MỞ ĐẦU Ngày nay, quá trình công nghiệp hóa, đô thị hóa làm thay đổi hàng loạt các yếu tố môi trường, tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến sức khoẻ con người. Đồng thời áp lực cuộc sống và công việc cũng góp phần không nhỏ ảnh hưởng xấu tới con người làm gia tăng tỷ lệ mắc các bệnh lý nghiêm trọng như tiểu đường, các bệnh về tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh hay các bệnh về xương khớp… đe dọa tới tính mạng con người. Tuy nhiên, với những tiến bộ mới của y học hiện nay có thể giúp chẩn đoán sớm và đưa ra nhiều phương pháp điều trị hiệu quả, góp phần kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân. Trong đó, phương pháp chẩn đoán sớm sử dụng chỉ thị sinh học (biomarkers) để tiên lượng sẽ hỗ trợ bác sĩ đưa những phương pháp điều trị thích hợp.
Genomics và proteomics là các kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán sớm. Nghiên cứu về các gen và protein có chức năng liên quan đến những biến đổi trạng thái bệnh lý khác nhau đang được chú trọng đầu tư ở nhiều quốc gia trên thế giới. Trong số các protein được quan tâm, Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases kẽm được điều hoà chặt chẽ, có thể bất hoạt các protein ngoại bào đồng thời tái tạo lại các mô liên kết ở cả trạng thái bình thường như sự phát triển phôi, sinh sản và tái tổ hợp mô cũng như trạng thái bệnh sinh như ung thư di căn, viêm mãn tính, các bệnh về tim mạch, tổn thương mô cũng như rối loạn về thần kinh (Klein and Bischoff, 2011). Do đó, MMPs được coi là chỉ thị sinh học trong chẩn đoán, tiên lượng và kiểm tra các bệnh khác nhau như bệnh tiểu đường, bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn gây suy thoái thần kinh và nhiễm trùng (Galliera et al, 2014).
Họ matrix metalloproteinases gồm sáu phân nhóm, trong phân nhóm gelatinase MMP-9 (gelatinase B) có các chức năng chủ yếu trong việc phá vỡ mạng lưới ngoại bào, có thể phá huỷ nhiều loại protein ngoại bào bao gồm gelatin, collagen type IV và nhiều protein màng. MMP-9 được điều hoà chủ yếu ở mức độ phiên mã và sau dịch mã bằng sự kích hoạt của zymogen và sự ức chế của chất ức -1- chế nội sinh TIMP-1. Đã có nhiều nghiên cứu về MMP-9, đặc biệt là tiềm năng làm chỉ thị sinh học trong chẩn đoán sớm các bệnh lý như tim mạch, viêm (Halade et al, 2013), loạn dưỡng cơ Duchene (Nadarajah et al, 2011), ung thư tuyến tiền liệt (Gong et al, 2014) … Vì vậy, MMP-9 ngày càng được chú trọng nghiên cứu ứng dụng làm nhân tố chỉ thị cho chẩn đoán trước và trong giai đoạn điều trị bệnh. Với mục tiêu đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu biểu hiện gen Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) của ngƣời ở E.
coli” nhằm tạo ra được protein tái tổ hợp matrix metalloproteinase-9 của người để phục vụ cho các nghiên cứu tạo kháng thể kháng MMP-9, hỗ trợ chẩn đoán bằng các phương pháp sinh học hiện đại như thấm miễn dịch, hoá mô miễn dịch, Western Blot. -2- CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tổng quan về Matrix metalloproteinases (MMPs) Matrix metalloproteinases (MMPs) là một họ protein endopeptidases phụ thuộc kẽm, đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình như sự tạo phôi, tăng sinh tế bào, tái tạo mô, làm lành vết thương, sự hình thành mạch, … Năm 1962, MMPs lần đầu tiên được phát hiện bởi Jerome Gross và Charles M. Lapiere khi nghiên cứu sự suy thoái của collagen xoắn bậc ba trong biến thái của đuôi nòng nọc (Gross and Lapiere, 1962).
Năm 1968, enzyme này lần đầu tiên được phân lập từ tế bào da người ở dạng không hoạt động là proMMP (còn được gọi là zymogen MMP) (Eisen et al. Sau đó MMPs được tìm thấy ở động vật không xương sống và thực vật. Đến năm 1990 một nhóm nghiên cứu khác đã phát hiện ra cơ chế điều hòa các enzyme MMPs ở dạng không hoạt động (Van Wart and Birkedal-Hansen, 1990). Phân loại và cấu trúc MMPs Phân loại Phân lớp metalloproteases là một họ protein endopeptidases bao gồm các enzyme xúc tác phụ thuộc vào kẽm (William and Robert, 1998).
Matrix metalloproteinase (MMPs) thuộc phân họ matrixin kẽm Metalloprotease M10 (Nagase et al., 2006; Sbardella et al., 2012), có cơ sở dữ liệu trên MEROPS (http://www. Sau khi hoàn thành việc giải mã trình tự bộ gen người vào năm 2003 thì MMPs được xác định gồm 24 gen mã hóa cho toàn bộ MMPs ở người. Thành viên trong họ MMPs giống nhau khoảng 40% về cấu trúc chính. Khoảng hơn 20 loại MMPs khác nhau được phát hiện và phân loại dựa vào vị trí trên nhiễm sắc thể và dựa vào các loại chất nền.
Mặc dù các tên gọi từ MMP-1 đến MMP-28 được sử dụng để phân loại, nhưng một số MMP vẫn chưa được xác định. Danh sách MMPs được thể hiện trong hệ thống Bảng 1.1 (Zitka et al. Phân loại Matrix metalloproteinases (Zitka et al., 2010) MMP Metalloproteinase kDa EC Locus Chất nền Collgenase (type I, 11q22- Collagens (I,II,III,VIII và X); gelatin; aggrecan; L-selectin; MMP-1 43 EC 3.7 interstitial) q23 IL-1β proteoglycanes;entactin; ovostatin; MMP-2, MMP-9 Gelatinase A 72kDa Collagens (I,IV,V,VII,X,XI và XVI); gelatin; elastin; MMP-2 Gelatinase type IV EC3.24 16q13 fibronectin; aggrecan; MBP; osteonectin; laminin-1; 66 Collagenase MMP-1; MMP-9, MMP-13 Collagens (III,IV,V và IX); gelatin; aggrecan; perlecan; Stromelysin-1 46 decorin; laminin; elastin; casein; osteonectin; ovostatin; MMP-3 EC3.17 11q23 antactin; plasminogen; MBP; IL-1β; MMP-2/TIMP-2; Proteoglykanase MMP-7; MMP-8; MMP-9; MMP-13 Collagens (IV và X); gelatin; aggrecan; decorin; elastin; 11q21- fibronectin; laminin; entactin; casein; transferrin; MBP; MMP-7 Matrilysin 20 EC3.23 q22 plasminogen; β4-integrin; MMP-1; MMP-2; MMP-9; MMP-9/TIMP-1 Neutrophil 11q21- Collagens (I,II,III,V,VII,VIII và X); gelatin; aggrecan; MMP-8 58 EC3.2- Collgens (IV,V,VII,X và XIV); gelatin; entactin; aggrecan; MMP-9 Gelatinase B 92 EC3.1 elastin; fibronectin; osteonectin; plasminogen; MBP; IL-1b 11q22.3- Collagens ( III-V); gelatin; casein; fibronectin; vitronecin; MMP-10 Stromelysin-2 46 E3.2 q23 laminin; ectactin; MBP; fibrinogen; fibrin;plasminogen MMP-11 Stromelysin-3 44 No match 22q11.2- Colagen IV; gelatin; elastin; caein; fbronectin; vitronectin; MMP-12 45 EC3.3 laminn; ectactin; MBP; fibrinogen; fibrin; plasminogen Collagens (I,II,III,IV,IX,X và XIV); gelatin; plasminogen; MMP-13 Collagenase-3 55 No match 11q2.3 aggrecan; perlecan; fibronectin; osteonetin; MMP-9 14q11- Collagens (I-III); gelatin; casein; fibronectin; laminin; MMP-14 MT1-MMP 54 No match q12 vitronectin;entactin; proteoglycans; MMP-2; MMP-13 16q12.2- MMP-15 MT2-MMP 61 No match Fibronectin; entactin; laminin; perlekan; MMP-2 q21 MMP-16 MT3-MMP 55 No match 8q21 Collagens III; gelatin; casein; fibronectin; MMP-2 MMP-17 MT4-MMP 54 No match 12q24 Unknow MMP-18 Collagenase-4 No match Unknow Collagens(I,II,III,VIII và X); gelatin; aggrecan MMP-19 RASI-1 No match 12q14 Gelatin; aggrecan; fibronectin -5- MMP-20 Enamelysin No match Unknow Amelogrenein; aggrecan MMP-21* No match 1p36.3 Unknow MMP-22* No match 1p36.3 Unknow MMP-23* No match Unknow Unknow MMP-24* MT5-MMP No match 20q11.2 Unknow Leokolysin/MT6- MMP-25 No match 16p/3.3 Pro-gelatinase A; fibrin; fibronectin; collagen IV; gelatin MMP Endometase, MMP-26 No match Unknow Gelatin I; P1; fibrinogen; fibronectin; vitronectin matrilysin-2 MMP-28 Epilysin No match 17q11.2 Casein (*: Gen MMP được tìm thấy trên nhiễm sắc thể nhưng chức năng và cấu trúc của chúng chưa được xác định) -6- Cấu trúc MMPs là những protein có cấu trúc tương đồng nhau, có thể chia thành 6 nhóm chính: collagenases, stromelysins, matrilysins, gelatinases, MT-MMPs (Membrane-type MMPs) và MMPs không có nhóm chỉ định. Dựa vào nghiên cứu tinh thể học và cộng hưởng từ có thể xác định được cấu trúc của nhiều MMPs.
MMPs là endopeptidases phụ thuộc kẽm và canxi, được tổng hợp dưới dạng proMMPs và được tiết ra ngoài tế bào nhưng ở dạng bất hoạt (trừ MT-MMPs) (Zitka et al. Hầu hết các MMPs có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng propeptide, vùng xúc tác (CAT) và vùng hemopexin-like (HPX) (Page-McCaw et al., 2007; Ndinguri et al. Vùng signal peptide nằm ở đầu gần vùng propeptide, là đoạn peptide chứa khoảng 17-20 amino acid (a.a), có vai trò trong đáp ứng tín hiệu tiết. Vùng signal peptide có ở tất cả các MMPs trừ MMP-17 (William and Robert, 1998).
Vùng propeptide gồm khoảng 80 a.a, chức năng của vùng này tạo ra các zymogen, vùng propeptide khi bị phân cắt sẽ kích hoạt proMMP (Zitka et al. Vùng hemopexin-like (hay còn được gọi là vùng C-terminal) có cấu trúc tương tự với protein họ hemopexin, gồm khoảng 200 a. Vùng này có diện tích bề mặt tương đối lớn cho các tương tác giữa protein với protein. Chức năng của vùng này chưa được biết rõ (Zitka et al.
Vùng xúc tác gồm khoảng 170 a.a, với 2 ion kẽm (Zn2+) và 2 hoặc 3 ion canxi (Ca2+) trong trung tâm hoạt động. Ion Zn2+ đầu tiên nằm ở vị trí hoạt động tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác. Ion Zn2+ thứ hai (kẽm cấu trúc) và ion Ca2+ cách ion Zn2+ xúc tác một khoảng 12 nm. Chức năng của các ion Ca2+ là ổn định cấu trúc của vùng xúc tác (Massova et al., 1998; Zitka et al.
Đặc điểm cấu trúc của một số phân nhóm MMPs (Gong et al. Chức năng sinh học của MMPs Vai trò chính của MMPs là phân hủy và loại bỏ các phân tử chất nền ngoại bào (extracellular matrix-ECM) từ các mô (Nagase et al., 2006; Ogura et al. Các nghiên cứu sâu hơn chỉ ra rằng sự phân hủy chất nền ngoại bào hoặc các phần tử bề mặt tế bào làm thay đổi tương tác giữa cơ chất-tế bào và tế bào-tế bào. Khi các nhân tố sinh trưởng được tạo thành, chúng liên kết với ECM làm cho các nhân tố sinh trưởng này có khả năng nhận diện thụ thể tế bào.
Một số phân tử không phải chất nền ngoại bào cũng là cơ chất tiềm năng của MMPs (Nagase et al. Trong điều kiện sinh lý bình thường MMPs bị kiểm soát chặt chẽ bởi các chất ức chế nội sinh TIMPs (Tissue inhibitors of metalloproteinases). Do vậy, sự mất cân bằng giữa MMPs và TIMPs có thể làm tăng hoạt động của phân tử MMPs dẫn đến trạng thái bệnh lý nào đó. MMPs còn tham gia vào nhiều quá trình sinh học và bệnh lý (Bảng 1.2) như ung thư di căn, viêm khớp dạng thấp, thoái hóa khớp, các bệnh về tim mạch… (William and Robert, 1998; Klein and Bischoff, 2011; Jones, 2014).