ĐẶT VẤN ĐỀ Artemisinin (ATN) và các dẫn chất như artesunat (ART) là sản phẩm của quá trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L. Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư [26]. Tuy nhiên, ART là dược chất không bền, độ ổn định phụ thuộc nhiều vào các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH cũng như dung môi trong quá trình bào chế và bảo quản. Do đó, nhằm tăng độ ổn định cũng như sinh khả dụng, công nghệ nano có thể được áp dụng.
Các dạng bào chế chứa TP nano có khả năng giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lượng và khoảng thời gian như dự kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, kết quả làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính cho cơ thể người bệnh [58]. Bên cạnh liposome, TP nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế nano thu hút được khá nhiều nghiên cứu. Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học được sử dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm soát và duy trì giải phóng dược chất, độc tính thấp, tương thích sinh học với nhiều mô và tế bào [116]. Ngoài ra, các polyme thân nước như chitosan (CS) hay PEG có thể được sử dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) PLGA như tăng cường sự bám dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tương tác bắt giữ bởi các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dược chất [44].
Trên cơ sở đó, luận án đã được thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm: 1. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 2. Xây dựng được công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm; 3. Đề xuất được tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat; 4.
Đánh giá được tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro và in vivo của tiểu phân nano artesunat. Đại cƣơng về artesunat 1. Công thức - Công thức cấu tạo CH3 H H3C O O H O H O CH3 OCOCH2 CH2 COOH Hình 1. Công thức cấu tạo của ART - Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano (4,3 – j) - 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol, hydrogen sucinat.
- Tên khác: Dihydroartemisinin-12-alpha-succinat; Succinyl dihydro- artemisinin; Quinghaosu reduced succinat este. - Công thức phân tử: C19H28O8 - Khối lượng phân tử: 384,4 g/mol [1]. Tính chất vật lý Bột kết tinh trắng mịn. Tan được trong nước (khoảng 56,2 mg/l ở 25oC), tan tốt trong dicloromethan (DCM), ethanol và aceton.
ART là một acid yếu có pKa bằng 4,6, có hệ số phân bố dầu/nước thay đổi theo các giá trị pH khác nhau, ngoài ra, ART có khả năng tan một phần trong nước ở pH=7,4 do logD7,4 nhỏ nên có thể thích hợp với dạng thuốc tiêm khi chuyển qua dạng muối (như dạng muối kiềm natri). Ở dạng thuốc tiêm, acid artesunic được dùng kết hợp với natri hydrocarbonat để tạo dạng muối natri artesunat ngay trước khi tiêm [1], [20]. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm Là dẫn chất este của ATN, ART kém ổn định ở nhiệt độ cao và sự có mặt của ẩm.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ART kém ổn định khi tăng nhiệt độ; ví dụ trong 2 dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) khi bảo quản ở 9oC, 23oC, 36,5oC thì thời gian ổn định của ART lần lượt là 130 giờ, 10,6 giờ và 1,6 giờ [24]. Độ ổn định của ART đạt được tối đa khi bảo quản thuốc ở 2-8oC [12]. Đồng thời, độ ổn định của ART bị ảnh hưởng mạnh khi có độ ẩm cao. Hàm lượng ART giảm nhanh trên 2%/năm khi bảo bảo quản nguyên liệu ART ở nhiệt độ 30-35oC và độ ẩm tương đối (gọi tắt là độ ẩm) 80-90% [6].
Quá trình phân hủy của thuốc được chứng tỏ có liên quan nhiều đến độ ẩm hơn, ví dụ khi bảo quản ở nhiệt độ 50oC và độ ẩm 60%, thuốc ít bị phân hủy hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ 40oC và độ ẩm 75% [12]. Khi nghiên cứu sự ổn định của ART trong môi trường huyết tương, nhiệt độ cao cũng làm ART kém ổn định. Ví dụ, khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC, ART có thể ổn định đến 6 ngày so với 5 giờ ở nhiệt độ phòng (24oC), ở -25oC cho thấy không có sự phân hủy sau 8 tháng [24]. Thời gian bảo quản càng lâu càng dẫn đến sự phân hủy ART, ví dụ ở nhiệt độ 4oC, sau 2, 3, 6 tháng bảo quản thì hàm lượng dược chất lần lượt giảm đến 6-18%, 25-37% và 59-80%; ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ giữa ART và dihydroartemisinin (DHA) càng giảm khi thời gian bảo quản càng kéo dài [102].
Do đó, bột khô là dạng thích hợp nhất để bảo quản như đối với công thức bào chế thuốc tiêm chứa ART để hạn chế sự không ổn định hoặc công thức chỉ được phối trộn với nước ngay trước khi sử dụng. Ngoài ra công thức cần được bào chế trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và độ ổn định cần được kiểm tra trong quá trình sản xuất dưới điều kiện kiểm soát độ ẩm và bao gói trong các bao bì tránh ẩm [12]. Ảnh hưởng của pH và xúc tác acid-base nói chung Một số thuốc chịu sự phân hủy trong dung dịch khi cho thêm acid hay base. Phụ thuộc vào pKa, hầu hết các thuốc thường tồn tại ở dạng muối của acid hay base yếu.
Do đó, trong dung dịch nước, các phân tử thuốc sẽ phân ly một phần hay hoàn toàn. Mặc dù các hệ đệm thường được dùng trong các dung dịch dược phẩm để điều chỉnh pH của dung dịch nhưng một vài hệ sẽ xúc tác quá trình phân hủy. Các thuốc có nhóm este succinat trong cấu trúc phân tử như ART có thể bị thủy phân khi có mặt nước. Đặc biệt quá trình thủy phân sẽ được thúc đẩy bởi sự hiện diện nhiều hơn của nồng độ ion hydro hoặc hydroxyl hoặc bởi xúc tác acid-base nói chung của hệ đệm.
3 Nói chung, ART kém ổn định ở pH acid. ART thủy phân đáng kể khi pha loãng với dung dịch glucose 5% kl/tt với pH thấp khoảng bằng 5 [24]. Đồng thời, mặc dù tan được trong dung dịch kiềm tuy nhiên lại dễ thủy phân tạo DHA, ví dụ hàm lượng ART giảm còn 92-93% khi đông khô dung dịch ART có pH 9,1-9,5 [2]. Do vậy, các nghiên cứu chỉ ra rằng, giá trị pH để duy trì ổn định của ART nên nằm trong khoảng từ 7,5-8,5 như ở pH 8,2 khi đông khô dung dịch ART, hàm lượng ART vẫn duy trì bằng 98,4% gần như ban đầu [2], thuốc ổn định nhất tại đệm phosphat pH 8 trong điều kiện nhiệt độ 2-8oC và 25oC với hàm lượng còn lại sau 1 tuần lần lượt là 94,5 ± 0,2% và 94,6 ± 0,8% [12].
Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau Các nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của các dung môi khan nước đến sự ổn định của ART như ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO), PEG 400,… Việc sử dụng ethanol có thể giảm tốc độ phân hủy của ART như quá trình phân hủy chỉ xảy ra sau 3 tháng ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên tạo nhiều sản phẩm khác nhau [71]. Đối với PEG 400, quá trình phân hủy xảy ra chỉ sau 1 tháng tuy nhiên DHA là chất phân hủy duy nhất, đồng thời là chất chống sốt rét khá hiệu quả. Do đó, PEG 400 là tá dược có thể đáng quan tâm do chỉ tạo mỗi DHA [71]. Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các hệ dung môi khác nhau đến sự phân hủy của ART trong quá trình bào chế thuốc tiêm đông khô ART.
Các dung môi được sử dụng trong khảo sát bao gồm dung môi số 1, nước cất, ethanol, DMSO, hoặc hỗn hợp các dung môi. Kết quả hỗn hợp dung môi số 1 và nước cất được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu vì có khả năng hòa tan các thành phần trong công thức và đảm bảo tránh sự phân hủy dược chất [2]. Các phương pháp định lượng artesunat - Phương pháp quang phổ UV-Vis: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng thủy phân trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 50 1 oC trong 60 phút tạo ra sản phẩm phân hủy có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 289 1 nm [1]. - Phương pháp quang phổ huỳnh quang: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng tạo chất huỳnh quang màu nâu xanh với hỗn hợp acid acetic và acid sulfuric (tỉ lệ 2:1) ở nhiệt độ cao 100oC trong 5 phút.
Bước sóng kích thích là 303 nm và bước sóng phát xạ tương ứng của ART trong methanol là 609 nm [138]. 4 - Phương pháp acid – base: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng acid – base với dung dịch NaOH 0,05 M, dùng 2 giọt phenolphthalein/ethanol làm chất chỉ thị [166]. - Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Với nguyên tắc sắc ký sử dụng hệ pha động bao gồm acetonitril và đệm phosphat pH 3, với cột sắc ký pha đảo C18, detector: UV 216 nm [156]. - Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS/MS): Với nguyên tắc định lượng ART và DHA trong huyết tương người dựa trên quá trình kết tủa protein bằng acetonitril, sử dụng ATN làm chất chuẩn nội, sau đó tiến hành phương pháp sắc ký lỏng qua cột C18 trước khi vào bộ phận khối phổ tứ cực chập ba [72].
Tác dụng ức chế tế bào ung thư 1. In vitro Artemisinin và các dẫn chất của nó (ATNs), trong đó bao gồm cả ART có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư như: Tế bào ung thư xương (dòng có tình trạng đột biến p53 khác nhau, HOS) [43]; Tế bào u não hình sao (U373MG) [124]; Tế bào ung thư thần kinh chưa trưởng thành (UKF-NB-3, UKF-NB-6, IMR-32) [114]; Tế bào ung thư sắc tố da (A375P, A375M, G361, LOX); Tế bào mô liên kết (HT-1080); Tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung (Hela); Tế bào bị bất diệt/chuyển dạng bởi Human papillomavirus; Tế bào ung thư biểu mô màng trong dạ con (HEC- 1B); Tế bào ung thư tuyến tụy (BxPC3, MiaPaCa-2), Tế bào ung thư trực tràng (CLY, HT29) [43].
