CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Staphylococcus aureus (SA) hay còn gọi là vi khuẩn tụ cầu vàng một loại vi khuẩn gây bệnh và là nguyên nhân phổ biến của bệnh nhiễm trùng tụ cầu khuẩn. Nghiên cứu của các tạp chí chuyên ngành cho thấy rằng khoảng 50% loài người có mang SA trên cơ thể, và việc cơ thể có mang SA có liên quan với việc tăng nguy cơ nhiễm tụ cầu khuẩn.35,107 Các triệu chứng của nhiễm trùng SA bao gồm lở loét, mụn mủ, nhọt, viêm phổi, và nhiễm trùng sau phẫu thuật là một vấn đề nghiêm trọng tại các bệnh viện. Alexander Fleming (1881 – 1955) là một bác sĩ, nhà sinh học và đồng thời là một nhà dược lý học người Scotland. Ông được coi là người mở ra kỉ nguyên sử dụng kháng sinh trong y học.
Ông đã được trao giải thưởng Nobel về y học năm 1945 cùng với Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey về việc tìm ra và phân tách được penicilin – được coi là loại kháng sinh đầu tiên trong việc điều trị những bệnh nhiễm trùng. Từ năm 1942 bệnh nhiễm trùng tụ cầu khuẩn có thể được chữa khỏi bằng thuốc kháng sinh penicillin, tuy nhiên, vào đầu những năm 1960, sự xuất hiện của một chủng SA mới kháng β-lactam được gọi là Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) (Hình 1.1), đã được công bố35. MRSA gây ra một trong những bệnh nhiễm trùng nguy hiểm và thường gặp nhất ngày nay, việc kháng thuốc gây ra một trở ngại lớn trong điều trị dứt điểm bệnh, nhu cầu có những thuốc kháng sinh mới để điều trị loại bệnh này là rất cần thiết và quan trọng. Ảnh SEM hiển vi của methicillin-kháng Staphylococcus aureus (hình tham khảo từ internet) Chủng mới này có mang một gen đặc biệt gọi là gen MecA, không có nguồn gốc từ SA, từ một nguồn không xác định bên ngoài nào đó.
Các kháng sinh β-lactam như penicillin và methicillin khi thâm nhập vào tế bào của vi khuẩn SA liên kết với enzym penicillin binding protein (PBP) cản trở PBP xúc tác cho sự hình thành liên kết giữa các peptit của các chuỗi peptidoglycan của thành tế bào. Sự ức chế cộng hóa trị của β-lactam với PBP dẫn tới thành tế bào suy yếu và cuối cùng gây chết các tế bào. Tập quán của gen MecA giữ lại trong mã hóa của 57,34,45,108,72,20,79,52,39,38,70 (PBP2a) MRSA,. Gen MecA được bảo toàn rất cao giữa các MRSA cô lập được (hơn 90% chuỗi PBP2a là đồng nhất giữa các dòng), PBP2a mới phát hiện không giống bất kì PBP thông thường được tạo ra bởi SA (chỉ có dưới 20% chuỗi là đồng nhất) và các PBP2a này không nhạy với β-lactam.
PBP2a gây ra sự kháng thuốc phổ rộng với methicillin và các kháng sinh β-lactam. PBP2a thể hiện ái lực thấp với β-lactam một cách bất thường ở chỗ nó vẫn giữ được khả năng làm trung gian xây dựng thành tế bào và giữ nguyên hoạt tính cho phép sự tổng hợp thành tế bào ngay cả ở nồng độ gây chết người của β-lactam. Cơ chế và cấu trúc tinh thể của PBP2a được trình bày ở đây làm sáng tỏ những đặc trưng cấu trúc lí giải cho sự kháng β- lactam của chúng và đưa ra những hiểu biết quan trọng cho việc thiết kế những kháng sinh tiềm năng chống lại MRSA. Cấu trúc phức axyl hóa của 1MWU từ ngân hàng dữ liệu protein data bank Sự ức chế hoạt động PBP2a bởi một phân tử nhỏ, dự kiến sẽ dẫn đến ly giải tế bào của vi khuẩn, do đó nên nó được coi là cách tiếp cận trực tiếp nhất để điều trị các bệnh nhiễm trùng MRSA.
Thông thường các β-lactam như methicillin, làm ức chế hoạt động của PBP2a trong việc làm trung gian xây dựng thành tế bào, các hợp chất thay thế methicillin cần được thiết kế một cách nào đó cho phép nó liên kết mạnh mẽ hơn với tâm hoạt động của enzym PBP2a. Để làm điều này một cách hợp lý, chi tiết cơ chế phân tử của β-lactam liên kết với PBP2a nên được hiểu rõ. Như đã biết, quá trình này có tính ràng buộc liên quan đến quá trình tạo phức không cộng hóa trị michaelis giữa beta- lactam và PBP2a sau đó là đến quá trình axyl hóa, kết quả là hình thành liên kết cộng hóa trị với Ser403 nằm ở vị trí tâm hoạt động (Hình 1.43,112 Trong quá trình axyl hóa, nhóm hydroxyl của Ser403 tấn công cacbon trong nhóm cacbonyl của phối tử. Kết quả là, liên kết C-N của phối tử β-lactam được phân tách, trong khi nhóm cacboxyl hình thành mối liên kết cộng hóa trị với nhóm hydroxyl của SER403.
Việc kháng phổ rộng của MRSA với kháng sinh nên được liên kết với việc giảm tỷ lệ phản ứng axyl hóa PBP2a. Điều này có nghĩa là việc thiết kế các thuốc kháng sinh mới sẽ 16 z yêu cầu kiểm soát cẩn thận các hàng rào năng lượng cần thiết trong bước axyl hóa cũng như bước tạo thành phức không cộng hóa trị trước đó. Đã có các công trình tổng quan về cơ chế kháng β-lactam.34,108,52,70 Có rất nhiều giả thuyết về cơ chế kháng β-lactam của MRSA nhưng nổi bật nên là 3 giả thiết kháng β-lactam của MRSA như sau: Cơ chế thứ nhất34,108 là việc sản sinh ra các enzym β-lactamase có khả năng thủy phân β-lactam. Theo cơ chế này đề xuất phổ biến nhất của việc kháng kháng sinh β-lactam có liên quan đến việc sản sinh ra một loại enzym thích hợp, ví dụ, β-lactamase có thể làm suy thoái, sửa đổi và thậm chí phá hủy các kháng sinh trước khi chúng có thể tiếp cận các tâm hoạt động trên MRSA.
Các kháng sinh β-lactam có một yếu tố chung trong cấu trúc phân tử của chúng: đó là một vòng bốn nguyên tử được gọi là vòng lactam. Các lactamase phá vỡ β-lactam bằng cách mở vòng lactam và từ đó khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử. Những enzym này đặc biệt quan trọng trong vi khuẩn Gram âm khi chúng tạo thành các cơ chế bảo vệ chính đối với thuốc trên cơ sở β-lactam. 1 2 3 R1 O O Beta-- lactam R1 R2 HN S HN S AmpC Beta - lactam.AmpC - HO N R2 O N AmC -OH - O O O O O - AmC R1 O R2 H2O S HN O - AmC.product AmC N HO OH2 O O - AmC product 4 5 Hình 1.
Sản sinh ra men β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân β-lactam Việc phân loại phân tử của β-lactamase được dựa trên các nucleotit và trình tự axit amin trong các enzym này. Cho đến nay có bốn lớp (class) phân 17 z loại theo chức năng được công nhận (A-D). Các lớp A, C, và D tác động theo cơ chế dựa trên serine, trong khi đó lớp B hoặc Metallo-β-lactamase cần kẽm cho tác dụng của chúng.34 Ví dụ, β-lactamase kiểu AmpC là loại β-lactamase lớp C, thường được phân lập từ vi khuẩn Gram âm kháng cephalosporin phổ rộng. AmpC được mã hóa đặc trưng trên nhiễm sắc thể của nhiều loại vi khuẩn gram âm bao gồm Citrobacter, Serratia và Enterobacter.3 minh họa việc sản sinh ra enzym β-lactamase có khả năng xúc tác thủy phân β- lactam cũng như là cơ chế kháng β-lactam.
Cơ chế thứ hai34,108 là sử dụng các men protein transpeptidases (được biết như là các penicillin-binding protein (PBP) cần cho việc nối các mạch peptidoglycan để tạo màng tế bào cứng tham gia gây vô hiệu hóa kháng sinh. Cơ chế này dựa trên giả thiết cho rằng quá trình axyl hóa protein bởi các kháng sinh có 3 giai đoạn: Giai đoạn 1. PBP2a tương tác với β-lactam với hằng số Kd tạo ra phức không cộng hóa trị (PBP2a - β-lactam). Phức không cộng hóa trị (PBP2a- β-lactam) sẽ chuyển thành phức cộng hóa trị axyl β-lactam -PBP2a với hằng số chuyển hóa K2.
Với một hằng số K3 vô cùng nhỏ phức cộng hóa trị axyl β- lactam -PBP2a phân ly tạo ra PBP2a và β-lactamoate. Trong đó: Hằng số phân ly của phức không cộng hóa trị Kd, Hằng số tốc độ bậc 1 K2, Hằng số tốc độ của quá trình phân hủy phức axyl K3. So sánh các thông số động học của PBP2a với các PBP nhạy cảm với β- lactam thấy việc kháng β-lactam của PBP2a chủ yếu là do việc tạo phức axyl β-lactam - PBP trung gian là không hiệu quả mà không phải là do sự không khớp của phân tử β-lactam với tâm hoạt động (Kd) cũng không phải do sự phân huỷ nhanh hơn của phức trung gian axyl-PBP (K3)72,70,36,73. 18 z Bởi vì các giá trị Kd đặc trưng cho PBP là tương đối cao (cỡ millimol), tính hiệu quả của các chất ức chế β-lactam là do khả năng của chúng tạo thành phức cộng hoá trị bền với các protein đối của chúng.
Do đó, giảm tốc độ tạo phức trung gian Kd và quá trình tạo phức axyl hóa (K2) là một chiến lược hiệu quả để đạt tới tính kháng thuốc phổ rộng.70,112,41 Các PBP kháng như vậy không nhất thiết cản trở sự tăng trưởng tế bào hoặc khả năng tồn tại của nó nếu các yếu tố khác có thể bù đắp cho việc giảm tính hiệu quả của các enzym. 24,62 Cơ chế này hiện đang là nguyên nhân chính gây ra sự kháng thuốc trong một số tác nhân gây bệnh bao gồm các vi khuẩn Gram dương loài Staphylococcal và Streptococcal. 108 Cơ chế thứ ba là sự thải loại các phân tử β-lactam khỏi các tế bào Gram-âm bằng cách bơm thoát.108 Theo cơ chế này thì sự ngăn cản kháng sinh tiếp cận protein đối tác (target protein) bằng cách thẩm thấu ngược (altered permeability) hoặc thoát cưỡng bức (forced efflux) – còn gọi là thoát hoạt động (active eflux). Ví dụ, điều này có thể được thực hiện bởi các bơm kháng sinh thoát cưỡng bức (forced efflux pump) MexA, B-OprM vốn là một nguyên nhân chính gây kháng ở Pseudomonas và trong các loài gây bệnh Gram âm khác.
Thoát hoạt động là một cơ chế đáp ứng việc thải loại các chất độc hại và kháng sinh ra khỏi tế bào. Nó được xem là phần không thể thiếu của sự trao đổi dị chất (xenobiotic metabolism). Cơ chế này là quan trọng trong dược học bởi vì nó tham gia vào việc kháng các kháng sinh. Các hệ thoát (efflux) hoạt động thông qua một cơ chế phụ thuộc năng lượng (Active transport) để bơm đẩy những chất độc không mong muốn qua một cái bơm thoát đặc biệt.
Một số hệ thoát đặc hiệu cho từng loại thuốc, một 19 z số khác lại có tác dụng kháng đa thuốc phổ rộng (multidrug resistance - MDR). Các chất vận chuyển thoát khuẩn (bacterial efflux transporters) được phân thành 5 họ chủ yếu dựa trên trật tự axit amin và nguồn năng lượng được dùng để thải cơ chất. Một trong những chất đặc trưng tốt nhất cho chúng là hệ thoát thuốc (drug efflux system) MexAB–OprM của thể sinh bệnh cơ hội (opportunistic pathogen) Pseudomonas aeruginosa.