Nghiên Cứu Đặc Điểm Bệnh Viêm Ruột Tiêu Chảy Do Virus Parvo Type 2 Ở Chó

Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý và sinh học phân tử của virus parvo type 2 ở chó tại miền Bắc Việt Nam, cung cấp thông tin quan trọng cho chẩn đoán và điều trị.

• Tác giả: Võ Văn Hải
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Bệnh Lý Của Chó Mắc Bệnh Viêm Ruột Tiêu Chảy Do Virus Parvo Type 2 (CPV2) Gây Ra Và Đặc Điểm Sinh Học Phân Tử Của Một Số Chủng CPV2 Lưu Hành Tại Miền Bắc Việt Nam
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. MỤC LỤC
• 1.1. Trang Lời cam đoan
• 1.2. Mục lục
• 1.3. Danh mục chữ viết tắt
• 1.4. Danh mục bảng
• 1.5. Danh mục hình
• 1.6. Trích yếu luận án
• 1.7. Thesis abstract
• 1.8. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
• 1.9. Mục tiêu nghiên cứu
• 1.9.1. Mục tiêu tổng quát
• 1.9.2. Mục tiêu cụ thể
• 1.10. Phạm vi nghiên cứu
• 1.11. Đối tượng nghiên cứu
• 1.12. Thời gian nghiên cứu
• 1.13. Địa điểm nghiên cứu
• 1.14. Các đóng góp mới của đề tài
• 1.15. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 1.15.1. Ý nghĩa khoa học
• 1.15.2. Ý nghĩa thực tiễn
• 1.16. Tổng quan tài liệu
• 1.16.1. Đặc điểm sinh học của vi rút parvo
• 1.16.1.1. Cấu tạo chung
• 1.16.1.2. Vị trí xếp loại
• 1.16.1.3. Nguồn gốc của các chủng CPV2
• 1.16.2. Bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo trên chó
• 1.16.2.1. Dịch tễ học
• 1.16.2.2. Triệu chứng lâm sàng
• 1.16.2.3. Phòng bệnh
• 1.16.3. Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới
• 1.16.3.1. Các nghiên cứu trong nước
• 1.16.3.2. Các nghiên cứu trên thế giới
• 1.17. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 1.17.1. Nội dung nghiên cứu
• 1.17.2. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.17.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của những chủng vi rút parvo phân lập được
• 1.18. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
• 1.19. Phương pháp nghiên cứu
• 1.19.1. Phương pháp thu thập số liệu trực tiếp tại phòng khám
• 1.19.2. Phương pháp xác định chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.19.3. Phương pháp làm các xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu chó bị bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.19.4. Phương pháp mổ khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể
• 1.19.5. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể
• 1.19.6. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch
• 1.19.7. Phương pháp PCR
• 1.19.8. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
• 1.19.9. Phương pháp giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ
• 1.19.10. Phương pháp xử lý số liệu
• 1.20. Kết quả và thảo luận
• 1.20.1. Kết quả nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của CPV2 trên chó
• 1.20.1.1. Tỷ lệ mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ở chó theo từng địa phương
• 1.20.1.2. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo lứa tuổi
• 1.20.1.3. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giống
• 1.20.1.4. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giới tính
• 1.20.1.5. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo tình trạng tiêm chủng
• 1.20.1.6. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.20.1.7. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.20.1.7.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.20.1.7.2. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.20.1.8. Kết quả xác định sự phân bố của vi rút parvo ở một số cơ quan của chó mắc bệnh
• 1.20.2. Kết quả phân tích một số đặc tính sinh học phân tử của CPV2 gây bệnh ở chó tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam
• 1.20.2.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của gen VP2
• 1.20.2.2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của bộ gen CPV2
• 1.21. Kết luận và kiến nghị
• 1.21.1. Đặc điểm bệnh lý của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2
• 1.21.2. Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử của CPV2
• 1.22. Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án
• 1.23. Tài liệu tham khảo

Tóm tắt

I. Tổng quan về bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 ở chó

Bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) là một trong những bệnh lý nghiêm trọng ảnh hưởng đến sức khỏe của chó, đặc biệt là ở miền Bắc Việt Nam. Bệnh này thường gặp ở chó con và có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Nghiên cứu này nhằm mục đích làm rõ các đặc điểm bệnh lý và sinh học phân tử của CPV2, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc chẩn đoán và điều trị.

1.1. Đặc điểm sinh học của virus parvo type 2

Virus parvo type 2 là một loại virus thuộc họ Parvoviridae, có khả năng gây bệnh viêm ruột tiêu chảy ở chó. Virus này có cấu trúc đơn giản, với gen di truyền là DNA. Nghiên cứu cho thấy virus có thể tồn tại lâu trong môi trường, làm tăng nguy cơ lây lan.

1.2. Tình hình bệnh viêm ruột tiêu chảy ở miền Bắc Việt Nam

Tình hình bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ở miền Bắc Việt Nam đang gia tăng, với tỷ lệ mắc bệnh cao ở chó chưa tiêm phòng. Các nghiên cứu cho thấy chó từ 2-6 tháng tuổi là nhóm có nguy cơ cao nhất.

II. Triệu chứng và nguyên nhân gây bệnh viêm ruột tiêu chảy ở chó

Triệu chứng của bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 thường rất rõ ràng và bao gồm mệt mỏi, nôn mửa, tiêu chảy, và mất nước. Nguyên nhân chính gây ra bệnh này là do sự lây nhiễm của virus parvo, thường xảy ra qua đường tiêu hóa khi chó tiếp xúc với phân của chó nhiễm bệnh.

2.1. Triệu chứng lâm sàng của bệnh viêm ruột tiêu chảy

Chó mắc bệnh thường có triệu chứng như nôn mửa, tiêu chảy, và mệt mỏi. Các triệu chứng này có thể xuất hiện đột ngột và tiến triển nhanh chóng, dẫn đến tình trạng mất nước nghiêm trọng.

2.2. Nguyên nhân lây nhiễm virus parvo type 2

Virus parvo type 2 lây lan chủ yếu qua phân của chó nhiễm bệnh. Chó có thể bị nhiễm virus khi tiếp xúc với môi trường ô nhiễm hoặc khi ăn phải thức ăn, nước uống bị nhiễm virus.

III. Phương pháp điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo

Việc điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 cần được thực hiện kịp thời và hiệu quả. Các phương pháp điều trị bao gồm cung cấp dịch truyền, thuốc kháng sinh và thuốc chống nôn. Điều quan trọng là phải theo dõi tình trạng sức khỏe của chó để có biện pháp can thiệp kịp thời.

3.1. Các phương pháp điều trị chính

Điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 thường bao gồm việc cung cấp dịch truyền để bù nước và điện giải, cùng với việc sử dụng thuốc kháng sinh để ngăn ngừa nhiễm trùng thứ phát.

3.2. Vai trò của vắc xin trong phòng ngừa bệnh

Vắc xin là phương pháp hiệu quả nhất để phòng ngừa bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo. Tiêm phòng đầy đủ cho chó con giúp giảm nguy cơ mắc bệnh và bảo vệ sức khỏe cho chúng.

IV. Kết quả nghiên cứu về bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 ở chó tại miền Bắc Việt Nam là 15,86%. Đặc biệt, chó từ 2-6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất. Các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích điển hình đã được ghi nhận trong nghiên cứu.

4.1. Tỷ lệ mắc bệnh theo độ tuổi và giống

Kết quả nghiên cứu cho thấy chó con từ 2-6 tháng tuổi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất. Ngoài ra, giống chó cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh, với một số giống có nguy cơ cao hơn.

4.2. Bệnh tích và triệu chứng lâm sàng

Bệnh tích điển hình của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 bao gồm xuất huyết và sung huyết đường tiêu hóa. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu là mệt mỏi, nôn mửa và tiêu chảy.

V. Kết luận và triển vọng nghiên cứu về virus parvo type 2

Nghiên cứu về virus parvo type 2 ở chó tại miền Bắc Việt Nam đã cung cấp nhiều thông tin quan trọng về đặc điểm bệnh lý và sinh học phân tử của virus. Những thông tin này sẽ hỗ trợ cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn trong tương lai.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong y học thú y

Nghiên cứu này đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao nhận thức về bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo, từ đó cải thiện công tác phòng ngừa và điều trị bệnh cho chó.

5.2. Hướng nghiên cứu trong tương lai

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển vắc xin hiệu quả hơn và nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học phân tử của virus parvo type 2 để có thể ứng dụng trong thực tiễn.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Nghiên cứu bệnh lý truyền nhiễm trên động vật cảnh, đặc biệt là bệnh viêm ruột tiêu chảy cấp tính do Canine Parvovirus type 2 (CPV2) gây ra, là một trong những trọng tâm hàng đầu của ngành Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi. CPV2 là một loại virus DNA sợi đơn không vỏ bọc thuộc chi Protoparvovirus, họ Parvoviridae (loài Carnivore protoparvovirus 1), có tốc độ tiến hóa và biến dị di truyền nhanh chóng, đe dọa nghiêm trọng đến tỷ lệ sống sót của quần thể chó nuôi toàn cầu. Tại Việt Nam, sự biến động liên tục của các biến chủng kháng nguyên như CPV2a, CPV2b và CPV2c đặt ra yêu cầu cấp thiết phải giải mã toàn diện đặc điểm bệnh sinh học kết hợp với dịch tễ học phân tử.

Luận án tiến sĩ của Nghiên cứu sinh Võ Văn Hải (2023) tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam với đề tài: "Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam" đã giải quyết triệt để khoảng trống nghiên cứu (research gap) then chốt: sự thiếu hụt các công trình nghiên cứu hệ thống kết hợp đồng thời giữa bệnh lý đại thể, vi thể, sự phân bố virus trong mô bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) và giải trình tự toàn bộ hệ gen (whole-genome sequencing) của các chủng CPV2 thực địa.

Các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học được xác lập rõ ràng:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Đặc điểm lâm sàng, huyết học, sinh hóa máu và mức độ tổn thương bệnh lý đại thể, vi thể cũng như sự phân bố mô của CPV2 ở chó bệnh diễn ra như thế nào?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Cấu trúc di truyền của đoạn gen mã hóa protein vỏ VP2 và toàn bộ hệ gen của các chủng CPV2 đang lưu hành tại miền Bắc Việt Nam có những biến đổi nucleotide và acid amin nào so với các chủng tham chiếu quốc tế?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Mối quan hệ phả hệ phát sinh loài của các chủng virus parvo phân lập được phản ánh nguồn gốc tiến hóa và khả năng truyền lây chéo giữa các loài như thế nào?

Hệ thống giả thuyết tương ứng:

• Giả thuyết 1 (H1): CPV2 gây tổn thương phá hủy toàn thân có tính hướng mô cao đối với các tế bào có tốc độ phân chia nhanh (biểu mô ruột non, mô lympho, tủy xương), làm suy giảm nghiêm trọng chỉ số huyết học và biến đổi sinh hóa máu.
• Giả thuyết 2 (H2): Các chủng CPV2 thực địa tại miền Bắc mang các đột biến đặc trưng trên cả khung đọc mở mã hóa protein cấu trúc (VP) và phi cấu trúc (NS), hình thành nên phân nhóm di truyền đặc thù tại khu vực châu Á.
• Giả thuyết 3 (H3): Tồn tại hiện tượng virus giảm bạch cầu ở mèo (FPV) thích ứng và lây nhiễm trực tiếp trên chó nuôi tại Việt Nam, phản ánh tính linh hoạt vật chủ của chi Protoparvovirus.

Khung lý thuyết của luận án được xây dựng dựa trên Thuyết Tiến hóa biến dị Quasispecies của Parvovirus (Parrish, 1991; Truyen et al., 1996) và Mô hình Động lực học tế bào mầm ruột trong bệnh sinh virus (Hoskins, 1997; Pollock & Coyne, 1993). Phạm vi nghiên cứu được thực hiện trên các cá thể chó mắc bệnh và 12 chủng virus phân lập tại Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc trong giai đoạn 2017–2021, giải mã 12 trình tự gen VP2 và 8 trình tự toàn bộ bộ gen (chiều dài 4.269 nt), tạo nên một công trình có ý nghĩa khoa học và giá trị ứng dụng lâm sàng đột phá.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu Parvovirus trên chó ghi nhận bước ngoặt từ cuối thập niên 1970 khi CPV2 xuất hiện lần đầu (Appel et al., 1979; Kelly, 1978) thông qua đột biến chuyển giao vật chủ từ virus giảm bạch cầu ở mèo (Feline Panleukopenia Virus - FPV) hoặc một virus tương đồng từ động vật ăn thịt hoang dã. Nhánh lý thuyết sinh học phân tử (Tsao et al., 1991; Chapman, 1996; Reed et al., 1988) đã làm sáng tỏ cấu trúc không gian 3 chiều của capsid gồm 60 tiểu đơn vị hình thành từ protein VP1 và VP2. Quá trình chọn lọc tự nhiên đã dẫn truyền các biến thể kháng nguyên liên tiếp: CPV2a xuất hiện năm 1979 mang đột biến phục hồi khả năng nhân lên trên mèo (Parrish et al., 1985; Truyen et al., 1996); CPV2b phát hiện năm 1984 tại Mỹ với đột biến Asn426Asp (Parrish et al., 1991b); và biến thể CPV2c mang đột biến Asp426Glu được phát hiện tại Ý (Buonavoglia et al., 2001) và Đức (Decaro et al., 2006).

Các luồng học thuật quốc tế hiện tồn tại hai cuộc tranh luận lớn:

1. Tranh luận về sự thích ứng vật chủ và lây truyền chéo loài: Một trường phái cho rằng CPV2 sau khi đột biến ở các vị trí acid amin then chốt (aa 93, 103, 323 của VP2) đã phân ly hoàn toàn khỏi FPV về phạm vi ký chủ (Chang et al., 1992); trong khi các quan điểm hiện đại (Allison et al., 2013; Truyen et al., 1996) chứng minh tính dẻo dai di truyền cho phép sự tái trao đổi chéo giữa các loài thú ăn thịt.
2. Tranh luận về hiệu lực bảo hộ chéo của vắc xin: Wilson et al. (2014) bảo vệ quan điểm cho rằng vắc xin nhược độc chủng CPV2 hoặc CPV2b truyền thống đủ khả năng bảo hộ chéo chống lại biến chủng CPV2c; ngược lại, Decaro et al. (2007, 2012) chỉ ra rằng sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên tại đỉnh trục gấp 3 (epitope A) có thể làm giảm hiệu giá kháng thể trung hòa đối với các phân nhóm CPV2c mới.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây (Nakamura et al., 2004; Nguyễn Hương Quỳnh & Võ Tấn Đại, 2015; Đoàn Thị Thanh Hương et al., 2017; Hoàng Minh et al., 2019; Nguyễn Mạnh Tường et al., 2020) chủ yếu khảo sát dịch tễ học phân tử dựa trên đoạn gen cắt ngắn VP2 hoặc phân lập đơn lẻ. Luận án của Võ Văn Hải định vị chính xác vị trí học thuật tiên phong khi kết nối hoàn chỉnh dữ liệu lâm sàng - bệnh lý học thực nghiệm với bản đồ phân tử toàn diện.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế:

• So với nghiên cứu tại Ý của Mira et al. (2017) phân lập chủng CPV/IZSSI/2743/17 và Decaro et al. (2007), luận án chứng minh các chủng CPV2 tại miền Bắc Việt Nam có độ tương đồng di truyền cao (99,6% - 99,8%) và cùng thuộc phân nhóm tiến hóa Asia-4.
• So với các nghiên cứu tại Serbia (Milicevic et al., 2021: 60% CPV2a, 30% CPV2b, 10% CPV2c), Chile (Castillo et al., 2020: ưu thế CPV2c) và Ấn Độ (Raj et al., 2010; Nandi & Kumar, 2010: ưu thế New CPV2a), luận án khẳng định cấu trúc quần thể virus tại Việt Nam có tính độc thù cao, chịu áp lực chọn lọc địa lý và có sự đồng lưu hành của các chủng thuộc nhánh FPV.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng Thuyết Tương tác Thụ thể và Động lực học Nhiễm trùng của Trường phái Di truyền học Vi sinh (Truyen & Parrish), cung cấp các mệnh đề khoa học chuẩn xác:

• Mệnh đề 1 (P1): Sự tiến hóa của CPV2 không dừng lại ở các đột biến điểm đơn lẻ trên epitope A của gen VP2 (vị trí 426) mà diễn ra đồng thời trên toàn bộ khung đọc mở NS1/NS2 và VP1/VP2, củng cố tính ổn định thích nghi của phân nhóm genotype Asia-4.
• Mệnh đề 2 (P2): Tính hướng mô của CPV2 tuân theo quy luật ái lực tế bào phân bào cao, trong đó sự phá hủy tế bào mầm tại tuyến hẻm Lieberkühn trực tiếp dẫn truyền hội chứng suy sụp hàng rào niêm mạc ruột và mất protein huyết tương.
• Mệnh đề 3 (P3): Tồn tại sự dịch chuyển vật chủ tự nhiên khi virus FPV có khả năng nhân lên và gây bệnh lý viêm ruột thực sự trên chó mà không cần trải qua giai đoạn đột biến đầy đủ sang kiểu hình CPV2.

Phát hiện này đánh dấu sự chuyển dịch nhận thức (paradigm shift): khẳng định ranh giới lây nhiễm giữa virus parvo trên mèo và chó trong điều kiện thực địa nhiệt đới ẩm có tính mở rộng hơn so với các mô hình lý thuyết kinh điển trước đây.

Khung phân tích độc đáo

Luận án thiết lập khung phân tích tích hợp liên ngành gồm 3 trụ cột lý thuyết:

1. Lý thuyết Thâm nhập Tế bào qua Thụ thể Transferrin Type 1 (TfR1-Mediated Entry): Giải thích cơ chế xâm nhập và phá hủy có chọn lọc của virus.
2. Lý thuyết Bệnh sinh Học Vi thể và Rối loạn Nội môi (Histopathological & Homeostatic Pathogenesis): Kết hợp phân tích biến đổi huyết học, sinh hóa máu với tổn thương tổ chức học.
3. Lý thuyết Tiến hóa Phát sinh Loài Phân tử (Molecular Phylodynamics): Sử dụng các thuật toán tin sinh học căn chỉnh đa trình tự và suy diễn phả hệ.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                            KHUNG PHÂN TÍCH TÍCH HỢP                              |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
                                          |
         +--------------------------------+--------------------------------+
         |                                |                                |
         v                                v                                v
+--------------------+          +--------------------+          +--------------------+
|  TRỤ CỘT DỊCH TỄ   |          |  TRỤ CỘT BỆNH LÝ   |          | TRỤ CỘT PHÂN TỬ    |
| - Tỷ lệ nhiễm 15,86%|         | - Huyết học/Sinh hóa|         | - Giải trình tự VP2|
| - Nhóm tuổi (2-6 th)|         | - Đại thể/Vi thể   |          |   (12 chủng)       |
| - Tiêm chủng/Giống |          | - Hóa mô miễn dịch |          | - Toàn bộ hệ gen   |
|   (Khảo sát lâm sàng)         |   (9/9 cơ quan,IHC)|          |   (8 chủng,4269 nt)|
+--------------------+          +--------------------+          +--------------------+
         |                                |                                |
         +--------------------------------+--------------------------------+
                                          |
                                          v
+-----------------------------------------------------------------------------------+
|  TỔNG HỢP: XÁC LẬP BẢN ĐỒ BỆNH SINH VÀ CƠ CHẾ TIẾN HÓA GENOTYPE ASIA-4 & FPV TRÊN CHÓ|
+-----------------------------------------------------------------------------------+

Điều kiện biên (boundary conditions): Áp dụng cho các ca bệnh tự nhiên trên các giống chó nội, chó ngoại và chó lai tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng (miền Bắc Việt Nam) từ năm 2017 đến năm 2021.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ thế giới quan thực chứng (positivism) với phương pháp tiếp cận định lượng chặt chẽ. Thiết kế nghiên cứu đa tầng (multi-level design) kết nối 4 cấp độ:

• Cấp độ cá thể/lâm sàng: Đánh giá dịch tễ và triệu chứng bệnh.
• Cấp độ cơ quan/bệnh lý đại thể: Mổ khám xác định tổn thương hệ thống.
• Cấp độ tế bào/mô bệnh học: Phân tích tổn thương vi thể (nhuộm HE) và xác định vị trí virus (IHC).
• Cấp độ phân tử/genomic: Phản ứng PCR, giải trình tự Sanger và tin sinh học.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý dữ liệu được chuẩn hóa cao độ:

• Tiêu chuẩn chọn mẫu: Chó nghi mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy mang đến khám tại Hệ thống Thú y 2Vet tại Hà Nội, Bắc Giang, Bắc Ninh, Vĩnh Phúc. Chẩn đoán ban đầu bằng kit test kháng nguyên nhanh (CPV Ag Rapid Kit), sau đó khẳng định bằng kỹ thuật PCR theo khuyến cáo của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE, 2017).
• Mổ khám và mô bệnh học: Quy trình mổ khám đại thể tuân thủ nghiêm ngặt tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8402:2010 của Bộ Khoa học và Công nghệ. Tiêu bản vi thể được xử lý qua hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động và nhuộm Haematoxylin - Eosin (HE) thường quy tại Bộ môn Bệnh lý thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Nhuộm Hóa mô miễn dịch (IHC): Khử men peroxidase nội sinh bằng $H_2O_2$ trong dung môi Methanol (tỷ lệ 9:1), ủ kháng thể đặc hiệu kháng CPV mã hiệu LS-C57655 (hãng LSBio) ở nhiệt độ 4°C qua đêm, phát hiện tín hiệu màu bằng cơ chất Diaminobenzidine (DAB) và quan sát đối chứng dưới kính hiển vi quang học. Tín hiệu dương tính biểu hiện qua màu nâu vàng đặc trưng trong bào tương/nhân tế bào.
• Kỹ thuật sinh học phân tử: Tách chiết DNA bằng bộ kit thương mại QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Khuếch đại các đoạn gen chỉ thị bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi CPV-555 (kích thước sản phẩm 583 bp) và 8 cặp mồi chuyên biệt bao phủ toàn bộ vùng gen VP và NS. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose, tinh sạch và giải trình tự trực tiếp theo phương pháp Sanger.

+-----------------------------------------------------------------------------------+
|                        SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM RIGOROUS                       |
+-----------------------------------------------------------------------------------+
  [Chó nghi nhiễm VRTC] ---> [Kit Test Nhanh CPV Ag] ---> [Khẳng định PCR (OIE 2017)]
                                                                  |
         +--------------------------------------------------------+
         |
         +---> [Phân tích Huyết học & Sinh hóa Máu tự động (n=36)]
         |
         +---> [Mổ khám Bệnh lý Đại thể theo TCVN 8402:2010]
         |          |
         |          +---> [Nhuộm HE mô bệnh học vi thể]
         |          +---> [Nhuộm Hóa mô miễn dịch IHC (Kháng thể LS-C57655 + DAB)]
         |
         +---> [Tách chiết DNA (QIAamp DNA Mini Kit) -> PCR 8 cặp mồi]
                    |
                    +---> [Giải trình tự Sanger]
                    +---> [BioEdit, Geneious Prime, MEGA X (Neighbor-Joining, 1000 BP)]

Data và phân tích

• Dữ liệu huyết học và sinh hóa được phân tích trên nhóm mẫu nghiên cứu chuyên sâu ($n = 36$).
• Căn chỉnh và so sánh trình tự nucleotide và acid amin bằng phần mềm Geneious Prime và BioEdit.
• Xây dựng cây phả hệ sinh thái phân tử (phylogenetic trees) bằng phần mềm MEGA X, sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với hệ số kiểm định Bootstrap 1.000 lần lặp lại, so sánh với các trình tự tham chiếu chuẩn toàn cầu trích xuất từ cơ sở dữ liệu GenBank.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Dịch tễ học và đặc điểm lâm sàng - huyết học: Tác giả ghi nhận "Tỷ lệ chó mắc VRTC do CPV2 được chẩn đoán bằng kit test nhanh là 15,86%". Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất tập trung ở nhóm chó non từ 2 đến 6 tháng tuổi, chiếm đa số ở những cá thể chưa được tiêm phòng vắc xin đầy đủ. Phân tích huyết học ($n=36$) chỉ ra tình trạng thiếu máu nặng (hồng cầu, hemoglobin và hematocrit giảm sâu), giảm tiểu cầu rõ rệt và suy giảm bạch cầu lympho do sự phá hủy trực tiếp các mô tạo máu và mô lympho. Xét nghiệm sinh hóa cho thấy sự gia tăng mạnh mẽ của men gan AST (72,2%) và ALT (63,8%), tăng ure máu (43,4%) do giảm tưới máu thận và hạ albumin máu trầm trọng do thất thoát qua mao mạch ruột.

2. Bệnh lý học đại thể, vi thể và phân bố virus toàn thân: Tổn thương đại thể điển hình là viêm ruột xuất huyết cata cấp tính, lòng ruột chứa đầy dịch nhầy lẫn máu tanh nồng, hạch màng treo ruột sưng to, ứ huyết và lách nhồi huyết hoại tử mép. Tiêu bản vi thể bộc lộ sự bong tróc, đứt nát toàn bộ biểu mô lông nhung ruột, teo rỗng nang tuyến Lieberkühn, hoại tử nang lympho và thoái hóa tế bào cơ tim. Đặc biệt, nghiên cứu đưa ra bằng chứng thực nghiệm trực tiếp: "Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy CPV2 được phát hiện ở 9/9 cơ quan chó mắc bệnh. Trong đó, tất cả các mẫu ruột, hạch lympho và gan 100% cho kết quả dương tính với kháng nguyên CPV2". Đây là minh chứng khẳng định CPV2 là bệnh lý nhiễm trùng toàn thân chứ không đơn thuần khu trú tại đường tiêu hóa.

3. Phát hiện đột phá về hiện tượng truyền lây virus FPV từ mèo sang chó: Phân tích phả hệ dựa trên vùng gen VP2 của 12 chủng phân lập xác định 9/12 chủng (VNUA/C17, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380-Hanoi, VNUA/CPV384-BN, VNUA/CPV385-HNa) thuộc nhóm Parvovirus ở chó. Đột phá quan trọng nhất: "3/12 chủng còn lại là VNUA/C31, VNUA/C32 và VNUA/C35 nằm trên nhánh phát sinh của các chủng vi rút parvo gây bệnh cho mèo và có mối quan hệ gần gũi với các chủng vi rút parvo phân lập được trên mèo ở Trung Quốc (mã số truy cập ngân hàng GenBank: DQ474235, DQ474237, KY094114). Phát hiện này là bằng chứng quan trọng cho thấy có sự truyền lây vi rút giảm bạch cầu từ mèo sang chó".

4. Giải mã toàn bộ hệ gen và xác lập phân nhóm Genotype Asia-4: Công trình đã thực hiện giải mã hoàn chỉnh hệ gen của 8 chủng CPV2 thực địa: "kết quả giải trình tự hệ gen 8/12 chủng CPV2 cho thấy trình tự hệ gen của các chủng CPV2 trong nghiên cứu này có chiều dài là 4269 nucleotide (nt), bao gồm hai khung đọc mở (ORF) mã hóa cho gen phi cấu trúc (NS: 2007 nt) và gen cấu trúc (VP: 2262 nt), trong đó đoạn gen VP2 có chiều dài 1755 nt". Phân tích phát sinh loài hệ gen chứng minh tất cả 8 chủng này đều thuộc nhánh genotype Asia-4, có quan hệ họ hàng rất gần gũi với các chủng phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2017–2018 (GenBank: MT106228 – MT106237, Nguyen Manh et al., 2020) và chủng CPV/IZSSI/2743/17 phân lập tại Ý năm 2017 (Mira et al., 2017).

Chỉ tiêu / Chủng phân lập	Đặc tính di truyền / Bệnh lý	Chiều dài đoạn gen (nt)	Nhánh phát sinh loài (Phylogeny)	Bằng chứng đối chiếu quốc tế
9 chủng CPV2 thực địa	Canine Parvovirus	VP2: 1.755 nt	Nhánh Canine Parvovirus	Tương đồng cao chủng châu Á
3 chủng (C31, C32, C35)	Feline Panleukopenia Virus	VP2: 1.755 nt	Nhánh Feline Parvovirus	GenBank DQ474235, DQ474237, KY094114 (Trung Quốc)
8 chủng hệ gen hoàn chỉnh	CPV2 bộ gen đầy đủ	Hệ gen: 4.269 nt (NS: 2.007, VP: 2.262)	Genotype Asia-4	Chủng Ý CPV/IZSSI/2743/17 và VN 2017-2018 (MT106228-37)
Khảo sát IHC (9/9 cơ quan)	Nhiễm trùng toàn thân	Tổ chức học	Dương tính 100%	Ruột, hạch lympho, gan (100% tế bào dương tính)

Implications đa chiều

• Tiến bộ lý thuyết: Cung cấp dữ liệu di truyền học hoàn chỉnh về bộ gen CPV2 phân nhóm Asia-4, đóng góp nguồn dữ liệu tham chiếu quan trọng vào ngân hàng gen quốc tế GenBank, làm sáng tỏ cơ chế biến dị đồng thời trên cả protein cấu trúc và phi cấu trúc.
• Đổi mới phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán kết hợp giữa giải phẫu bệnh học kinh điển (TCVN 8402:2010), nhuộm hóa mô miễn dịch độ nhạy cao với kháng thể LS-C57655 và giải trình tự Sanger toàn hệ gen.
• Ứng dụng lâm sàng thú y: Bác sĩ lâm sàng cần thay đổi phác đồ điều trị: không chỉ bù nước điện giải đơn thuần (Ringer Lactate) mà bắt buộc phải kiểm soát sốc nhiễm trùng/nội độc tố, truyền huyết tương tươi đông lạnh (FFP) hoặc dung dịch keo nhân tạo (Hetastarch/Dextran 70) khi albumin hạ dưới 20 g/L, phối hợp kháng sinh chống nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram âm đường ruột (E. coli) và bổ sung kháng thể đặc hiệu/Interferon-omega.
• Định hướng sản xuất sinh phẩm và vắc xin: Dữ liệu hệ gen của 8 chủng Asia-4 và phát hiện về FPV trên chó là nền tảng khoa học cốt lõi để các viện nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất vắc xin trong nước tái thiết kế kháng nguyên vắc xin, tránh nguy cơ thất bại bảo hộ do trôi dạt kháng nguyên.

Limitations và Future Research

Luận án thẳng thắn thừa nhận 3 hạn chế chính:

1. Phạm vi địa lý mẫu nghiên cứu: Mẫu bệnh phẩm mới chỉ tập trung tại 4 tỉnh/thành phố khu vực miền Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang, Vĩnh Phúc), chưa bao phủ toàn diện các vùng sinh thái Nam Trung Bộ và Tây Nam Bộ.
2. Thiếu vắng thử nghiệm trung hòa virus in vitro (Virus Neutralization Test): Chưa đánh giá trực tiếp hiệu giá kháng thể trung hòa chéo của huyết thanh chó đã tiêm vắc xin thương mại đối với các chủng phân lập mới thuộc genotype Asia-4 và các chủng mang gen FPV.
3. Giới hạn cỡ mẫu hệ gen hoàn chỉnh: Mới giải mã toàn bộ hệ gen của 8/12 chủng phân lập do hạn chế về nguồn lực kỹ thuật và chi phí sinh học phân tử thời điểm thực hiện.

Chương trình nghiên cứu tiếp nối khuyến nghị 4 hướng ưu tiên:

• Mở rộng mạng lưới giám sát dịch tễ phân tử CPV2 và FPV trên phạm vi toàn quốc với công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS).
• Thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm có đối chứng các chủng FPV phân lập từ chó (chủng C31, C32, C35) trên chó thí nghiệm để đánh giá độc lực và cơ chế liên kết thụ thể TfR1.
• Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán Real-time PCR đa mồi (Multiplex Real-time PCR) có khả năng phân biệt đồng thời các phân nhóm CPV2a, 2b, 2c và FPV.
• Phát triển ứng viên vắc xin tái tổ hợp đa giá mang cấu trúc kháng nguyên đặc thù của phân nhóm genotype Asia-4 lưu hành tại Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Luận án là tài liệu tham khảo chính thống, toàn diện đầu tiên tại Việt Nam về mối tương quan giữa bệnh lý vi thể - hóa mô miễn dịch và hệ gen phân tử CPV2, mở ra các trích dẫn giá trị cho các nghiên cứu dịch tễ học so sánh quốc tế.
• Tác động ngành thú y và R&D: Thúc đẩy chuyển đổi quy trình điều trị tại các bệnh viện thú y tư nhân và công lập; cung cấp chủng giống đạt chuẩn phục vụ nghiên cứu vắc xin nhượng quyền sinh học.
• Tác động chính sách và an toàn sinh học: Cung cấp cơ sở khoa học cho Cục Thú y và các cơ quan quản lý dịch tễ xây dựng quy chế kiểm dịch động vật cảnh nghiêm ngặt, ngăn chặn sự lây lan xuyên biên giới của các biến thể virus mới.
• Bảo vệ sức khỏe cộng đồng và động vật: Giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người nuôi chó cưng, bảo đảm an sinh động vật và hỗ trợ chiến lược Một Sức Khỏe (One Health) trong việc kiểm soát các mầm bệnh truyền lây đa loài.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Thú y: Tiếp cận khung phương pháp nghiên cứu mẫu mực, quy trình mổ khám TCVN 8402:2010 kết hợp phân tích tin sinh học phân tử (MEGA X, Geneious Prime).
• Các nhà khoa học, chuyên gia virus học: Khai thác dữ liệu 8 trình tự toàn bộ hệ gen CPV2 (4.269 nt) và 12 trình tự VP2 để nghiên cứu tiến hóa phân tử và cấu trúc vỏ capsid.
• Bác sĩ thú y lâm sàng: Cập nhật hướng dẫn chẩn đoán phân biệt, tiên lượng dựa trên chỉ số huyết học/sinh hóa máu và thiết lập phác đồ hồi sức tích cực đa mô thức.
• Các nhà sản xuất vắc xin và kit chẩn đoán sinh học: Sở hữu căn cứ thực chứng để lựa chọn chủng virus mục tiêu, tối ưu hóa độ nhạy của kit chẩn đoán nhanh và vắc xin bảo hộ.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào? Trả lời: Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc mở rộng Thuyết Tiến hóa Thích ứng Vật chủ (Host Adaptation Theory của Truyen & Parrish) thông qua việc phát hiện 3 chủng virus mang đặc trưng di truyền của FPV ở mèo (VNUA/C31, C32, C35) gây bệnh viêm ruột tiêu chảy tự nhiên trên chó, phá vỡ quan niệm trước đây về tính đặc hiệu vật chủ tuyệt đối của FPV nguyên thủy.

2. Đổi mới phương pháp luận của công trình so với các nghiên cứu trước đây là gì? Trả lời: So với nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Tường et al. (2020) (chỉ tập trung PCR giải trình tự) và Đặng Thị Mai Lan et al. (chỉ khảo sát triệu chứng lâm sàng), luận án của Võ Văn Hải là công trình đầu tiên tại Việt Nam tích hợp tam giác phương pháp luận: mổ khám chuẩn hóa TCVN 8402:2010 - Nhuộm hóa mô miễn dịch IHC với kháng thể LS-C57655 chứng minh virus ở 9/9 cơ quan - Giải trình tự toàn bộ hệ gen (4.269 nt) phân tích genotype Asia-4.

3. Phát hiện nào trong dữ liệu thực nghiệm gây bất ngờ nhất? Trả lời: Phát hiện 100% mẫu ruột, hạch lympho và gan dương tính với kháng nguyên CPV2 qua nhuộm IHC, đồng thời xác nhận tổn thương thoái hóa không bào tại tế bào ống thận và phù phế nang phổi, chứng minh bản chất gây bệnh phá hủy toàn thân của CPV2 chứ không giới hạn ở hội chứng ruột cục bộ.

4. Quy trình nghiên cứu có cung cấp đầy đủ giao thức để lặp lại (Replication Protocol)? Trả lời: Hoàn toàn đầy đủ. Luận án mô tả chi tiết thông số: bộ kit tách chiết QIAamp DNA Mini Kit, các cặp mồi khuếch đại gen VP/NS, chu trình nhiệt PCR OIE 2017, hóa chất nhuộm HE, nồng độ kháng thể IHC LS-C57655, cơ chất DAB, phương pháp giải trình tự Sanger và tham số thuật toán Neighbor-Joining (Bootstrap 1.000) trên phần mềm MEGA X.

5. Luận án đã phác thảo chương trình nghiên cứu 10 năm tới như thế nào? Trả lời: Định hình lộ trình 10 năm gồm: (1) Thiết lập ngân hàng giám sát dịch tễ học phân tử CPV2/FPV quốc gia; (2) Giải mã cơ chế liên kết tinh thể học giữa vỏ protein VP2 chủng Asia-4 với thụ thể TfR1 trên chó; (3) Sản xuất thương mại hóa vắc xin tiểu đơn vị hoặc vắc xin nhược độc thế hệ mới mang cấu trúc di truyền chủng virus bản địa Việt Nam.

Kết luận

1. Khảo sát thực địa xác định tỷ lệ nhiễm CPV2 trên chó mắc hội chứng viêm ruột tiêu chảy tại miền Bắc Việt Nam là 15,86%, tập trung chủ yếu ở chó non 2–6 tháng tuổi chưa được gây miễn dịch.
2. Thiết lập bức tranh bệnh lý học toàn diện: bệnh gây thiếu máu nặng, giảm tiểu cầu, tăng men gan AST/ALT, teo đứt lông nhung ruột non và hoại tử nang lympho; kỹ thuật IHC chứng minh sự hiện diện của virus tại 9/9 cơ quan, trong đó ruột, hạch và gan đạt tỷ lệ dương tính 100%.
3. Phát hiện 3/12 chủng virus phân lập (VNUA/C31, C32, C35) thuộc nhánh Feline Panleukopenia Virus (FPV) có quan hệ gần gũi với các chủng mèo tại Trung Quốc (GenBank: DQ474235, DQ474237, KY094114), cung cấp bằng chứng rõ ràng về sự truyền lây chéo FPV từ mèo sang chó.
4. Giải mã thành công toàn bộ hệ gen chiều dài 4.269 nt của 8 chủng CPV2 thực địa (gồm hai khung đọc mở NS: 2.007 nt và VP: 2.262 nt), xác định các đột biến thế nucleotide trên cả vùng gen cấu trúc và phi cấu trúc.
5. Chứng minh 8 chủng CPV2 giải mã hệ gen đều thuộc phân nhóm tiến hóa genotype Asia-4, đồng nhánh với các chủng phân lập tại Việt Nam giai đoạn 2017–2018 và chủng CPV/IZSSI/2743/17 của Ý.
6. Mở ra hướng nghiên cứu mới về dịch tễ học liên loài (chó - mèo) và cung cấp cơ sở khoa học nền tảng cho công tác phát triển sinh phẩm chẩn đoán và vắc xin phòng bệnh đặc hiệu tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TYPE 2 (CPV2) GÂY RA VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG CPV2 LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TYPE 2 (CPV2) GÂY RA VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG CPV2 LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 Người hướng dẫn: HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.

đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học VNUA đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Hệ thống thú y 2Vet đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. ii Mục lục. iii Danh mục chữ viết tắt. vi Danh mục bảng.

viii Danh mục hình. ix Trích yếu luận án. xi Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu.

Mục tiêu nghiên cứu. Mục tiêu tổng quát. Mục tiêu cụ thể. Phạm vi nghiên cứu.

Đối tượng nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Các đóng góp mới của đề tài.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học. Ý nghĩa thực tiễn. Tổng quan tài liệu.

Đặc điểm sinh học của vi rút parvo. Cấu tạo chung. Vị trí xếp loại. Nguồn gốc của các chủng CPV2.

Bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo trên chó. Dịch tễ học. Triệu chứng lâm sàng. Phòng bệnh.

Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới. Các nghiên cứu trong nước. Các nghiên cứu trên thế giới. Nội dung và phương pháp nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của những chủng vi rút parvo phân lập được. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu.

Phương pháp nghiên cứu. Phương pháp thu thập số liệu trực tiếp tại phòng khám. Phương pháp xác định chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Phương pháp làm các xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu chó bị bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2.

Phương pháp mổ khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch. Phương pháp PCR.

Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR. Phương pháp giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận.

Kết quả nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của CPV2 trên chó. Tỷ lệ mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ở chó theo từng địa phương. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo lứa tuổi. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giống.

Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giới tính. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo tình trạng tiêm chủng. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2.

Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Kết quả xác định sự phân bố của vi rút parvo ở một số cơ quan của chó mắc bệnh. Kết quả phân tích một số đặc tính sinh học phân tử của CPV2 gây bệnh ở chó tại một số tỉnh Miền Bắc Việt Nam.

Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của gen VP2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của bộ gen CPV2. Kết luận và kiến nghị. Đặc điểm bệnh lý của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2.

Kết quả phân tích đặc điểm sinh học phân tử của CPV2. 109 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án. 111 Tài liệu tham khảo. 128 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt & Và aa Amino acid (A xít amin) Ala Alanine Arg Arginine Asn Asparagine Asp Aspartic acid CCoV Canine corona virus CDV Canine distemper virus CPV Canine parvo virus (vi rút parvo gây bệnh trên chó) CPV2 Canine parvo virus type 2 (vi rút parvo type 2 gây bệnh trên chó) CRoV Canine rota virus Cs Cộng sự Cys Cysteine DAB Diamino benzindin (cơ chất DAB) DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium (môi trường DMEM) DNA Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) EDTA Ethylene Diamine Tetracetic Acid (A xít etylenediaminetetraacetic) ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (phương pháp miễn dịch gắn enzyme) FFP Fresh Frozen Plasma (Huyết thanh tươi đông lạnh) Gln Glutamine Glu Glutamic acid Gly Glycine HA Haemagglutination (Phản ứng ngưng kết hồng cầu) HE Haematoxylin - Eosin (Thuốc nhuộm tiêu bản bệnh lý) His Histidine IHC Immuno Histochemistry (Hóa mô miễn dịch tổ chức) Ile Isoleucine IV Tiêm tĩnh mạch Leu Leucine Lys Lysine Met Methionine vi Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt NPO Nil per os (Phương pháp cho ăn không qua miệng) nt Nucleotide PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) Pro Proline Phe Phenylalanine RNA Ribonucleic acid (A xít ribonucleic) RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp có dùng enzym phiên mã ngược) s giây SC Tiêm dưới da Ser Serine Tyr Tyrosin Thr Threonine Trp Tryptophan Val Valine VRTC Viêm ruột tiêu chảy vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.

Thông tin mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động. Hệ thống nhuộm lần 1. Hệ thống nhuộm lần 2.

Thành phần của phản ứng PCR. Thông tin các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo địa phương. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo lứa tuổi.

Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giống. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giới tính. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo tình trạng tiêm vắc xin. Chỉ tiêu sinh lý máu của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (n=36).

Chỉ tiêu sinh hóa máu của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (n=36). Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2.

Kết quả phát hiện tế bào dương tính với kháng nguyên là CPV2. Thông tin mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nucleotide (nt) của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác. Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự amino acid (aa) của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác.

Tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide (nt) (dưới đường chéo) và amino acid (aa) (trên đường chéo) của 8 chủng CPV2 trong nghiên cứu này với các chủng CPV2 tham chiếu khác. So sánh trình tự nt và aa của 8 chủng CPV2 trong nghiên cứu này với các chủng CPV2 tham chiếu khác. 101 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2. Mô tả quá trình tiến hoá của CPV2 ở chó.

Sự phân bố của các chủng CPV2 ở chó trên thế giới. Chó bị viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (hình trái) và kết quả chẩn đoán bằng kit test nhanh (hình phải). Tình trạng tiêm vắc xin trên chó mắc viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo gây ra. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do vi rút parvo.

Điện di sản phẩm PCR xác định CPV2 trên gel agarose. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể ở hệ thống hạch bạch huyết và đường tiêu hoá của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể ở các cơ quan khác của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Tổn thương vi thể ruột của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2.

Tổn thương vi thể của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2. Hình ảnh kháng nguyên của vi rút CPV2 phát hiện ở các tế bào của chó mắc bệnh. Kết quả chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm. So sánh trình tự nucleotide của gen VP2 giữa 12 chủng vi rút parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng vi rút parvo tham chiếu khác (1) .