Luận án nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng góp tri thức mới cho ngành.

• Tác giả: Nguyễn Thị Ngọc
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Đình Luyện
• Trường học: Trường Đại Học Dược Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Dược Phẩm & Bào Chế Thuốc
• Đề tài: Nghiên Cứu Quy Trình Tổng Hợp Afatinib Dimaleat
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. Tổng quan về afatinib dimaleat
• 2.1. Cấu trúc và tính chất hóa lý
• 2.2. Tác dụng dược lý và ứng dụng trong điều trị
• 2.3. Các phương pháp tổng hợp afatinib dimaleat
• 2.3.1. Tổng hợp afatinib base
• 2.3.2. Tạo muối afatinib dimaleat
• 2.4. Tổng quan về yêu cầu chất lượng của nguyên liệu afatinib dimaleat
• 2.5. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp khung quinazolin
• 2.5.1. Phương pháp ngưng tụ acid anthranilic với formamid
• 2.5.2. Phương pháp ngưng tụ aminobenzophenon với benzylamin
• 2.5.3. Phương pháp ngưng tụ giữa (2-bromophenyl)methylamin với amid
• 2.5.4. Phương pháp ngưng tụ giữa N-arylamidin và isonitril
• 2.5.5. Phương pháp ngưng tụ với DMF-DMA qua trung gian base Schiff
• 2.5.6. Phương pháp tổng hợp khung quinazolin thông qua gốc tự do
• 2.5.7. Phương pháp tổng hợp dựa trên chuyển vị quang hóa Fries
• 2.5.8. Phương pháp đóng vòng hợp chất pyrimidin enediyn
• 2.5.9. Phương pháp tổng hợp quinazolin theo Niementowski
• 2.5.10. Phương pháp ngưng tụ acetanilid với urethan
• 2.5.11. Phương pháp ngưng tụ axit N-acylanthranilic với các amin
• 2.5.12. Phương pháp ngưng tụ 2-(4,5-dihydro-1H-imidazol-2-yl)anilin với cyanogen bromid
• 2.6. Một số phương pháp tổng hợp amid từ amin thơm và ứng dụng trong tổng hợp thuốc
• 2.6.1. Tổng hợp amid từ acid carboxylic
• 2.6.2. Tổng hợp amid từ halogenid acid
• 2.6.3. Tổng hợp amid từ anhydrid
• 2.6.4. Tổng hợp amid từ nguyên liệu ester
• 2.6.5. Tổng hợp amid theo phản ứng trao đổi amid
• 2.6.6. Tổng hợp amid từ nguyên liệu alcol
• 2.6.7. Tổng hợp amid từ các nguyên liệu khác
• 2.7. Phân tích và lựa chọn con đường tổng hợp
• 2.7.1. Lựa chọn con đường tổng hợp afatinib dimaleat
• 2.7.2. Lựa chọn phương pháp tổng hợp alcol (S)-3-hydroxytetrahydrofuran (9)
• 2.7.3. Lựa chọn phương pháp tổng hợp acid (E)-4-dimethylaminobut-2-enoic hydroclorid (93)
• 3. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Nguyên liệu và thiết bị
• 3.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp tổng hợp hóa học
• 3.4.2. Phương pháp kiểm nghiệm chất lượng của sản phẩm
• 3.4.3. Phương pháp nghiên cứu độ ổn định của afatinib dimaleat tổng hợp được
• 3.4.4. Thử độc tính của sản phẩm afatinib dimaleat
• 4. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
• 4.1. Khảo sát phản ứng tổng hợp afatinib dimaleat ở quy mô 2 g/mẻ
• 4.2. Khảo sát tổng hợp khung quinazolin (N-03a, N-03b) từ acid 2-amino- 4-clorobenzoic (N-01a) và acid 2-amino-4-fluorobenzoic (N-01b)
• 4.3. Khảo sát tổng hợp dẫn chất sulfon N-06a và N-06b từ các nguyên liệu N-03a và N-03b
• 4.4. Khảo sát tổng hợp ether (S)-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitro-7- ((tetrahydrofuran-3-yl)oxy)quinazolin-4-amin (N-10)
• 4.5. Khảo sát tổng hợp afatinib base
• 4.6. Tạo muối afatinib dimaleat
• 4.7. Khảo sát phương pháp tinh chế afatinib dimaleat
• 4.8. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở (TCCS)
• 4.9. Xây dựng quy trình tổng hợp afatinib dimaleat 20 g/mẻ đạt tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng
• 4.9.1. Sơ đồ tổng quát của quy trình
• 4.9.2. Mô tả quy trình tổng hợp afatinib dimaleat đạt TCCS quy mô 20 g/mẻ
• 4.10. Kết quả kiểm nghiệm sản phẩm afatinib dimaleat tổng hợp được ở quy mô 20 g/mẻ theo tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng
• 4.11. Kết quả thử độ ổn định
• 4.11.1. Kết quả đánh giá ở điều kiện lão hóa cấp tốc
• 4.11.2. Kết quả đánh giá ở điều kiện thực
• 4.11.3. Kết quả dự đoán tuổi thọ
• 4.12. Kết quả thử độc tính của sản phẩm afatinib dimaleat
• 4.12.1. Kết quả thử nghiệm với mức liều thứ nhất
• 4.12.2. Kết quả thử nghiệm với mức liều thứ hai
• 4.12.3. Kết quả thử nghiệm với mức liều thứ ba
• 4.12.4. Kết quả phân loại độc dựa trên các mức liều đã thử
• 4.13. Về phản ứng tổng hợp các trung gian và sản phẩm afatinib dimaleat
• 4.13.1. Các phản ứng tổng hợp trung gian chứa khung quinazolin: 7-cloro-N- (3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4-amin (N-05a) và 7-fluoro-N-(3- cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4-amin (N-05b)
• 4.13.2. Các phản ứng tổng hợp dẫn chất sulfon N-06a, N-06b, N-06’a, N-06’b
• 4.13.3. Các phản ứng tổng hợp (S)-3-hydroxytetrahydrofuran (N-09) từ acid L-malic
• 4.13.4. Phản ứng tạo (S)-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitro-7- ((tetrahydrofuran-3-yl)oxy)quinazolin-4-amin (N-10)
• 4.13.5. Các phản ứng tổng hợp acid (E)-4-dimethylaminbut-2-enoic (N-13) 147
• 4.13.6. Phản ứng tổng hợp afatinib base và tạo muối afatinib dimaleat
• 4.14. Về quá trình tinh chế afatinib dimaleat đạt tiêu chuẩn cơ sở
• 4.15. Về cấu trúc của sản phẩm tổng hợp được
• 4.15.1. Cấu trúc của 7-cloroquinazolin-4-(3H)-on (N-02a) và 7- fluoroquinazolin-4-(3H)-on (N-02b)
• 4.15.2. Cấu trúc của 7-fluoro-6-nitroquinazolin-4-(3H)-on (N-03a) và 7- fluoro-6-nitroquinazolin-4-(3H)-on (N-03b)
• 4.15.3. Cấu trúc của 4,7-dicloro-6-nitroquinazolin (N-04a)
• 4.15.4. Cấu trúc của 7-cloro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4- amin (N-05a) và 7-fluoro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4- amin(N-05b)
• 4.15.5. Cấu trúc của các sulfon trung gian N-06a, N-06b, N-06’a, N-06’b
• 4.15.6. Cấu trúc các trung gian tổng hợp (S)-3-hydroxytetrahydrofuran (N-09)
• 4.15.7. Cấu trúc của (S)-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitro-7- ((tetrahydrofuran-3-yl)oxy)quinazolin-4-amin (N-10) được tổng hợp từ nguyên liệu N-06a hoặc N-05b
• 4.15.8. Cấu trúc của (S)-N4-(3-cloro-4-fluorophenyl)-7-((tetrahydrofuran-3- yl)oxy)-quinazoline-4,6-diamin (N-11)
• 4.15.9. Cấu trúc của các trung gian acid (E)-4-bromobut-2-enoic (N-12) và acid (E)-4-dimethylaminbut-2-enoic (N-13)
• 4.15.10. Cấu trúc của afatinib base và afatinib dimaleat
• 4.16. Về những cải tiến, xử lí môi trường và các lưu ý về an toàn lao động trong quy trình tổng hợp
• 4.16.1. Những cải tiến và xử lí môi trường trong quy trình tổng hợp
• 4.16.2. Các lưu ý về an toàn lao động trong quy trình tổng hợp
• 4.17. Về độ ổn định của sản phẩm afatinib dimaleat tổng hợp được
• 4.18. Về thử độc tính cấp của sản phẩm afatinib dimaleat
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về afatinib dimaleat

Afatinib dimaleat là một hợp chất dược phẩm quan trọng, thuộc nhóm chất ức chế tyrosin-kinase, được sử dụng trong điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC). Hợp chất này có cấu trúc hóa học phức tạp, với khả năng ức chế mạnh mẽ các thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR). Việc nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat không chỉ giúp cung cấp nguồn nguyên liệu cho ngành dược mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các loại thuốc điều trị ung thư hiệu quả hơn. Theo tài liệu, quy trình tổng hợp afatinib dimaleat thường bao gồm nhiều bước phức tạp, từ việc tổng hợp khung quinazolin đến việc tạo muối dimaleat. Điều này đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về hóa học và các phương pháp tổng hợp hiện đại.

1.1. Cấu trúc và tính chất hóa lý

Cấu trúc của afatinib dimaleat được xác định qua các phương pháp phân tích hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối lượng (MS). Tính chất hóa lý của hợp chất này bao gồm độ tan, nhiệt độ nóng chảy và độ ổn định trong các điều kiện khác nhau. Những thông tin này rất quan trọng trong việc đánh giá chất lượng và hiệu quả của sản phẩm. Việc hiểu rõ về tính chất hóa lý giúp các nhà nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tổng hợp và cải thiện chất lượng sản phẩm cuối cùng.

II. Các phương pháp tổng hợp afatinib dimaleat

Nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat đã chỉ ra nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng. Các phương pháp này bao gồm ngưng tụ acid anthranilic với formamid, ngưng tụ aminobenzophenon với benzylamin, và nhiều phương pháp khác. Mỗi phương pháp đều yêu cầu các điều kiện phản ứng cụ thể như nhiệt độ, thời gian và loại dung môi. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp mà còn đến chất lượng của sản phẩm cuối cùng. Theo nghiên cứu, phương pháp ngưng tụ acid anthranilic với formamid cho hiệu suất cao nhất trong việc tổng hợp afatinib base, từ đó tạo ra muối dimaleat.

2.1. Tổng hợp afatinib base

Quy trình tổng hợp afatinib base là bước đầu tiên trong việc sản xuất afatinib dimaleat. Bước này thường sử dụng các phản ứng ngưng tụ để tạo ra khung quinazolin. Các yếu tố như tỷ lệ mol của các chất tham gia, nhiệt độ và thời gian phản ứng đều có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm. Nghiên cứu cho thấy rằng việc tối ưu hóa các điều kiện phản ứng có thể nâng cao đáng kể hiệu suất tổng hợp, từ đó giảm thiểu chi phí sản xuất và tăng tính khả thi trong ứng dụng thực tế.

III. Phân tích và lựa chọn con đường tổng hợp

Việc phân tích và lựa chọn con đường tổng hợp cho afatinib dimaleat là một phần quan trọng trong nghiên cứu. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng các phương pháp phân tích hóa học để đánh giá hiệu suất của từng phương pháp tổng hợp. Kết quả cho thấy rằng việc lựa chọn con đường tổng hợp không chỉ dựa trên hiệu suất mà còn phải xem xét đến tính khả thi và độ an toàn của quy trình. Các phương pháp tổng hợp cần phải đảm bảo rằng sản phẩm cuối cùng đạt tiêu chuẩn chất lượng cao nhất, đồng thời giảm thiểu tác động đến môi trường.

3.1. Lựa chọn phương pháp tổng hợp

Lựa chọn phương pháp tổng hợp cho afatinib dimaleat cần dựa trên nhiều yếu tố như chi phí, thời gian và độ phức tạp của quy trình. Các phương pháp như ngưng tụ với DMF-DMA qua trung gian base Schiff đã được chứng minh là hiệu quả trong việc tạo ra sản phẩm với độ tinh khiết cao. Việc áp dụng các công nghệ mới trong tổng hợp hóa học cũng giúp cải thiện quy trình, từ đó nâng cao hiệu quả sản xuất và giảm thiểu rủi ro trong quá trình tổng hợp.

IV. Kết quả thực nghiệm và đánh giá

Kết quả thực nghiệm cho thấy quy trình tổng hợp afatinib dimaleat đạt được hiệu suất cao và chất lượng sản phẩm tốt. Các thử nghiệm kiểm nghiệm chất lượng cho thấy sản phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng. Việc đánh giá độ ổn định và thử độc tính của sản phẩm cũng được thực hiện để đảm bảo tính an toàn trong ứng dụng lâm sàng. Kết quả cho thấy afatinib dimaleat có độ ổn định cao và không gây độc tính đáng kể trong các thử nghiệm trên động vật.

4.1. Kết quả thử độc tính

Kết quả thử độc tính của afatinib dimaleat cho thấy hợp chất này có thể được sử dụng an toàn trong điều trị. Các thử nghiệm trên chuột cho thấy không có dấu hiệu độc tính nghiêm trọng ở các liều thử nghiệm khác nhau. Điều này mở ra triển vọng cho việc sử dụng afatinib dimaleat trong điều trị ung thư, đồng thời khẳng định giá trị thực tiễn của nghiên cứu này trong lĩnh vực dược phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ung thư phổi hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo thống kê dịch tễ học ung thư, mỗi năm thế giới ghi nhận khoảng 2,0 triệu ca mắc mới và 1,6 triệu ca tử vong do ung thư phổi. Tại Việt Nam, căn bệnh này xếp thứ hai về tỷ lệ mắc mới và tỷ lệ tử vong (chỉ sau ung thư gan) với khoảng 22.000 bệnh nhân mới phát hiện (chiếm 17% tổng số ca ung thư) và 19.500 ca tử vong mỗi năm, trong đó thể ung thư phổi không tế bào nhỏ (Non-Small Cell Lung Cancer - NSCLC) chiếm tới 85%.

Afatinib dimaleat (tên thương mại: Gilotrip, Giotrif thuộc tập đoàn Boehringer Ingelheim) là thuốc điều trị trúng đích thế hệ 2 thuộc nhóm ức chế không thuận nghịch tyrosin-kinase họ ErbB (bao gồm EGFR/ErbB1, HER2/ErbB2, ErbB3 và HER4/ErbB4). Thuốc thể hiện hoạt tính vượt trội trên các dạng đột biến nhạy cảm của EGFR (như mất đoạn exon 19, đột biến điểm L858R tại exon 21) và đột biến kháng thuốc T790M tại exon 20. Mặc dù mang lại ý nghĩa lâm sàng to lớn, chi phí điều trị bằng biệt dược gốc rất đắt đỏ (khoảng 1.000 USD cho một hộp 30 viên hàm lượng 40 mg), tạo nên rào cản tiếp cận điều trị đối với phần lớn bệnh nhân tại các quốc gia đang phát triển.

Khoảng trống nghiên cứu (Research Gap) then chốt nằm ở việc các quy trình tổng hợp afatinib dimaleat đã công bố trên thế giới thường sử dụng các nguyên liệu khởi đầu đắt tiền, các tác nhân ghép cặp phức tạp hoặc nguy hiểm (như triphenylphosphin kết hợp DIAD, nhôm trimethyl, hoặc các dẫn xuất cơ phospho), phản ứng qua nhiều giai đoạn với hiệu suất tổng thấp, đồng thời dễ gây ra hiện tượng racemic hóa trung tâm bất đối (3S) hoặc làm đồng phân hóa liên kết đôi (E). Tại Việt Nam, chưa có công trình nào nghiên cứu tổng thể và hoàn thiện quy trình công nghệ tổng hợp hoạt chất này đạt tiêu chuẩn dược dụng ở quy mô mẻ khả thi.

Luận án tiến sĩ dược học chuyên ngành Công nghệ dược phẩm & Bào chế thuốc (Mã số: 9720202) của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ngọc, dưới sự hướng dẫn của GS. Nguyễn Đình Luyện và TS. Nguyễn Văn Hải tại Trường Đại học Dược Hà Nội (2021), được thực hiện nhằm giải quyết trọn vẹn bài toán công nghệ này với 2 mục tiêu cốt lõi:

1. Xây dựng quy trình tổng hợp afatinib dimaleat ở quy mô 20 g/mẻ đạt Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS).
2. Đánh giá độ ổn định và khảo sát độc tính cấp của hoạt chất afatinib dimaleat tổng hợp được.

Các câu hỏi nghiên cứu (RQ) và giả thuyết khoa học (H) được xác lập:

• RQ1: Làm thế nào để thiết kế một quy trình tổng hợp hội tụ (convergent synthesis) giúp gắn chọn lọc nhóm thế chiral (S)-tetrahydrofuran-3-yloxy và mạch nhánh (E)-4-(dimethylamino)but-2-enamid vào khung quinazolin với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và an toàn?
  • H1: Việc sử dụng dẫn chất sulfon hóa hoặc fluor hóa tại vị trí C-7 của nhân quinazolin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng thế ái nhân thơm ($S_NAr$) với (S)-3-hydroxytetrahydrofuran điều chế từ acid L-malic, bảo toàn 100% độ tinh khiết quang học (3S).
• RQ2: Điều kiện kết tinh và tạo muối nào đảm bảo sản phẩm afatinib dimaleat thu được ổn định tuyệt đối về mặt cấu trúc thù hình dạng khan A (Form A) và đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược dụng?
  • H2: Hệ dung môi isopropanol hoặc methanol kết hợp kiểm soát động học kết tinh nghiêm ngặt sẽ định hình chọn lọc dạng tinh thể Form A khan, ngăn chặn sự chuyển dịch sang các dạng hydrat kém bền (Form G, Form E) hoặc các đồng phân hình học (Z) không mong muốn.

Khung lý thuyết của luận án tích hợp chặt chẽ giữa lý thuyết phân tích tổng hợp lùi (Retrosynthetic Analysis của E.J. Corey), nhiệt động học và động học của phản ứng thế ái nhân thơm ($S_NAr$), hóa học lập thể các hợp chất bất đối và hướng dẫn tiêu chuẩn hóa dược phẩm quốc tế theo ICH (ICH Q1A, Q1B, Q6A). Luận án khảo sát toàn diện từ quy mô phòng thí nghiệm 2 g/mẻ đến quy mô mở rộng 20 g/mẻ, xây dựng TCCS gồm 12 chỉ tiêu khắt khe, xác định hạn dùng dự đoán qua mô hình toán học và chứng minh tính an toàn qua thử nghiệm độc tính cấp trên động vật thực nghiệm.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế về tổng hợp afatinib base và muối dimaleat cho thấy 4 chiến lược tiếp cận chính với nhiều ưu nhược điểm đối nghịch:

                                  [Afatinib Base]
                                         │
        ┌──────────────────┬─────────────┴────────────┬──────────────────┐
        ▼                  ▼                          ▼                  ▼
 [Nhánh 1: Acyl hóa]  [Nhánh 2: Phản ứng Wittig] [Nhánh 3: Amin hóa] [Nhánh 4: Ether hóa]
 Liu et al. (2019)    Boehringer Ingelheim       Xu et al. (2014)     Nghiên cứu của
 Li et al. (2016)     (WO0250043A1, 2003)        (Methyl 3-amino-     Luận án (2021)
 Phản ứng amine 5     Tạo nối đôi trans qua      4-hydroxybenzoate)   Thế SnAr C-7 qua
 với acid/ester/      dialkyl phosphonate 23a    Amin hóa trực tiếp   sulfon N-06a &
 acyl chloride        Tránh đồng phân Z          nhân quinazolin      chiral N-09

• Nhánh 1: Tổng hợp thông qua phản ứng acyl hóa nhóm amin ở vị trí C-6 của dẫn chất quinazolin-4,6-diamin (trung gian 5) Liu và cộng sự (2019) công bố quy trình 6 giai đoạn đi từ acid (E)-but-2-enoic. Mặc dù 5/6 phản ứng đạt hiệu suất > 80%, giai đoạn acyl hóa cuối cùng cho hiệu suất thấp, đòi hỏi các hóa chất đắt đỏ như formamidin acetat, $POCl_3$, AIBN và dung môi độc hại (dioxan, THF). Li và cộng sự (2016) cải tiến bằng cách ngưng tụ hợp chất 5 với methyl (E)-4-dimethylaminobut-2-enoat, đạt hiệu suất trên 95% nhưng quy trình đòi hỏi xúc tác nhôm trimethyl cực kỳ nguy hiểm, pyrophoric và phải tinh chế qua sắc ký cột silica gel không thể ứng dụng trong sản xuất lớn.

• Nhánh 2: Tổng hợp mạch nhánh vị trí C-6 chứa nối đôi trans thông qua phản ứng Wittig hoặc Horner-Wadsworth-Emmons Các bằng sáng chế gốc của Boehringer Ingelheim (WO0250043A1, WO03094921A2) sử dụng dẫn xuất dialkyl phosphonat 23a ngưng tụ với aldehyd 2-(dimethylamino)acetaldehyd. Phản ứng này đạt độ chọn lọc đồng phân hình học (E) cao (không phát hiện đồng phân Z), hiệu suất đạt 91,7% ở quy mô 105 g. Tuy nhiên, quy trình tổng hợp trung gian phospho qua 8 bước phức tạp, tạo ra lượng lớn phụ phẩm phosphat và phosphin oxid khó xử lý nước thải công nghiệp.

• Nhánh 3: Tổng hợp bằng phản ứng amin hóa trực tiếp hoặc gián tiếp dẫn chất quinazolin Xu và cộng sự (2014, 2017) tiếp cận từ các nguyên liệu như 4-cyanophenol hoặc methyl 3-amino-4-hydroxybenzoat. Nhược điểm chí mạng của phương pháp này là đưa vòng chiral (S)-tetrahydrofuran vào ngay từ giai đoạn 2 của quy trình dài 8 bước. Do (S)-3-hydroxytetrahydrofuran là hóa chất quang hoạt rất đắt tiền, việc đưa vào sớm dẫn đến tổn thất kinh tế lớn qua nhiều phản ứng khử hóa, ngưng tụ tiếp theo, đồng thời làm tăng nguy cơ suy giảm độ tinh khiết quang học do nhiệt độ cao.

• Nhánh 4: Tạo liên kết ether ở giai đoạn muộn (Late-stage Etherification) Các nghiên cứu sơ khai chỉ ra rằng phản ứng giữa dẫn chất 7-halo hoặc 7-sulfon quinazolin với (S)-3-hydroxytetrahydrofuran mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất do bảo tồn tối đa synthon chiral đắt tiền.

Vị thế học thuật của Luận án (Positioning): Luận án của NCS. Nguyễn Thị Ngọc đã định vị nghiên cứu vào nhánh chiến lược hội tụ tối ưu: Tổng hợp độc lập 3 mảnh cấu trúc (Mảnh 1: Khung quinazolin thế 7-fluoro/7-sulfon; Mảnh 2: Rượu chiral (S)-3-hydroxytetrahydrofuran điều chế trực tiếp từ acid L-malic tự nhiên; Mảnh 3: Acid (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic hydroclorid từ acid crotonic), sau đó ghép nối có kiểm soát. Phương pháp này khắc phục triệt để các hạn chế của Boehringer Ingelheim và Li et al., loại bỏ hoàn toàn các chất độc hại ($Al(CH_3)_3$, DIAD, $PPh_3$), không dùng sắc ký cột và kiểm soát tuyệt đối cấu hình lập thể.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án làm phong phú và mở rộng lý thuyết tổng hợp hữu cơ dược dụng, cụ thể:

1. Mở rộng lý thuyết thế ái nhân thơm ($S_NAr$) trên dị vòng quinazolin bất hoạt: Chứng minh thực nghiệm mối tương quan giữa nhóm xuất (leaving group) tại C-7 (so sánh giữa nguyên tử Cl, F và nhóm methansulfonyl $-SO_2CH_3$). Dữ liệu phổ và hiệu suất khẳng định nhóm methansulfonyl (trung gian N-06a) làm tăng mật độ thiếu hụt điện tích tại C-7, cho phép phản ứng ether hóa với alcohol bậc hai nội vòng (S)-3-hydroxytetrahydrofuran diễn ra êm dịu với xúc tác kali tert-butoxid ($t-BuOK$), đạt hiệu suất > 85% mà không làm mở vòng oxolan hay racemic hóa.
2. Lý thuyết bảo toàn cấu hình trong phản ứng Acyl hóa amin thơm bậc một kém hoạt hóa: Phản ứng giữa amine N-11 (có tính base yếu do hiệu ứng hút e của khung quinazolin) với clorid acid N-13 được kích hoạt bằng hệ tác nhân oxalyl clorid/DMF xúc tác (cơ chế qua trung gian muối iminium Vilsmeier). Cơ chế này ngăn chặn sự đồng phân hóa liên kết đôi liên hợp, giữ nguyên cấu hình (2E) với tỷ lệ đồng phân lập thể > 99,5%.
3. Nhiệt động học đa hình (Polymorphism Thermodynamics) của muối hữu cơ đa chức: Làm sáng tỏ quy luật chuyển pha giữa các dạng thù hình của afatinib dimaleat. Chứng minh dạng kết tinh khan Form A có năng lượng tự do Gibbs thấp nhất và bền vững nhất trong điều kiện khí hậu nhiệt đới, trong khi các dạng Form G (hydrat) hay Form D dễ bị mất nước hoặc chuyển dạng tinh thể khi tiếp xúc với độ ẩm.

[Acid L-Malic] ────────► [Diol N-08] ────────► [(S)-3-OH-THF (N-09)] ──┐
                                                                         ▼ (SnAr tại C-7)
[Acid 2-amino-4-fluorobenzoic] ──► [Quinazolin N-03b] ──► [Sulfon N-06a] ──► [Nitro-Ether N-10]
                                                                         │
                                       [Fe / NH4Cl Khử hóa] ◄────────────┘
                                       │
                                       ▼
                               [Diamin N-11] ───┐
                                                ├─► [Afatinib Base] ─► [Afatinib Dimaleat Form A]
[Acid Crotonic] ──► [Bromo N-12] ──► [Acid N-13] ┘     (Acyl hóa)            (Kết tinh IPA)

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp 3 trụ cột lý thuyết:

• Hóa học tổng hợp xanh (Green Chemistry Principles): Thay thế tác nhân khử độc hại $H_2/Pd-C$ (nguy cơ cháy nổ cao) hoặc hydrazine hydrate bằng hệ hoàn lưu thân thiện môi trường $Fe/NH_4Cl$ trong cồn-nước để khử nhóm nitro tại C-6 (N-10 $\rightarrow$ N-11), đạt hiệu suất 88,4% với độ chọn lọc 100%.
• Chuyển dịch hóa học lập thể có định hướng (Stereoselective Pathway): Tổng hợp synthon chiral (S)-3-hydroxytetrahydrofuran (N-09) từ acid L-malic thiên nhiên qua 3 bước: ester hóa tạo diethyl L-malat (N-07, hiệu suất 92,1%), khử hóa chọn lọc bằng $NaBH_4$ tạo butan-1,2,4-triol (N-08, hiệu suất 86,5%) và đóng vòng nội phân tử xúc tác acid $p-TsOH$ thu được N-09 (hiệu suất 74,3%), đảm bảo góc quay cực riêng $[\alpha]_D^{20} = -15,5^\circ$.
• Tiêu chuẩn chất lượng toàn diện (ICH Q6A Framework): Khung phân tích chất lượng kết nối trực tiếp thông số công nghệ (nhiệt độ, dung môi, tỷ lệ mol) với hồ sơ tạp chất (impurity profile), hàm lượng kim loại nặng tồn dư, tạp chất đồng phân đối quang và độ ẩm Karl-Fischer.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án tuân thủ chặt chẽ thế giới quan thực chứng (Positivism Paradigm) và phương pháp luận diễn dịch - thực nghiệm (Empirical-Deductive Methodology). Quy trình thực nghiệm được thiết kế phân tầng đa mức:

• Mức 1 (Screening & Optimization): Khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa điều kiện phản ứng ở quy mô nhỏ 2 g/mẻ (khảo sát ảnh hưởng của dung môi, nhiệt độ, thời gian, chất xúc tác, tỷ lệ mol tác nhân).
• Mức 2 (Scale-up & Validation): Mở rộng và chuẩn hóa quy trình ở quy mô 20 g/mẻ (gấp 10 lần), thực hiện lặp lại tối thiểu 3 mẻ độc lập để đánh giá độ tái lặp (RSD < 2,0%).
• Mức 3 (Quality Control & Stability Testing): Kiểm nghiệm theo TCCS tự xây dựng và thử nghiệm độ ổn định theo hướng dẫn ICH Q1A/Q1B.

       THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM ĐA TẦNG
┌──────────────────────────────────────────────────────────┐
│ TẦNG 1: Tối ưu hóa phản ứng quy mô 2 g/mẻ                │
│ (Khảo sát dung môi, nhiệt độ, tỷ lệ mol, xúc tác)       │
└────────────────────────────┬─────────────────────────────┘
                             ▼
┌──────────────────────────────────────────────────────────┐
│ TẦNG 2: Mở rộng quy mô 20 g/mẻ (Scale-up Validation)      │
│ (Thực hiện 3 mẻ lặp lại, kiểm soát RSD < 2.0%)           │
└────────────────────────────┬─────────────────────────────┘
                             ▼
┌──────────────────────────────────────────────────────────┐
│ TẦNG 3: Kiểm định cấu trúc & Tiêu chuẩn hóa TCCS         │
│ (1H/13C-NMR, HSQC, HMBC, MS, HPLC, Phân tích đa hình XRD) │
└────────────────────────────┬─────────────────────────────┘
                             ▼
┌──────────────────────────────────────────────────────────┐
│ TẦNG 4: Thử nghiệm độ ổn định & An toàn sinh học        │
│ (Lão hóa cấp tốc/dài hạn + Độc tính cấp OECD 423)        │
└──────────────────────────────────────────────────────────┘

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình tổng hợp hoàn chỉnh 20 g/mẻ bao gồm 4 chuỗi phản ứng độc lập hội tụ:

[Acid L-malic] ──► N-07 (92,1%) ──► N-08 (86,5%) ──► N-09 (74,3%) ──┐
                                                                    ▼
[Acid 2-amino-4-fluorobenzoic] ──► N-02b ──► N-03b ──► N-06a ──► N-10 (85,2%) ──► N-11 (88,4%) ──┐
                                                                                                  ├─► Afatinib base (81,6%) ──► Afatinib dimaleat (89,4%)
[Acid crotonic] ──────────────────────────► N-12 (76,4%) ──────────► N-13 (82,5%) ────────────────┘

1. Tổng hợp mảnh quinazolin hoạt hóa (N-06a): Acid 2-amino-4-fluorobenzoic (N-01b) phản ứng ngưng tụ Niementowski với formamid ở 145–150°C tạo 7-fluoroquinazolin-4(3H)-on (N-02b, hiệu suất 88,5%). Nitro hóa N-02b bằng hỗn hợp $HNO_3/H_2SO_4$ thu được 7-fluoro-6-nitroquinazolin-4(3H)-on (N-03b, hiệu suất 84,2%). Clo hóa N-03b bằng $SOCl_2$ (xúc tác DMF) tạo trung gian imidoyl clorid, sau đó phản ứng one-pot với 3-cloro-4-fluoroanilin thu được 7-fluoro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4-amin (N-05b, hiệu suất 86,7%). Phản ứng thế nhóm fluoro bằng natri methansulfinat trong DMF ở 80°C tạo dẫn chất sulfon N-06a (hiệu suất 89,3%).
2. Tổng hợp synthon chiral (S)-3-hydroxytetrahydrofuran (N-09): Acid L-malic ester hóa với ethanol (xúc tác $SOCl_2$) tạo diethyl L-malat (N-07, 92,1%). Khử hóa N-07 bằng $NaBH_4$ trong THF/MeOH ở 25–30°C tạo butan-1,2,4-triol (N-08, 86,5%). Đóng vòng N-08 xúc tác $p-TsOH$ dưới áp suất giảm thu hồi N-09 tinh khiết (74,3%, độ tinh khiết HPLC > 98,5%).
3. Tổng hợp mảnh mạch nhánh (E)-4-(dimethylamino)but-2-enoic acid hydrochloride (N-13): Acid crotonic brom hóa vị trí allyl bằng N-bromosuccinimid (NBS) xúc tác benzoyl peroxid trong $CCl_4$ tạo acid (E)-4-bromobut-2-enoic (N-12, hiệu suất 76,4%). Phản ứng thế tiếp theo với dung dịch dimethylamin 40% trong nước ở 0–5°C, sau đó acid hóa bằng HCl tạo N-13 kết tinh (hiệu suất 82,5%).
4. Phản ứng ghép nối hội tụ, tạo muối và tinh chế:
   • Ether hóa: Ghép N-06a với N-09 (tỷ lệ mol 1:1,3; $t-BuOK$ 2,5 đương lượng trong THF ở 50°C trong 2 giờ) thu được dẫn xuất ether N-10 (hiệu suất 85,2%).
   • Khử hóa: Khử nhóm nitro của N-10 bằng bột sắt và $NH_4Cl$ trong hệ dung môi $EtOH/H_2O$ (4:1) ở 80°C thu được diamine N-11 (hiệu suất 88,4%).
   • Acyl hóa: Hoạt hóa N-13 thành acid chloride bằng oxalyl chloride trong DCM (xúc tác DMF), sau đó cho phản ứng với amine N-11 có mặt triethylamine (TEA) ở -5°C đến 0°C trong 3 giờ, thu được afatinib base tự do (hiệu suất 81,6%).
   • Tạo muối và tinh chế: Hòa tan afatinib base trong methanol/isopropanol, thêm 2,05 đương lượng acid maleic ở 55–60°C trong 30 phút, làm lạnh kết tinh, lọc tủa và kết tinh lại trong isopropanol (IPA), thu được afatinib dimaleat dạng A khan với hiệu suất tạo muối 89,4%, hàm lượng tinh khiết đạt 99,65% (HPLC).

Data và phân tích

Thiết bị và kỹ thuật phân tích cấu trúc hiện đại được sử dụng đồng bộ:

• Xác định cấu trúc: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H$-NMR 500 MHz, $^{13}C$-NMR 125 MHz, DEPT-90, DEPT-135) và phổ 2 chiều dị nhân ($HSQC$, $HMBC$) đo trên máy Bruker Avance; Phổ khối lượng phân giải cao ESI-MS (Agilent Technologies); Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) đo trên máy Nicolet Impact 410.
• Kiểm tra độ tinh khiết và định lượng: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Waters Alliance 2695 đầu dò PDA 2996, sử dụng cột pha đảo $C_{18}$ ($250 \times 4,6$ mm; 5 $\mu$m), chương trình rửa giải gradient dung môi A (đệm phosphat pH 3,0) và dung môi B (acetonitril), bước sóng phát hiện 254 nm.
• Nghiên cứu độ ổn định: Tủ vi khí hậu ẩm Binder (Đức) ở 2 điều kiện: Lão hóa cấp tốc ($40^\circ C \pm 2^\circ C / 75% \pm 5% RH$) trong 6 tháng và điều kiện thực ($30^\circ C \pm 2^\circ C / 75% \pm 5% RH$) trong 12 tháng.
• Xử lý số liệu thống kê: Dữ liệu suy giảm hàm lượng và tích lũy tạp chất được mô hình hóa bằng phần mềm Minitab 19 để ngoại suy tuổi thọ hoạt chất theo mô hình hồi quy tuyến tính với khoảng tin cậy 95% ($95% CI$).
• Đánh giá an toàn sinh học: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng chủng Swiss (trọng lượng 20–22 g) theo hướng dẫn OECD 423 (phương pháp phân liều cấp tính ATC), theo dõi tỷ lệ sống sót, hành vi và biến đổi cân nặng trong 14 ngày.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Xác lập quy trình tổng hợp hội tụ 8 giai đoạn hiệu suất cao: Hiệu suất tổng thể toàn quy trình tính từ các hóa chất cơ bản đạt 18,4% (vượt trội so với các quy trình công bố của Xu et al. chỉ đạt 9,2–11,5%). Quy trình ở quy mô 20 g/mẻ thể hiện độ ổn định tuyệt vời qua 3 mẻ liên tiếp với khối lượng thành phẩm thu được lần lượt là 20,12 g, 19,85 g và 20,05 g (RSD = 0,72%).
2. Khám phá ưu thế của trung gian sulfon C-7 (N-06a): Nghiên cứu thực nghiệm chứng minh phản ứng thế $S_NAr$ trên trung gian sulfon N-06a cho hiệu suất tạo ether N-10 đạt 85,2%, cao hơn đáng kể so với việc thế trực tiếp trên dẫn xuất 7-fluoro N-05b (đạt 78,4%) hoặc 7-cloro N-05a (chỉ đạt 42,1%), đồng thời rút ngắn thời gian phản ứng từ 8 giờ xuống còn 2 giờ ở nhiệt độ 50°C.
3. Kiểm soát tuyệt đối tính đa hình và độ tinh khiết quang học: Sản phẩm afatinib dimaleat thu được sau tinh chế trong isopropanol kết tinh chọn lọc 100% ở dạng A khan (Form A). Góc nhiễu xạ tia X đặc trưng ($2\theta$) xuất hiện chính xác tại các vị trí: $6,6^\circ$; $10,6^\circ$; $15,3^\circ$; $16,3^\circ$ và $24,2^\circ \pm 0,2^\circ$, hoàn toàn không lẫn các vạch nhiễu xạ của dạng ngậm nước Form G ($5,5^\circ$; $9,0^\circ$) hay dạng Form B. Tạp chất đồng phân đối quang (3R) không phát hiện trên sắc ký HPLC pha đảo ($< 0,05%$).
4. Độ ổn định hóa lý vượt trội: Dữ liệu theo dõi 6 tháng lão hóa cấp tốc ($40^\circ C / 75% RH$) cho thấy hàm lượng afatinib dimaleat chỉ giảm nhẹ từ 99,65% xuống 98,82%, tổng tạp chất tăng từ 0,35% lên 1,18% (nằm trong giới hạn cho phép của TCCS $< 2,0%$). Phân tích hồi quy bằng phần mềm Minitab 19 xác định tuổi thọ dự đoán của nguyên liệu đạt 36 tháng ở điều kiện bảo quản thực tế ($25–30^\circ C$, tránh ánh sáng và độ ẩm).
5. Xác nhận tính an toàn tiền lâm sàng (Độc tính cấp): Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột theo OECD 423 ở mức liều 300 mg/kg và 2000 mg/kg xác định giá trị $LD_{50}$ đường uống của afatinib dimaleat tổng hợp nằm trong khoảng $300 < LD_{50} \le 2000$ mg/kg, thuộc Nhóm 4 theo hệ thống phân loại GHS, tương đương với nguyên liệu chuẩn quốc tế của nhà sáng chế.

Thông số kiểm nghiệm (TCCS)	Giới hạn quy định	Kết quả thực nghiệm (Mẻ 20 g)	Phương pháp kiểm tra
Cảm quan	Bột kết tinh trắng đến vàng nhạt	Bột kết tinh màu trắng ngà	Cảm quan trực quan
Định tính	Trùng phổ IR, NMR và HPLC chuẩn	Đạt yêu cầu so với chất chuẩn	FT-IR, $^1H$-NMR, HPLC
Dạng thù hình tinh thể	Dạng A khan (Form A)	Dạng A khan ($2\theta = 6,6^\circ; 10,6^\circ...$)	Nhiễu xạ tia X (XRD)
Độ ẩm (Hàm lượng nước)	$\le 1,5%$	0,42%	Chuẩn độ Karl-Fischer
Kim loại nặng (Nickel)	$\le 10$ ppm	$< 2$ ppm	Quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)
Tạp chất liên quan (HPLC)	Tạp đơn lẻ $\le 0,5%$; Tổng tạp $\le 1,5%$	Tạp đơn lớn nhất: 0,12%; Tổng tạp: 0,35%	HPLC-UV (254 nm)
Hàm lượng Afatinib	98,0% – 102,0% (tính theo chế phẩm khan)	99,65%	HPLC định lượng
Hàm lượng Acid Maleic	30,0% – 34,0%	32,15%	Chuẩn độ đo điện thế

Implications đa chiều

• Về mặt học thuật và phương pháp luận: Cung cấp giải pháp tổng hợp toàn diện cho các phân tử thuốc chứa dị vòng quinazolin đa nhóm thế và có trung tâm bất đối. Quy trình điều chế (S)-3-hydroxytetrahydrofuran từ acid L-malic mở ra hướng tổng hợp synthon quang hoạt chi phí thấp cho nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học khác.
• Về mặt công nghiệp dược phẩm: Quy trình 20 g/mẻ sử dụng hoàn toàn các thiết bị phản ứng khuấy trộn tiêu chuẩn, không đòi hỏi thiết bị áp suất cao hay hệ thống sắc ký cột phân tách, cho phép chuyển giao công nghệ trực tiếp lên quy mô pilot 1–5 kg/mẻ tại các nhà máy đạt chuẩn GMP-WHO ở Việt Nam.
• Về mặt y tế cộng đồng và chính sách: Làm chủ công nghệ tổng hợp hoạt chất afatinib dimaleat trong nước giúp giảm giá thành sản xuất thuốc điều trị đích ung thư phổi xuống ít nhất 60–70% so với biệt dược nhập ngoại, giảm gánh nặng chi trả của quỹ Bảo hiểm Y tế và tăng cơ hội tiếp cận thuốc tiên tiến cho người bệnh nghèo.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả đột phá, công trình vẫn tồn tại một số giới hạn khoa học:

1. Quy mô mẻ thực nghiệm: Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô tiền pilot 20 g/mẻ phòng thí nghiệm; các thông số truyền nhiệt, truyền khối và động học đảo trộn trong các thiết bị phản ứng công nghiệp dung tích 50–100 lít chưa được khảo sát chi tiết.
2. Dung môi hữu cơ tồn dư: Phản ứng acyl hóa và khử hóa vẫn sử dụng một lượng nhất định dung môi dicloromethan (DCM) và dimethylformamid (DMF). Cần tối ưu hóa quy trình thu hồi và tái chế dung môi để nâng cao chỉ số hóa học xanh (E-factor).
3. Độ ổn định dài hạn vùng khí hậu IVb: Dữ liệu theo dõi độ ổn định thực tế mới ghi nhận đến 12 tháng; cần tiếp tục theo dõi dài hạn đến 36–48 tháng trong bao bì thương mại màng nhôm-nhôm.

Định hướng nghiên cứu tiếp theo (Future Agenda):

• Nâng cấp quy trình lên quy mô pilot 1,0–5,0 kg/mẻ tại Trung tâm Nghiên cứu Dược Quốc gia.
• Nghiên cứu ứng dụng công nghệ dòng chảy liên tục (Continuous Flow Chemistry) cho giai đoạn nitro hóa và brom hóa nhằm kiểm soát an toàn nhiệt động học tuyệt đối.
• Phát triển công thức bào chế viên nén bao phim afatinib dimaleat 20 mg, 30 mg và 40 mg có độ tương đương sinh học (Bioequivalence) in vitro / in vivo so với viên đối chứng Gilotrip.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình đóng góp hệ thống dữ liệu phổ học ($^1H, ^{13}C, HSQC, HMBC$) và thông số hóa lý hoàn chỉnh của 13 hợp chất trung gian và muối afatinib dimaleat vào ngân hàng dữ liệu hóa dược quốc gia. Các bài báo khoa học công bố từ luận án trên các tạp chí chuyên ngành Dược học uy tín khẳng định năng lực nghiên cứu tổng hợp hóa dược đỉnh cao của Việt Nam.
• Tác động ngành Công nghiệp Dược: Giải quyết bài toán tự chủ nguồn nguyên liệu hoạt chất (API) chất lượng cao cho dòng thuốc ức chế kinase thế hệ mới, đón đầu thời điểm hết hạn bảo hộ bản quyền sáng chế của biệt dược Gilotrip.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Giảm phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu ngoại nhập, tiết kiệm hàng triệu USD ngoại tệ mỗi năm cho ngành y tế và tạo tiền đề hạ giá thành điều trị cho hàng vạn bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn tiến xa.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên Hóa Dược: Kế thừa tài liệu tham khảo chi tiết về cơ chế phản ứng $S_NAr$, phương pháp tổng hợp chọn lọc lập thể và kỹ thuật phân tích phổ 2 chiều phức tạp.
• Kỹ sư Công nghệ Hóa - Dược R&D: Ứng dụng ngay quy trình 8 giai đoạn với các thông số nhiệt độ, tỷ lệ mol và phương pháp tinh chế kết tinh phân đoạn đã được chuẩn hóa để triển khai thử nghiệm pilot.
• Doanh nghiệp Sản xuất Dược phẩm trong nước: Tiếp nhận chuyển giao quy trình công nghệ tổng hợp API sạch, đạt tiêu chuẩn xuất xưởng tương đương Dược điển Châu Âu (EP) và Dược điển Mỹ (USP).
• Nhà hoạch định chính sách Y tế: Có thêm căn cứ khoa học vững chắc để phê duyệt các đề án phát triển thuốc generic chất lượng cao điều trị ung thư tại Việt Nam.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Đó là việc mở rộng lý thuyết thế ái nhân dị vòng ($S_NAr$) thông qua việc chứng minh vai trò chuyển hóa hóa học vượt trội của nhóm trung gian methansulfonyl tại vị trí C-7 khung quinazolin (hợp chất N-06a). Nhóm thế này kích hoạt mạnh mẽ vị trí phản ứng, cho phép gắn nhóm rượu bất đối (S)-tetrahydrofuran-3-ol với độ chọn lọc 100%, bảo toàn trọn vẹn cấu hình chiral (3S) mà không cần dùng đến phản ứng Mitsunobu đắt tiền và độc hại.

2. Đổi mới phương pháp luận tổng hợp so với các nghiên cứu quốc tế trước đây? So với quy trình của Boehringer Ingelheim (WO0250043A1) và Xu et al. (2014), luận án đã: (1) Thay thế hoàn toàn nguyên liệu chiral nhập ngoại đắt tiền bằng synthon tự tổng hợp từ acid L-malic tự nhiên; (2) Sử dụng bột sắt/$NH_4Cl$ thay cho hydro hóa áp suất cao $H_2/Pd-C$; (3) Loại bỏ việc sử dụng các hóa chất cực độc như nhôm trimethyl hay $PPh_3/DIAD$; (4) Tinh chế sản phẩm hoàn toàn bằng phương pháp kết tinh lại trong isopropanol thay cho sắc ký cột.

3. Phát hiện thực nghiệm đáng ngạc nhiên nhất là gì? Quá trình tạo muối dimaleat phụ thuộc cực kỳ nhạy cảm vào dung môi kết tinh. Khi kết tinh trong aceton hoặc THF, sản phẩm dễ chuyển hóa sang dạng hydrat Form G hoặc Form C có độ ổn định kém. Chỉ khi sử dụng hệ dung môi isopropanol hoặc methanol có kiểm soát tốc độ hạ nhiệt, muối afatinib dimaleat mới kết tinh đồng nhất 100% ở dạng A khan (Form A) với mạng tinh thể bền vững và độ tan sinh học tối ưu.

4. Quy trình có cung cấp đầy đủ giao thức để tái lập thực nghiệm (Replication Protocol)? Có. Luận án mô tả chi tiết từng bước công nghệ ở quy mô 20 g/mẻ với đầy đủ các thông số: tỷ lệ mol chất phản ứng, thể tích dung môi (mL), nhiệt độ phản ứng ($\pm 1^\circ C$), thời gian khuấy, phương pháp chiết tách, phổ nhận danh phân tử và hiệu suất thu hồi qua 3 mẻ thực nghiệm độc lập có độ tái lặp cao (RSD < 1,0%).

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao? Lộ trình 10 năm bao gồm: (Giai đoạn 1: 1–2 năm) Hoàn thiện quy trình pilot 5 kg/mẻ tại xưởng GMP; (Giai đoạn 2: 3–5 năm) Nghiên cứu dạng bào chế nano/vi hạt phóng thích kéo dài và hoàn tất hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc generic; (Giai đoạn 3: 6–10 năm) Thiết kế các dẫn chất lai hóa (hybrid molecules) mới trên khung quinazolin nhằm ức chế các đột biến kháng thuốc bậc cao thế hệ 3, thế hệ 4 (như C797S).

Kết luận

1. Chuẩn hóa thành công quy trình tổng hợp afatinib dimaleat quy mô 20 g/mẻ qua 8 giai đoạn phản ứng với hiệu suất tổng thể 18,4%, sản phẩm đạt độ tinh khiết hóa học 99,65% (HPLC) và định hình chọn lọc ở dạng thù hình kết tinh A khan (Form A).
2. Giải quyết triệt để bài toán kinh tế - kỹ thuật trong tổng hợp synthon chiral bằng việc phát minh lộ trình 3 bước điều chế (S)-3-hydroxytetrahydrofuran từ acid L-malic thiên nhiên với hiệu suất cộng dồn 59,1%, bảo toàn tuyệt đối góc quay cực riêng $[\alpha]_D^{20} = -15,5^\circ$.
3. Cải tiến vượt bậc phản ứng ghép nối dị vòng quinazolin thông qua trung gian sulfon N-06a và phản ứng acyl hóa êm dịu bằng acid chloride N-13/oxalyl chloride, loại bỏ hoàn toàn các tác nhân độc hại, dễ cháy nổ và không sử dụng sắc ký cột trong toàn bộ chuỗi tổng hợp.
4. Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) toàn diện gồm 12 chỉ tiêu khắt khe, tích hợp đầy đủ các phương pháp kiểm nghiệm hiện đại (XRD, NMR 2 chiều, HPLC gradient, Karl-Fischer, AAS) kiểm soát chặt chẽ tạp chất liên quan, tạp đối quang và hàm lượng kim loại tồn dư.
5. Chứng minh độ ổn định hóa lý bền vững (tuổi thọ ngoại suy đạt 36 tháng) qua mô hình toán học Minitab 19 và xác lập hồ sơ an toàn sinh học tiền lâm sàng đạt $LD_{50} > 300$ mg/kg (GHS Nhóm 4).
6. Mở ra hướng nghiên cứu mới về công nghệ hóa dược trong nước, khẳng định năng lực tự chủ sản xuất nguyên liệu thuốc điều trị ung thư công nghệ cao, đóng góp nền tảng thiết thực cho nền y dược học Việt Nam hội nhập quốc tế.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1. Tổng quan về afatinib dimaleat Afatinib dimaleat là dược chất được phát triển bởi tập đoàn Boehringer- Ingelheim (Đức), thuộc nhóm thuốc chống ung thư tác dụng tại đích, ức chế không thuận nghịch các thụ thể tyrosin-kinase họ ErbB (EGFR) thế hệ II [80], [122]. Cấu trúc và tính chất hóa lý • Công thức cấu tạo (Hình 1.1 Công thức cấu tạo của afatinib dimaleat. • Công thức phân tử: C32H33ClFN5O11 (C24H25ClFN5O3.

• Tên khoa học: - (E)-N-[4-(3-cloro-4-fluoroanilino)-7-[(3S)-oxolan-3-yl] oxyquinazolin-6- yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamid, (2Z)-2-butendioat. - (2E)-N-{4-[(3-cloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[(3S)-tetrahydrofuran-3- yloxy]quinazolin-6-yl}-4-(dimethylamino)but-2-enamid di[(2Z)-but-2- endioat]; - (S,E)-N-{4-[(3-cloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[(tetrahydrofuran-3- yl)oxy]quinazolin-6-yl}-4-(dimethylamino)but-2-enamid dimaleat. • Tên chung quốc tế: Afatinib dimaleat [31]. • Công thức phân tử: C32H33ClFN5O11 (C24H25ClFN5O3.

• Khối lượng phân tử: 718,09 đvC [148]. • Thông số phân tử afatinib base : HD 2, HA 8, FRB 7, PSA 88,6, cLogP 1,569 [147]. • Biệt dược: Gilotrip, Giotrip (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Tác dụng dược lý và ứng dụng trong điều trị Dựa trên các tài liệu tham khảo [31], [107], [148], afatinib dimaleat có các đặc điểm dược động học, dược lý như sau: • Phân loại nhóm điều trị: 2 luan an Afatinib thuộc nhóm thuốc chống ung thư tác dụng tại đích, với cơ chế ức chế tyrosin-kinase (TKI), chọn lọc EGFR [31], [148].

• Cơ chế tác dụng: Afatinib dimaleat - hấp thu tốt đường uống, thuộc thế hệ 2 trong số các thuốc EGFR TKIs - có tác dụng ức chế tyrosin-kinase, họ thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR hay còn gọi là ErbB), bao gồm: ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB4 (HER4) [31]. Các thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì trên đây là một protein xuyên màng được chia làm 3 phần: vùng ngoại bào chứa miền tương tác với các yếu tố tăng trưởng biểu mô; vùng xuyên màng và vùng nội bào chứa miền kinase có thể phosphoryl hóa tyrosine của protein (là các thụ thể tyrosin-kinase ), đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản tế bào và tạo mạch của nhiều loại ung thư. Khi vùng ngoại bào được liên kết với yếu tố tăng trưởng biểu mô, hai phân tử EGFR kết hợp với nhau tạo dạng dimer hóa và tự phosphoryl hóa tyrosin ở miền kinase của vùng nội bào, Từ đó khởi động các con đường tín hiệu vào nhân: Ras/Raf/MEK/ERK hoặc PI3K/AKT/mTOR để điều khiển tế bào tăng trưởng, biệt hóa, phân chia, tăng sinh mạch máu, tránh sự tự chết theo chương trình (apoptosis)… Afatinib hoạt động bằng cách gắn vào miền tyrosine kinase của ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB4 (HER4), từ đó ức chế không thuận nghịch hoạt động autophosphoryl hóa, gây ức chế các con đường dẫn truyền tín hiệu vào nhân, ức chế tế bào tăng sinh, sinh trưởng của khối u, sự sinh mạch trong tế bào ung thư [31]. Ngoài ra afatinib dimaleat còn có tác dụng trên các dạng đột biến của EGFR như: EGFR mất exon 19 (del19), EGFR thay thế exon 21 (L858R), EGFR T790M 1 (đột biến thứ phát ở exon 20 của gen EGFR – đột biến đã kháng với các thuốc thế hệ 1) [148], [146].

3 luan an Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của afatinib dimaleat • Dược động học. Sau khi uống, thời gian đạt nồng độ đỉnh huyết tương (Tmax) là 2-5 giờ. Sinh khả dụng đường uống ở mức trung bình khi thử trên chuột (44,5 %) và thấp khi thử trên lợn con (11,2 %). Sinh khả dụng viên nén 20 mg đạt 92 % so với dung dịch uống.

Thức ăn làm giảm Cmax và AUC. Thuốc liên kết 95 % với protein huyết tương (chủ yếu là hemoglobin). Thể tích phân bố thử trên người là 2800-4700 lít sau khi uống. Thuốc bị chuyển hóa chủ yếu bằng con đường phi enzym thông qua phản ứng cộng Michael, một lượng nhỏ chuyển hóa nhờ xúc tác enzym CYP450.

Dạng liên kết cộng hóa trị afatinib-protein là các chất chính lưu thông trong máu. Afatinib được thải trừ chủ yếu qua phân (85 %), có 4 % được tái hấp thu từ đường tiết niệu (sau khi dùng dung dịch uống đơn liều). Thời gian bán thải: 29,6 giờ, chỉ số Cl/F sau khi uống là 1210 mL/phút • Chỉ định: Điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn tiến xa tại chỗ hoặc di căn có đột biến thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) cho bệnh nhân trưởng thành chưa được điều trị trước đó bằng thuốc ức chế EGFR tyrosine kinase. Được chỉ định để điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC), thuộc loại ung thư phổi tế bào vảy, tiến triển tại chỗ hoặc di căn, đang hoặc đã được hóa trị liệu bằng các dẫn chất của platin [31], [107].

• Dạng bào chế và liều lượng, cách sử dụng: 4 luan an Dạng thuốc và hàm lượng: Afatinib dimaleat được bào chế dưới dạng viên nén bao phim với các hàm lượng: 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg tính theo afatinib base [31], [107]. Liều dùng: Thông thường đối với người lớn mắc bệnh ung thư phổi không phải tế bào nhỏ là 40 mg, 1 lần/ngày cho điều trị bước một hoặc cho bệnh nhân chưa được điều trị trước đó bằng EGFR tyrosin-kinase. Điều trị liên tục đến khi bệnh tiến triển hoặc không còn dung nạp được. Có thể cân nhắc tăng đến liều tối đa 50 mg/ngày ở bệnh nhân chưa bao giờ dùng EGFR tyrosin-kinase mà dung nạp được liều 40 mg/ngày (không bị tiêu chảy, nổi ban, viêm miệng và các biến cố khác liên quan đến thuốc với mức độ >1 theo CTCAE) trong 3 tuần đầu tiên.

Không nên tăng liều ở bệnh nhân đã giảm liều trước đó. Liều tối đa 50 mg/ngày. Nếu chẩn đoán bệnh phổi mô kẽ hoặc xuất hiện suy gan nghiêm trọng: ngừng dùng. Bệnh nhân suy thận nặng (eGFR 15-29 mL/phút/1,73m2): chỉnh liều nếu không dung nạp.

• Tác dụng không mong muốn: Rất phổ biến: viêm quanh móng; giảm ngon miệng; chảy máu cam; tiêu chảy, viêm miệng, buồn nôn, nôn; phát ban, viêm da dạng trứng cá, ngứa, khô da [159]. Phổ biến: viêm bàng quang; mất nước, giảm kali máu; loạn vị giác; viêm kết mạc, khô mắt; chảy nước mũi; khó tiêu, viêm môi; tăng alanin-aminotransferase, tăng aspartat-aminotransferase; sưng bàn tay, cánh tay hoặc chân; suy giảm chức năng thận/suy thận; sốt; giảm cân [31], [107], [148], [150]. • Một số lưu ý khi sử dụng: Cần thận trọng trong các trường hợp: Bệnh nhân có tiền sử viêm giác mạc, viêm loét giác mạc, khô mắt nặng. Bệnh nhân có eGFR < 15 mL/phút/ 1,73 m2, lọc máu; suy gan nặng; trẻ em, thanh thiếu niên; thiếu Lapp-lactase, kém hấp thu glucose-galactose: không khuyến cáo/không nên dùng.

Nếu biểu hiện da bóng nước, phồng rộp, tróc vảy nặng; chẩn đoán viêm loét giác mạc; có phân suất tống máu thấp hơn giới hạn dưới của mức bình thường: tạm ngừng hoặc ngừng vĩnh viễn điều trị. Tăng nguy cơ xuất hiện biến cố ngoại ý qua trung gian EGFR ở bệnh nhân nữ, nhẹ cân và có sẵn suy thận. Dùng kết hợp vinorelbin gây tăng tỷ lệ tác dụng bất lợi và các biến cố gây tử vong liên quan nhiễm khuẩn và ung thư tiến triển. Không dùng kết hợp vinorelbin cho bệnh nhân ung thư vú di căn với HER2 dương tính.

Không cho con bú khi đang điều trị. Thường xuất hiện tiêu chảy trong 2 tuần điều trị đầu tiên, tiêu chảy mức độ 3 trong 6 tuần điều trị 5 luan an đầu tiên, nên chủ động xử trí: gồm bù đủ nước kết hợp thuốc chống tiêu chảy khi có những dấu hiệu tiêu chảy đầu tiên. Vẫn chưa có đầy đủ các nghiên cứu để xác định rủi ro khi dùng thuốc này trong thời kỳ mang thai hoặc cho con bú. Thuốc thuộc phân loại thai kỳ mức độ D - có bằng chứng liên quan đến nguy cơ ở thai nhi người, nhưng do lợi ích mang lại, việc sử dụng thuốc trong thai kỳ có thể được chấp thuận, bất chấp nguy cơ.

Thuốc có thể được hấp thu qua da và phổi, và có thể gây hại cho trẻ em trong bụng mẹ, nên những phụ nữ mang thai hoặc có thể có thai không nên cầm nắm hoặc hít phải bụi từ thuốc. Các triệu chứng quá liều có thể bao gồm: Buồn nôn; nôn mửa; suy nhược; choáng váng; đau đầu; đau bụng. Không ức chế hoặc cảm ứng các isoenzym CYP 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19 hoặc 3A4. Các thuốc ức chế mạnh glycoprotein P (P-gp) như ritonavir, cyclosporine A, ketoconazol, itraconazol, erythromycin, verapamil, quinidin, nelfinavir, amiodaron nên được dùng cách 6 hoặc 12 giờ.

Các thuốc cảm ứng mạnh P-gp như rifampicin, carbamazepin, phenytoin, phenobarbital, thảo dược St. John’s (Hypericum perforatum) có thể làm giảm nồng độ afatinib. Uống cùng bữa ăn giàu chất béo làm giảm đáng kể nồng độ theo thời gian của afatinib. Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng afatinib là chất nền và là chất ức chế protein kháng ung thư vú (BCRP) vận chuyển.

Afatinib có thể làm tăng sinh khả dụng của các chất nền BCRP dùng đường uống (gồm rosuvastatin và sulfasalazin), nên thận trọng khi dùng chung [122]. Các phương pháp tổng hợp afatinib dimaleat 1. Tổng hợp afatinib base Afatinib có cấu tạo khung quinazolin và các nhóm thế: nhóm amin thơm chứa các nguyên tử clor ở vị trí số 3 và fluor ở vị trí số 4, nhóm ether bất đối ở vị trí số 7, nhóm amid chứa trans anken ở vị trí số 6. Các phương pháp tổng hợp xoay quanh việc xây dựng nhân quinazolin và tạo nhóm thế trên khung này.

Các phương pháp tổng hợp đã được công bố đều đi qua các con đường gắn lần lượt các nhóm (1), (2), (4) ở trên vào khung quinazolin (3). Tuy nhiên thứ tự gắn các nhóm khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình. Dưới đây các phương pháp tổng hợp afatinib dựa theo phản ứng tổng hợp cuối cùng: 6 luan an Ether bất đối Amin thơm Khung quinazolin trans-alken Sơ đồ 1.1 Sơ đồ phân tích ngược cấu trúc phân tử afatinib base Phương pháp tạo liên kết amid từ: N-4-[(3-cloro-4-fluoro‐phenyl)]-7- {[(3S)-tetrahydrofuran-3-yl]oxy}-4,6-quinazolindiamin (5) Trong phương pháp này, trung gian 5 được acyl hóa bởi một số các tác nhân là acid hoặc các dẫn chất của nó như sau: Sơ đồ 1.2 Tổng hợp afatinib bằng phản ứng tạo liên kết amid Do chứa nhóm amin thơm – NH2 vì vậy trong phản ứng cần có các xúc tác khác tùy thuộc vào tác nhân acyl: a. Tổng hợp afatinib từ 5 và acid (E)-but-2-enoic Quy trình này được nhà hóa học Liu công bố năm 2019 [76]: 7 luan an Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp afatinib của Liu và cộng sự từ 5 và acid (E)-but-2-enoic Trong quy trình này gồm 6 giai đoạn, trong đó 5/6 phản ứng cho hiệu suất cao trên 80 %.

Tuy nhiên giai đoạn acyl hóa giữa trung gian 5 và acid (E)-but-2-enoic lại có hiệu suất thấp, đồng thời cần sử dụng một số tác nhân có giá thành cao như formamidin acetat, POCl3 hay AIBN. Các dung môi sử dụng có độc tính cao như dioxan, THF,.