và 4; phân loại theo phổ kháng khuẩn, chỉ định lâm sàng và cấu trúc hóa học nhân quinolin/naphthyridon.
  • Cơ chế tác dụng sinh học: ức chế enzym ADN gyrase và topoisomerase IV dẫn đến ức chế tổng hợp acid nucleic và protein của vi khuẩn.
  • Tổng quan dược động học của NOR, CIP, LEVO và MOXI trong cơ thể người: các thông số hấp thu, sinh khả dụng ($F \approx 90%$ với MOXI, $99%$ với LEVO, $70-80%$ với CIP), thể tích phân bố ($V_d$), tỷ lệ liên kết protein huyết tương, con đường thải trừ qua thận và bài tiết mật/phân, khoảng nồng độ trị liệu trong huyết tương và nước tiểu sau khi dùng các liều chuẩn.
  • Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp phân tích: phương pháp Dược điển, phương pháp điện hóa (cực phổ, von-ampe hòa tan), điện di mao quản (CZE, MECC), LC-MS/MS, HPLC-UV/PDA/FLD và phương pháp quang phổ huỳnh quang.
  • Phân tích sâu các yếu tố ảnh hưởng trong sắc ký pha đảo FQL: sự tồn tại đa dạng điện tích (cation, zwitterion, anion), tương tác phụ giữa nhóm amin của FQL và nhóm silanol tự do trên bề mặt hạt mang silica gây biến dạng, doãng rộng và kéo đuôi pic. Luận án tổng kết giải pháp kiểm soát pH pha động trong vùng acid (pH 2,0 - 4,0) và bổ sung chất phụ gia phân cực/cặp ion (đệm phosphat, acid phosphoric, triethylamin, alkylammonium).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, hóa chất, thiết bị và các bước xây dựng phương pháp:

  • Tiêu chuẩn hóa 4 chất chuẩn FQL (MOXI, LEVO, NOR, CIP) và chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc (500 µg/mL và 1000 µg/mL).
  • Thu thập, xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu bệnh phẩm huyết tương (sau 1, 2, 3 giờ tiêm truyền Avelox tại Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Quân Y 108) và mẫu nước tiểu.
  • Thiết lập quy trình tối ưu hóa đơn biến các điều kiện sắc ký HPLC-PDA cho MOXI: quét phổ UV-Vis xác định cực đại hấp thụ ($\lambda = 295$ nm), lựa chọn thành phần pha động (ACN/MeOH và đệm phosphat), khảo sát pH (2,0 - 5,0), nồng độ đệm (10, 20, 50 mM) và tốc độ dòng (0,6 - 1,5 mL/phút).
  • Thiết lập điều kiện phản ứng tạo phức huỳnh quang $Eu^{3+}$-MOXI-SDBS trên hệ FLS: khảo sát tỷ lệ nồng độ $Eu^{3+}$, nồng độ chất hoạt động bề mặt SDBS, khoảng pH tối ưu và thời gian phản ứng.
  • Thiết lập quy trình sắc ký gradient pha động và lựa chọn 2 cặp bước sóng kích thích/phát xạ trên hệ thống HPLC-FLD: $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 290/500$ nm (cho LEVO và MOXI) và $\lambda_{ex}/\lambda_{em} = 280/445$ nm (cho NOR và CIP).
  • Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương (kết tủa protein bằng MeOH và TCA 20%) và mẫu nước tiểu (chiết lỏng - lỏng LLE và chiết pha rắn SPE trên cột C18).

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 tập trung vào kết quả khảo sát, tối ưu hóa điều kiện thực nghiệm, thẩm định phương pháp và ứng dụng trên mẫu thực qua 3 quy trình phân tích:

1. Quy trình phân tích moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA

  • Điều kiện sắc ký tối ưu: Cột MRC-ODS C18 ($250 \times 4,5$ mm, 5 µm); bước sóng phát hiện $\lambda = 295$ nm; pha động ACN: đệm phosphat 20 mM (pH = 3,5) với tỷ lệ 60:40 (v/v); tốc độ dòng 1,0 mL/phút; nhiệt độ lò cột 30°C; chế độ rửa giải đẳng dòng. Pic MOXI thu được cân đối, không bị nhiễu bởi nền mẫu.
  • Xử lý mẫu huyết tương: So sánh hiệu suất thu hồi giữa kết tủa protein bằng TCA 20% và MeOH. Quy trình kết tủa bằng TCA 20% cho dung dịch dịch nổi trong, loại bỏ protein hoàn toàn và cho hiệu suất thu hồi ổn định.
  • Thẩm định phương pháp:
    • Đường chuẩn thiết lập trong khoảng nồng độ tuyến tính từ 0,10 đến 15,0 µg/mL với hệ số tương quan $R^2 > 0,999$.
    • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đạt yêu cầu phân tích vết trong huyết tương.
    • Độ đúng (hiệu suất thu hồi) đạt trên 95%; độ lặp lại có độ lệch chuẩn tương đối $RSD < 5%$ ($n=5$).
  • Ứng dụng mẫu thực: Phân tích thành công mẫu huyết tương của bệnh nhân điều trị thuốc tiêm truyền Avelox tại các thời điểm 1, 2 và 3 giờ sau truyền.

2. Quy trình định lượng moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS)

  • Tối ưu hóa phản ứng tạo phức và tăng cường huỳnh quang:
    • MOXI tạo phức bền với ion đất hiếm Europi ($Eu^{3+}$) nồng độ $10^{-3}$ M theo tỷ lệ thích hợp.
    • Bổ sung chất hoạt động bề mặt anion SDBS giúp hình thành môi trường mixen, bảo vệ phức $Eu^{3+}$-MOXI khỏi các tác nhân dập tắt huỳnh quang trong dung dịch nước, làm tăng cường độ huỳnh quang lên nhiều lần.
    • Khảo sát xác định pH tối ưu cho phản ứng tạo phức, nồng độ $Eu^{3+}$, nồng độ SDBS và thời gian ổn định tín hiệu huỳnh quang.
  • Thẩm định và ứng dụng:
    • Cường độ huỳnh quang tỷ lệ tuyến tính với nồng độ MOXI trong khoảng nồng độ thấp, độ nhạy cao.
    • Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ thấp hơn so với phương pháp HPLC-PDA.
    • Hiệu suất thu hồi đạt từ 96% đến 102%, độ lặp lại $RSD < 3%$.
    • Ứng dụng phân tích định lượng MOXI trong mẫu huyết tương bệnh nhân cho kết quả tương đồng với phương pháp sắc ký.

3. Quy trình định lượng đồng thời bốn fluoroquinolon trong huyết tương và nước tiểu bằng phương pháp HPLC-FLD

  • Tối ưu hóa điều kiện sắc ký HPLC-FLD:
    • Cột sắc ký pha đảo C18 ($150 \times 4,6$ mm hoặc $250 \times 4,6$ mm, 5 µm).
    • Pha động gồm kênh hữu cơ (MeOH) và kênh nước chứa $H_3PO_4$ 0,025 M (hoặc đệm phosphat pH 2,5 - 3,5), rửa giải theo chương trình gradient nồng độ MeOH nhằm phân tách hoàn toàn 4 pic chất NOR, CIP, LEVO, MOXI trong thời gian phân tích hợp lý.
    • Khảo sát nhiệt độ lò cột và tốc độ dòng đảm bảo độ phân giải giữa các pic lân cận $> 1,5$.
  • Thiết lập detector huỳnh quang 2 kênh bước sóng:
    • Kênh 1: $\lambda_{ex} = 290$ nm, $\lambda_{em} = 500$ nm (tối ưu hóa cho LEVO và MOXI).
    • Kênh 2: $\lambda_{ex} = 280$ nm, $\lambda_{em} = 445$ nm (tối ưu hóa cho NOR và CIP).
    • Việc chuyển kênh bước sóng theo thời gian rửa giải cho phép ghi nhận tín hiệu huỳnh quang cực đại cho từng hoạt chất, loại bỏ nhiễu nền và nâng cao độ chọn lọc.
  • Xử lý mẫu huyết tương và nước tiểu:
    • Mẫu huyết tương: Khảo sát quy trình kết tủa protein bằng MeOH và TCA 20%, xây dựng đường thêm chuẩn đánh giá hiệu suất thu hồi cho cả 4 hoạt chất.
    • Mẫu nước tiểu: Khảo sát phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) với các dung môi hữu cơ và chiết pha rắn (SPE) trên cột C18; khảo sát thể tích dung môi chiết, tỷ lệ và thời gian lắc chiết. Cả hai quy trình LLE và SPE đều cho hiệu suất thu hồi cao và loại bỏ triệt để các tạp chất nội sinh trong nước tiểu.
  • Kết quả thẩm định phương pháp:
    • Khoảng tuyến tính, phương trình đường chuẩn và hệ số hồi quy $R^2$ của 4 FQL đều đạt độ tương quan cao ($R^2 > 0,999$).
    • Giá trị LOD, LOQ, MDL, MQL của từng chất được xác định cụ thể trong nền mẫu huyết tương và nước tiểu.
    • Hiệu suất thu hồi của 4 chất ở các mức nồng độ khảo sát (1,0; 5,0; 10,0 µg/mL) đều đạt từ 85% đến 105%.
    • Độ lặp lại của phương pháp ($n=6$) tại các mức nồng độ đều có $RSD < 5%$.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt khoa học (lý luận)

  • Xây dựng thành công quy trình phân tích định lượng kháng sinh moxifloxacin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC-PDA và phương pháp quang phổ huỳnh quang phân tử (FLS). Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam công bố quy trình định lượng moxifloxacin trong huyết tương người.
  • Khám phá và ứng dụng thành công hiệu ứng tăng cường huỳnh quang của phức chất $Eu^{3+}$-MOXI trong môi trường mixen tạo bởi chất hoạt động bề mặt SDBS, nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện khi phân tích moxifloxacin trong nền mẫu sinh học phức tạp.
  • Phát triển phương pháp HPLC-FLD hai kênh bước sóng phát hiện đồng thời 4 kháng sinh fluoroquinolon thuộc 3 thế hệ (thế hệ 2: NOR, CIP; thế hệ 3: LEVO; thế hệ 4: MOXI). Việc tối ưu hóa 2 cặp bước sóng kích thích/phát xạ tương ứng từng nhóm chất đã giải quyết triệt để sự khác biệt về đặc tính quang học và tính chất acid-base của các dẫn xuất FQL.

Đóng góp về mặt thực tiễn

  • Cung cấp các quy trình phân tích hoàn chỉnh, độ tin cậy cao, quy trình xử lý mẫu đơn giản (kết tủa protein bằng TCA/MeOH, chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn), sử dụng hóa chất và trang thiết bị sắc ký phổ biến, dễ triển khai tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm và cơ sở y tế tại Việt Nam.
  • Quy trình phân tích đồng thời 4 FQL cho phép định lượng nhanh mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân đang sử dụng các phác đồ kháng sinh FQL khác nhau trong cùng một điều kiện sắc ký, tiết kiệm thời gian và chi phí.
  • Kết quả thử nghiệm trên mẫu huyết tương bệnh nhân dùng thuốc Avelox (tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Quân Y 108) chứng minh tính ứng dụng thực tế của phương pháp trong hỗ trợ giám sát nồng độ thuốc trong điều trị (TDM), đánh giá tương đương sinh học và nghiên cứu dược động học lâm sàng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế:

    • Luận án tập trung khảo sát 4 kháng sinh FQL chính (norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin), chưa mở rộng trên toàn bộ các hợp chất khác trong nhóm quinolon/fluoroquinolon.
    • Mẫu bệnh phẩm thực tế mới được thử nghiệm với đơn kháng sinh moxifloxacin trên nhóm bệnh nhân sử dụng thuốc tiêm truyền Avelox tại hai bệnh viện, chưa mở rộng thu thập mẫu lâm sàng đa trung tâm đối với cả 4 kháng sinh cùng lúc.
    • Nghiên cứu tập trung vào dạng thuốc nguyên vẹn chưa chuyển hóa, chưa tích hợp định lượng đồng thời các chất chuyển hóa chính của FQL trong dịch sinh học.

  • Hướng nghiên cứu tiếp:

    • Mở rộng thẩm định và áp dụng quy trình HPLC-FLD hai kênh trên các cỡ mẫu lâm sàng lớn hơn phục vụ trực tiếp cho hoạt động giám sát nồng độ trị liệu (TDM) thường quy tại các bệnh viện.
    • Nghiên cứu phát triển quy trình phân tích đồng thời các dạng FQL nguyên vẹn và các chất chuyển hóa trong các loại dịch sinh học khác (dịch mật, dịch phế quản, nước bọt).

Giá trị tham khảo

  • Đối với nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa dược và Dược học: Luận án là tài liệu tham khảo chi tiết về cơ sở lý thuyết sắc ký pha đảo cho các hợp chất lưỡng tính, kỹ thuật kiểm soát tương tác silanol tự do, cơ chế phát quang của phức chất kim loại đất hiếm trong môi trường mixen và phương pháp thẩm định quy trình phân tích theo tiêu chuẩn quốc tế.
  • Đối với kiểm nghiệm viên và nhà khoa học phân tích: Cung cấp thông số thực nghiệm chuẩn xác về điều kiện chạy sắc ký, thành phần pha động, chương trình gradient, kỹ thuật kết tủa protein và chiết xuất mẫu sinh học (PP, LLE, SPE).
  • Đối với dược sĩ lâm sàng, bác sĩ và nhà quản lý y tế: Cung cấp công cụ kỹ thuật tin cậy để triển khai theo dõi nồng độ thuốc trong huyết tương và nước tiểu, phục vụ cá thể hóa liều dùng kháng sinh, hạn chế tình trạng kháng thuốc và giảm thiểu độc tính điều trị.

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao việc định lượng kháng sinh fluoroquinolon trong huyết tương và nước tiểu lại cần thiết trong điều trị lâm sàng?

Khi sử dụng liều chuẩn, sự biến thiên dược động học giữa các cá thể có thể dẫn đến nồng độ thuốc trong máu quá cao gây phơi nhiễm độc tính (nguy cơ đột biến gen, biến chứng cơ xương khớp, sẩy thai) hoặc nồng độ thuốc tại vị trí nhiễm khuẩn không đạt ngưỡng ức chế tối thiểu (MIC), gây thất bại điều trị và gia tăng nguy cơ kháng kháng sinh. Định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương và nước tiểu giúp bác sĩ theo dõi dược động học và điều chỉnh liều lượng tối ưu cho từng bệnh nhân.

2. Phương pháp quang phổ huỳnh quang (FLS) định lượng moxifloxacin trong luận án sử dụng nguyên lý gì để tăng độ nhạy?

Phương pháp dựa trên phản ứng tạo phức huỳnh quang giữa moxifloxacin với ion kim loại đất hiếm Europi ($Eu^{3+}$). Để tăng cường độ phát xạ và ổn định tín hiệu, tác giả bổ sung chất hoạt động bề mặt anion Natri dodecyl benzen sulfonat (SDBS). Sự hình thành cấu trúc mixen bao quanh phức $Eu^{3+}$-MOXI giúp ngăn chặn quá trình dập tắt huỳnh quang do va chạm phân tử dung môi, làm tăng mạnh cường độ huỳnh quang, từ đó hạ thấp giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).

3. Detector huỳnh quang hai kênh bước sóng trong phương pháp HPLC-FLD được thiết lập như thế nào để tách đồng thời 4 kháng sinh FQL?

Hệ thống HPLC-FLD được lập trình chuyển đổi hai cặp bước sóng kích thích/phát xạ ($\lambda_{ex}/\lambda_{em}$) theo thời gian lưu của từng chất:

  • Cặp 1: $\lambda_{ex} = 290$ nm và $\lambda_{em} = 500$ nm để phát hiện tín hiệu huỳnh quang cực đại của levofloxacin (LEVO) và moxifloxacin (MOXI).
  • Cặp 2: $\lambda_{ex} = 280$ nm và $\lambda_{em} = 445$ nm để phát hiện tín hiệu huỳnh quang cực đại của norfloxacin (NOR) và ciprofloxacin (CIP).

4. Những kỹ thuật xử lý mẫu nào đã được khảo sát và áp dụng cho mẫu huyết tương và nước tiểu?

Đối với mẫu huyết tương, luận án khảo sát phương pháp kết tủa protein (PP) bằng dung môi hữu cơ (MeOH, ACN) và acid trichloroacetic (TCA 20%), trong đó TCA 20% và MeOH cho hiệu suất thu hồi cao và dịch chiết sạch. Đối với mẫu nước tiểu, luận án khảo sát và