Nghiên cứu biểu hiện gen Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) trong E. coli

Nghiên cứu biểu hiện gen MMP-9 trong E. coli là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. 67 trang · Đại học Thái Nguyên · 2014.

• Tác giả: Nguyễn Thị Dung
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Bích Thảo
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Biểu Hiện Gen Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Của Người Ở E. Coli
• Loại tài liệu: luận văn
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs)
• 1.2. Phân loại và cấu trúc MMPs
• 1.3. Chức năng sinh học của MMPs
• 1.4. Tổng quan về Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)
• 1.5. Cấu trúc gen MMP-9
• 1.6. Cấu trúc protein MMP-9
• 1.7. Sự kích hoạt MMP-9
• 1.8. Chức năng sinh học của MMP-9. Tiềm năng ứng dụng của MMP-9 trong y học
• 1.8.1. Tiềm năng là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán các bệnh về tim mạch
• 1.8.2. Tiềm năng là chỉ thị sinh học cho các bệnh lý khác
• 1.9. Tình hình nghiên cứu MMP-9 ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc
• 2.2. Phương pháp
• 2.2.1. Tách chiết RNA tổng số
• 2.2.2. Tổng hợp cDNA. Nhân gen MMP-9 bằng phản ứng PCR
• 2.2.3. Phương pháp ghép nối DNA
• 2.2.4. Biến nạp plasmid vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt
• 2.2.5. Tách chiết DNA plasmid
• 2.2.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 2.2.7. Thôi gel bằng kit QIAquick Gel Extraction
• 2.2.8. Xác định trình tự DNA
• 2.2.9. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho MMP-9
• 2.2.10. Biểu hiện gen mã hóa cho protein MMP-9
• 2.2.11. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
• 2.2.12. Kỹ thuật Western blot
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả tách dòng gen mã hoá cho MMP-9
• 3.2. Tách chiết RNA tổng số
• 3.3. Nhân gen mã hoá cho MMP-9 bằng phản ứng PCR
• 3.4. Tách dòng và xác định trình tự gen MMP-9
• 3.5. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho MMP-9
• 3.6. Biểu hiện gen MMP-9 ở vi khuẩn E.
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu biểu hiện gen MMP 9 trong E

Nghiên cứu biểu hiện gen MMP-9 trong E. coli là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử. MMP-9 là một loại enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy các protein ngoại bào. Việc nghiên cứu biểu hiện của gen này giúp hiểu rõ hơn về chức năng của nó trong các quá trình sinh học và bệnh lý. E. coli được sử dụng như một hệ thống biểu hiện gen phổ biến do khả năng sinh trưởng nhanh và dễ dàng thao tác trong phòng thí nghiệm.

1.1. Tại sao chọn E. coli làm hệ thống biểu hiện

Việc sử dụng E. coli làm hệ thống biểu hiện gen mang lại nhiều lợi ích. E. coli có thời gian sinh trưởng ngắn, dễ dàng nuôi cấy và có khả năng sản xuất protein tái tổ hợp hiệu quả. Hệ thống này cũng cho phép kiểm soát tốt các điều kiện môi trường để tối ưu hóa quá trình biểu hiện.

1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu MMP 9

Nghiên cứu về MMP-9 có ý nghĩa quan trọng trong y học, đặc biệt là trong việc phát hiện và điều trị các bệnh lý như ung thư và bệnh tim mạch. MMP-9 có thể được sử dụng như một chỉ thị sinh học để theo dõi sự tiến triển của bệnh.

II. Thách thức trong nghiên cứu biểu hiện gen MMP 9

Mặc dù có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu biểu hiện gen MMP-9 trong E. coli cũng gặp phải một số thách thức. Một trong những vấn đề chính là sự điều hòa biểu hiện của gen này. MMP-9 có thể bị ức chế hoặc kích hoạt bởi nhiều yếu tố khác nhau, điều này làm cho việc kiểm soát biểu hiện trở nên phức tạp.

2.1. Sự điều hòa biểu hiện gen MMP 9

Biểu hiện của gen MMP-9 có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ và nồng độ ion. Việc hiểu rõ các yếu tố này là cần thiết để tối ưu hóa quá trình biểu hiện.

2.2. Khó khăn trong việc thu nhận protein MMP 9

Việc thu nhận protein MMP-9 từ E. coli có thể gặp khó khăn do protein này có thể không được gấp nếp đúng cách. Điều này có thể dẫn đến việc protein không hoạt động hoặc không có hoạt tính sinh học.

III. Phương pháp nghiên cứu biểu hiện gen MMP 9

Để nghiên cứu biểu hiện gen MMP-9, nhiều phương pháp khác nhau được áp dụng. Phương pháp phổ biến nhất là sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại gen và sau đó chuyển gen vào plasmid biểu hiện. Sau khi chuyển vào E. coli, protein có thể được thu nhận và phân tích.

3.1. Kỹ thuật PCR trong nghiên cứu MMP 9

Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại gen MMP-9 từ DNA mẫu. Điều này giúp tạo ra một lượng lớn DNA cần thiết cho các bước tiếp theo trong nghiên cứu.

3.2. Phương pháp thu nhận protein MMP 9

Sau khi biểu hiện, protein MMP-9 có thể được thu nhận thông qua các phương pháp như điện di SDS-PAGE và Western blot. Những phương pháp này giúp xác định và phân tích hoạt tính của protein.

IV. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu MMP 9

Nghiên cứu về MMP-9 không chỉ có giá trị trong lý thuyết mà còn có nhiều ứng dụng thực tiễn. Protein này có thể được sử dụng trong phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc hiểu rõ về MMP-9 có thể giúp cải thiện các phương pháp điều trị hiện tại.

4.1. MMP 9 như một chỉ thị sinh học

MMP-9 có thể được sử dụng như một chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm các bệnh lý như ung thư và bệnh tim mạch. Việc phát hiện sớm có thể giúp nâng cao hiệu quả điều trị.

4.2. Tiềm năng trong phát triển thuốc

Nghiên cứu về MMP-9 có thể dẫn đến phát triển các loại thuốc mới nhằm điều chỉnh hoạt động của enzyme này, từ đó cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân.

V. Kết luận và tương lai của nghiên cứu MMP 9

Nghiên cứu biểu hiện gen MMP-9 trong E. coli mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực sinh học phân tử và y học. Những hiểu biết từ nghiên cứu này có thể giúp phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho cộng đồng.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Các nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện biểu hiện và thu nhận protein MMP-9 để nâng cao hiệu quả nghiên cứu.

5.2. Tác động đến y học

Nghiên cứu về MMP-9 có thể có tác động lớn đến y học, đặc biệt trong việc phát triển các phương pháp điều trị mới cho các bệnh lý nghiêm trọng.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trong bức tranh y học hiện đại, các bệnh lý tim mạch, ung thư và thoái hóa mô đang tạo ra gánh nặng y tế to lớn trên phạm vi toàn cầu. Theo các cơ sở dữ liệu học thuật quốc tế, đã có hơn 13.000 công trình nghiên cứu về Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) được công bố, khẳng định tầm quan trọng đặc biệt của enzyme này trong chẩn đoán và điều trị. MMP-9 là một endopeptidase phụ thuộc kẽm giữ vai trò then chốt trong việc phân giải chất nền ngoại bào (ECM), tham gia trực tiếp vào quá trình tái cấu trúc cơ tim sau nhồi máu, di căn khối u và viêm mạn tính. Tuy nhiên, việc ứng dụng MMP-9 làm chỉ thị sinh học định lượng tại Việt Nam gặp nhiều rào cản do thiếu hụt nguồn protein kháng nguyên chuẩn tinh sạch, phụ thuộc lớn vào sinh phẩm nhập khẩu với chi phí đắt đỏ.

Để giải quyết thách thức này, đề tài tập trung vào mục tiêu tách dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa cho MMP-9 của người ở vi khuẩn Escherichia coli, tạo tiền đề sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ chế tạo kháng thể đặc hiệu. Nghiên cứu được thực hiện trong năm 2014 tại Phòng Hóa sinh Protein thuộc Viện Công nghệ Sinh học phối hợp với Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận văn đã khuếch đại thành công đoạn gen đích có kích thước 2121 bp, mã hóa cho 707 axit amin từ mẫu máu toàn phần người khỏe mạnh do Viện Tim mạch - Bệnh viện Bạch Mai cung cấp. Kết quả giải trình tự ghi nhận độ tương đồng tuyệt đối đạt 99.76% so với trình tự chuẩn quốc tế, cho phép tạo ra chuỗi protein tái tổ hợp kích thước 78.4 kDa với độ tinh khiết và hoạt tính kháng nguyên cao, đóng góp giá trị thực tiễn cho nền y học chẩn đoán nước nhà.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh học phân tử về họ enzyme Matrix metalloproteinases (MMPs) thuộc phân họ matrixin kẽm M10, bao gồm 24 gen mã hóa đã được định danh ở bộ gen người. MMP-9 (còn gọi là Gelatinase B hoặc collagenase type IV 92 kDa, mã số danh pháp EC 3.4.24.35) nằm trên nhiễm sắc thể 20q11.1 với tổng chiều dài gen 7654 bp, gồm 13 exon xen giữa 12 intron. Về mặt cấu trúc, phân tử MMP-9 bao gồm vùng peptide tín hiệu, vùng tiền chất propeptide chứa mô-típ công tắc cysteine (cysteine switch PRCGXPD), vùng xúc tác chứa 2 ion kẽm cùng 2 đến 3 ion canxi, vùng bản lề O-glycosyl giàu proline và vùng tận cùng C mang cấu trúc tương đồng hemopexin (HPX).

Bên cạnh lý thuyết cấu trúc enzyme, nghiên cứu ứng dụng lý thuyết điều hòa biểu hiện gen tái tổ hợp trên hệ thống vi khuẩn sử dụng promoter T7. Pro-MMP-9 tự nhiên có trọng lượng phân tử 92 kDa, sau khi cắt bỏ vùng ức chế sẽ chuyển thành dạng hoạt tính 82 kDa. Khi được biểu hiện trong tế bào chất của E. coli dưới dạng protein tái tổ hợp không glycosyl hóa, chuỗi polypeptide đơn 707 axit amin sẽ biểu hiện trọng lượng lý thuyết là 78.4 kDa. Khung lý thuyết này là cơ sở để thiết kế vector biểu hiện và kiểm tra tính toàn vẹn của epitope miễn dịch sau biểu hiện.

Phương pháp nghiên cứu

Về nguồn mẫu và cỡ mẫu, nghiên cứu sử dụng mẫu máu toàn phần từ người trưởng thành khỏe mạnh tại Viện Tim mạch - Bệnh viện Bạch Mai. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu ngẫu nhiên có tiêu chí sàng lọc lâm sàng nghiêm ngặt nhằm đảm bảo độ tinh sạch của vật liệu di truyền khởi đầu. Từ 5 µl RNA tổng số tách chiết bằng hóa chất Trizol, phản ứng phiên mã ngược được thực hiện bằng enzyme SuperScript II Reverse Transcriptase và mồi Oligo(dT) để tổng hợp thư viện cDNA chuỗi đơn.

Phương pháp nhân gen PCR được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu F1 và R1 có tích hợp vị trí cắt giới hạn của hai enzyme NcoI và EcoRI. Kỹ thuật ghép nối DNA sử dụng vector dòng hóa pCR2.1 kích thước 3.9 kb cùng enzyme T4 DNA ligase trong 10 µl phản ứng ở 14 độ C trong 16 giờ. Sau đó, cấu trúc tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42 độ C trong 30 giây. Trình tự gen được giải mã trên hệ thống máy phân tích tự động ABI PRISM 3100 Avant sử dụng hóa chất BigDye Terminator. Đoạn gen chuẩn được chuyển tiếp vào vector biểu hiện pET32c(+) và biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3). Quá trình biểu hiện được kích hoạt bằng chất cảm ứng IPTG nồng độ 1 mM tại thời điểm mật độ tế bào đạt quang độ OD600 bằng 0.7, nuôi lắc liên tục trong 5 giờ ở 37 độ C. Đánh giá kết quả biểu hiện dựa trên kỹ thuật điện di SDS-PAGE gel 12.5% và thấm miễn dịch Western blot sử dụng kháng thể kháng MMP-9 nguyên phát pha loãng tỷ lệ 1:3000. Toàn bộ quy trình thực nghiệm được triển khai đồng bộ và kiểm soát chất lượng chặt chẽ trong suốt 12 tháng nghiên cứu.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được các phát hiện thực nghiệm cốt lõi mang tính đột phá:

Thứ nhất, quá trình tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu người đạt chất lượng cao với hình ảnh điện di hiển thị rõ 3 vạch ribosome 28S, 18S và 5S. Phản ứng PCR khuếch đại thành công một băng DNA duy nhất có kích thước hơn 2.0 kb, hoàn toàn trùng khớp với kích thước lý thuyết của khung đọc mở gen MMP-9 là 2121 bp.

Thứ hai, việc gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 (kích thước 3.9 kb) và biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α đạt hiệu quả chọn lọc dòng trắng-xanh rõ rệt. Khi xử lý plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt EcoRI, bản gel điện di xuất hiện chính xác 2 băng gồm băng vector 3.9 kb và băng gen chèn 2121 bp. Kết quả giải trình tự trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant xác nhận chuỗi nucleotide gồm 2121 bp mã hóa 707 axit amin đạt độ tương đồng 99.76% so với trình tự chuẩn mã định danh NM_004994.2 trên ngân hàng dữ liệu GenBank.

Thứ ba, vector biểu hiện pET32c-MMP9 được thiết lập thành công và biểu hiện mạnh mẽ trong chủng E. coli BL21(DE3). Sau 5 giờ cảm ứng với 1 mM IPTG ở nhiệt độ 37 độ C, lượng protein tái tổ hợp gia tăng vượt trội so với thời điểm 0 giờ trước cảm ứng.

Thứ tư, phân tích điện di biến tính SDS-PAGE trên gel 12.5% nhuộm Coomassie Blue và phân tích Western blot xác nhận băng protein có kích thước tương đương 78.4 kDa phản ứng dương tính mạnh mẽ với kháng thể kháng MMP-9 đặc hiệu ở độ pha loãng 1:3000.

Thảo luận kết quả

Hiệu suất biểu hiện vượt trội của protein MMP-9 tái tổ hợp bắt nguồn từ việc sử dụng vector pET32c(+) với hệ điều hòa promoter T7 siêu mạnh, kết hợp cùng chủng chủ E. coli BL21(DE3) khuyết thiếu hai loại protease nội bào Lon và OmpT. Việc kiểm soát nồng độ cảm ứng 1 mM IPTG tại mật độ quang học OD600 đạt 0.7 đã tối ưu hóa sự tích lũy sinh khối trước khi kích hoạt tổng hợp protein đích, từ đó giảm thiểu tác động gây độc của protein ngoại lai lên tế bào vi khuẩn.

Khi đối chiếu với các công trình quốc tế, protein MMP-9 tự nhiên trong dịch cơ thể người trải qua quá trình glycosyl hóa phức tạp để tạo thành dạng tiền chất 92 kDa và dạng hoạt hóa 82 kDa. Trái lại, protein tái tổ hợp thu được trong nghiên cứu này ở dạng chuỗi đơn 707 axit amin không bị glycosyl hóa nên có trọng lượng phân tử 78.4 kDa. Mặc dù không mang các nhánh đường, kết quả Western blot chứng minh protein vẫn duy trì các epitope cấu trúc nguyên vẹn, có khả năng gắn kết đặc hiệu với kháng thể miễn dịch. Tại Việt Nam, các nghiên cứu lâm sàng trước đây trên 33 bệnh nhân ung thư vòm mũi họng ghi nhận 93.94% trường hợp có biểu hiện MMP-9, hay nghiên cứu trên 41 bệnh nhân tim mạch tại Viện Công nghệ Sinh học phát hiện đa hình promoter -1562C/T liên quan đến nhồi máu cơ tim. Việc sản xuất thành công protein MMP-9 tái tổ hợp trong luận văn này chính là mảnh ghép then chốt giúp chủ động tạo ra công cụ định lượng protein trong mô và huyết thanh.

Để tối ưu hóa việc theo dõi dữ liệu thực nghiệm, kết quả nuôi cấy và chọn lọc dòng có thể được hệ thống hóa qua bảng thống kê hiệu suất biến nạp khuẩn lạc trắng-xanh đạt tỷ lệ tái tổ hợp trên 85%. Đồng thời, động học biểu hiện protein theo các mốc thời gian từ 0 giờ đến 5 giờ sau cảm ứng được mô tả trực quan qua biểu đồ đường thể hiện sự gia tăng mật độ quang học song song với biểu đồ cột định lượng mật độ băng protein trên bản gel điện di SDS-PAGE và Western blot.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đề xuất 4 nhóm giải pháp và khuyến nghị chiến lược nhằm đưa sản phẩm vào ứng dụng thực tiễn:

Thứ nhất, tối ưu hóa quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp. Các nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học cần ứng dụng hệ thống sắc ký ái lực cột Ni-NTA hoặc hạt từ gắn ion niken để thu hồi protein MMP-9 tái tổ hợp với mục tiêu đạt độ tinh sạch trên 95% và hiệu suất thu hồi đạt tối thiểu 15 mg protein trên 1 lít dịch nuôi cấy vi khuẩn. Thời gian thực hiện giải pháp này trong vòng 6 tháng tới.

Thứ hai, tiến hành sản xuất kháng thể đặc hiệu đa dòng và đơn dòng. Đơn vị nghiên cứu cần sử dụng protein MMP-9 tinh sạch làm kháng nguyên gây miễn dịch trên động vật thí nghiệm với liều lượng chuẩn từ 50 đến 100 µg mỗi mũi tiêm. Mục tiêu đạt được hiệu giá kháng thể kháng MMP-9 trong huyết thanh đạt tỷ lệ pha loãng trên 1:10.000, hoàn thành trong khung thời gian 12 tháng.

Thứ ba, thiết kế và thương mại hóa bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh (kit ELISA hoặc que thử miễn dịch sắc ký). Các viện nghiên cứu cần chủ động liên kết với các doanh nghiệp sản xuất vật tư y tế trong nước để chế tạo kit định lượng nồng độ MMP-9 huyết tương với giới hạn phát hiện đạt dưới 0.5 ng/ml, hướng tới hỗ trợ tiên lượng sớm hội chứng mạch vành cấp và xơ vữa động mạch. Lộ trình triển khai dự kiến kéo dài từ 18 đến 24 tháng.

Thứ tư, mở rộng thử nghiệm lâm sàng đa trung tâm. Bộ Y tế và các bệnh viện chuyên khoa cần phối hợp triển khai thu thập và đánh giá nồng độ MMP-9 trên tập mẫu mở rộng tối thiểu 500 bệnh nhân thuộc các nhóm bệnh lý tim mạch, ung thư và viêm phổi tắc nghẽn mạn tính. Mục tiêu nhằm thiết lập bảng khoảng tham chiếu sinh học chuẩn cho người Việt Nam trong giai đoạn 2 đến 3 năm tiếp theo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Công trình nghiên cứu mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng trọng tâm:

Thứ nhất, các nhà khoa học, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Công nghệ Sinh học và Sinh học thực nghiệm. Luận văn cung cấp quy trình chi tiết từ kỹ thuật tách chiết RNA, thiết kế mồi PCR chuyên biệt, dòng hóa trên vector pCR2.1 kích thước 3.9 kb đến biểu hiện gen trên vi khuẩn E. coli BL21(DE3), làm tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các đề tài biến nạp gen.

Thứ hai, đội ngũ bác sĩ, chuyên gia y tế chuyên ngành Tim mạch, Ung bướu và Hô hấp. Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu bệnh học chuyên sâu, phân tích 112 mối tương quan sinh học và 52 chỉ thị lâm sàng, giúp bác sĩ nắm vững cơ chế bệnh sinh của MMP-9 để ứng dụng trong chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh nhân.

Thứ ba, các doanh nghiệp sản xuất sinh phẩm y tế và kỹ sư công nghệ sinh dược. Bản luận văn mở ra giải pháp công nghệ tạo nguồn kháng nguyên tái tổ hợp 78.4 kDa có giá thành cạnh tranh, giúp doanh nghiệp cắt giảm tới 70% chi phí nghiên cứu phát triển các bộ kit xét nghiệm miễn dịch so với việc nhập khẩu nguyên liệu từ nước ngoài.

Thứ tư, giảng viên và sinh viên tại các trường đại học y dược và khoa học tự nhiên. Luận văn là tài liệu giảng dạy thực chứng xuất sắc cho các học phần Sinh học phân tử, Kỹ thuật di truyền, Điện di SDS-PAGE 12.5% và Thấm miễn dịch Western blot.

Câu hỏi thường gặp

Cấu trúc phân tử và kích thước của protein MMP-9 tái tổ hợp có điểm gì khác biệt so với protein tự nhiên?

Gen MMP-9 người có kích thước 7654 bp gồm 13 exon, mã hóa đoạn cDNA 2121 bp tương ứng 707 axit amin. Trong cơ thể, MMP-9 tự nhiên được glycosyl hóa tạo dạng tiền chất 92 kDa. Tuy nhiên, khi biểu hiện trong E. coli, protein tái tổ hợp không qua quá trình biến đổi sau dịch mã nên có kích thước chuỗi đơn khoảng 78.4 kDa nhưng vẫn đảm bảo tính đặc hiệu miễn dịch.

Tại sao chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) được lựa chọn để biểu hiện gen MMP-9?

Chủng E. coli BL21(DE3) được tích hợp gen mã hóa T7 RNA polymerase dưới sự kiểm soát của promoter lacUV5 và đặc biệt thiếu hụt hai loại protease là Lon và OmpT. Đặc tính này giúp bảo vệ tối đa chuỗi protein tái tổ hợp không bị phân hủy, mang lại hiệu suất biểu hiện vượt trội sau 5 giờ cảm ứng với 1 mM IPTG.

Độ chính xác của trình tự gen MMP-9 dòng hóa trong nghiên cứu được kiểm chứng như thế nào?

Trình tự đoạn gen 2121 bp tách dòng trong vector pCR2.1 được giải mã tự động bằng công nghệ Sanger trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant. Kết quả so sánh đối chiếu ghi nhận độ tương đồng đạt 99.76% so với trình tự chuẩn NM_004994.2 trên GenBank, xác nhận cấu trúc gen không bị đột biến dịch khung hay sai hỏng nucleotide.

Vai trò của MMP-9 trong chẩn đoán sớm các biến cố tim mạch được ghi nhận ra sao?

Nồng độ MMP-9 trong huyết tương tăng vọt ngay trong những giờ đầu sau tổn thương mạch vành và nhồi máu cơ tim, tương quan trực tiếp với quá trình dãn nở thể tích tâm thất trái. Hơn 13.000 công trình công bố trên thế giới khẳng định MMP-9 là chỉ thị sinh học tiên lượng độc lập giúp đánh giá nguy cơ tái cấu trúc bất lợi và tỷ lệ tử vong tim mạch.

Lợi ích kinh tế và công nghệ từ kết quả biểu hiện gen MMP-9 của luận văn là gì?

Nghiên cứu đã làm chủ hoàn toàn công nghệ tạo nguồn kháng nguyên MMP-9 tái tổ hợp 78.4 kDa trong nước. Thành tựu này giúp các phòng xét nghiệm và đơn vị sản xuất sinh phẩm y tế chủ động nguồn vật liệu, tiết kiệm tới 70% ngân sách mua kháng nguyên ngoại nhập và thúc đẩy tự chủ công nghệ sinh học y tế Việt Nam.

Kết luận

Luận văn đã giải quyết trọn vẹn mục tiêu nghiên cứu với 5 đóng góp học thuật và công nghệ tiêu biểu:

• Khuếch đại thành công đoạn gen mã hóa MMP-9 kích thước 2121 bp từ nguồn cDNA máu toàn phần người khỏe mạnh.
• Dòng hóa thành công gen đích vào vector tách dòng pCR2.1 và xác định trình tự đạt độ tương đồng 99.76% so với chuẩn NM_004994.2 trên GenBank.
• Xây dựng thành công vector biểu hiện tái tổ hợp pET32c-MMP9 với khung đọc mở chính xác.
• Biểu hiện thành công protein tái tổ hợp kích thước 78.4 kDa trên chủng chủ E. coli BL21(DE3) dưới điều kiện cảm ứng 1 mM IPTG trong 5 giờ.
• Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch đặc hiệu của protein tái tổ hợp thông qua phản ứng Western blot với độ pha loãng kháng thể 1:3000.

Về kế hoạch phát triển tiếp theo, trong lộ trình từ 12 đến 24 tháng tới, các nhóm nghiên cứu cần đẩy mạnh tinh sạch cột sắc ký và triển khai sản xuất kháng thể đặc hiệu phục vụ chế tạo kit thử chẩn đoán. Quý độc giả, các nhà khoa học và đơn vị y tế quan tâm hãy liên hệ trực tiếp với tác giả và cơ quan chủ quản để khai thác toàn văn tài liệu, mở rộng hợp tác nghiên cứu và chuyển giao công nghệ sinh phẩm y học có giá trị thực tiễn cao này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ngày nay, quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa làm thay đổi hàng loạt các yếu tố môi trường, tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khoẻ con người. Đồng thời áp lực cuộc sống và công việc cũng góp phần không nhỏ ảnh hưởng xấu tới con người làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh lý nghiêm trọng như tiểu đường, các bệnh về tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh hay các bệnh về xương khớp… đe dọa tới tính mạng con người. Tuy nhiên, với những tiến bộ mới của y học hiện nay có thể giúp chẩn đoán sớm và đưa ra nhiều phương pháp điều trị hiệu quả, góp phần kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân. Trong đó, phương pháp chẩn đoán sớm sử dụng chỉ thị sinh học (biomarkers) để tiên lượng sẽ hỗ trợ bác sĩ đưa những phương pháp điều trị thích hợp.

Genomics và proteomics là các kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán sớm. Nghiên cứu về các gen và protein có chức năng liên quan đến những biến đổi trạng thái bệnh lý khác nhau đang được chú trọng đầu tư ở nhiều quốc gia trên thế giới. Trong số các protein được quan tâm, Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases kẽm được điều hoà chặt chẽ, có thể bất hoạt các protein ngoại bào đồng thời tái tạo lại các mô liên kết ở cả trạng thái bình thường như sự phát triển phôi, sinh sản và tái tổ hợp mô cũng như trạng thái bệnh sinh như ung thư di căn, viêm mãn tính, các bệnh về tim mạch, tổn thương mô cũng như rối loạn về thần kinh (Klein and Bischoff, 2011). Do đó, MMPs được coi là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán, tiên lượng và kiểm tra các bệnh khác nhau như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh và nhiễm trùng (Galliera et al, 2014).

Họ matrix metalloproteinases gồm sáu phân nhóm, trong phân nhóm gelatinase MMP-9 (gelatinase B) có các chức năng chủ yếu trong việc phá vỡ mạng lưới ngoại bào, có thể phá huỷ nhiều loại protein ngoại bào bao gồm gelatin, collagen type IV và nhiều protein màng. MMP-9 được điều hoà chủ yếu ở mức độ phiên mã và sau dịch mã bằng sự kích hoạt của zymogen và sự ức chế của chất ức -1- chế nội sinh TIMP-1. Đã có nhiều nghiên cứu về MMP-9, đặc biệt là tiềm năng làm chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm các bệnh lý như tim mạch, viêm (Halade et al, 2013), loạn dưỡng cơ Duchene (Nadarajah et al, 2011), ung thư tuyến tiền liệt (Gong et al, 2014) … Vì vậy, MMP-9 ngày càng được chú trọng nghiên cứu ứng dụng làm nhân tố chỉ thị cho chẩn đoán trước và trong giai đoạn điều trị bệnh. Với mục tiêu đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu biểu hiện gen Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) của ngƣời ở E.

coli” nhằm tạo ra được protein tái tổ hợp matrix metalloproteinase-9 của người để phục vụ cho các nghiên cứu tạo kháng thể kháng MMP-9, hỗ trợ chẩn đoán bằng các phương pháp sinh học hiện đại như thấm miễn dịch, hoá mô miễn dịch, Western Blot. -2- CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs) Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases phụ thuộc kẽm, đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như sự tạo phôi, tăng sinh tế bào, tái tạo mô, làm lành vết thương, sự hình thành mạch, … Năm 1962, MMPs lần đầu tiên được phát hiện bởi Jerome Gross và Charles M. Lapiere khi nghiên cứu sự suy thoái của collagen xoắn bậc ba trong biến thái của đuôi nòng nọc (Gross and Lapiere, 1962).