Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ dược học "Nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat" được thực hiện bởi nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Ngọc dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Nguyễn Đình Luyện và TS. Nguyễn Văn Hải, bảo vệ tại Trường Đại học Dược Hà Nội năm 2021 (Chuyên ngành: Công nghệ Dược phẩm & Bào chế thuốc, Mã số: 9720202).

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Ung thư phổi là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới và tại Việt Nam. Theo các số liệu thống kê được tác giả trích dẫn trong phần Đặt vấn đề, thế giới ghi nhận khoảng 2 triệu ca mắc mới và 1,6 triệu ca tử vong mỗi năm do ung thư phổi. Tại Việt Nam, ung thư phổi đứng thứ hai về số ca mắc mới (khoảng 22.000 ca/năm, chiếm 17% tổng số ca ung thư mới) và số ca tử vong (khoảng 19.500 ca/năm), trong đó ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) chiếm tỷ lệ 85%.

Afatinib dimaleat (biệt dược Gilotrip, Giotrif của hãng Boehringer Ingelheim) là thuốc điều trị đích thế hệ II, ức chế không thuận nghịch họ thụ thể tyrosine kinase ErbB (gồm ErbB1/EGFR, ErbB2/HER2, ErbB4/HER4 và ErbB3), được phê duyệt sử dụng đầu tiên tại Mỹ và châu Âu năm 2013. Thuốc có hiệu quả điều trị bước một cho bệnh nhân NSCLC mang đột biến EGFR (như mất đoạn exon 19, đột biến thay thế L858R và đột biến kháng thuốc T790M). Tuy nhiên, giá thành điều trị bằng biệt dược gốc rất cao (khoảng 1.000 USD cho một hộp 30 viên 40 mg) do thuốc trong thời gian bảo hộ bản quyền, cấu trúc phân tử phức tạp và nguồn nguyên liệu tổng hợp đắt đỏ.

Khoảng trống nghiên cứu được xác định là: trong nước chưa có quy trình công nghệ hoàn chỉnh để tổng hợp afatinib dimaleat đạt tiêu chuẩn cơ sở dùng làm nguyên liệu làm thuốc, nhằm chủ động nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị ung thư phổi với giá thành hợp lý sau khi hết hạn bảo hộ sáng chế.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định 2 mục tiêu cụ thể:

  1. Xây dựng được quy trình tổng hợp afatinib dimaleat ở quy mô 20 g/mẻ đạt tiêu chuẩn cơ sở.
  2. Đánh giá được độ ổn định và đánh giá độc tính cấp của afatinib dimaleat tổng hợp được.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất afatinib dimaleat, các hợp chất trung gian trong quá trình tổng hợp (các dẫn chất quinazolin, dẫn chất sulfon, dẫn chất tetrahydrofuran, dẫn chất acid dimethylaminobut-2-enoic) và các tiêu chuẩn kiểm nghiệm, độ ổn định, độc tính cấp của sản phẩm.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, phối hợp với Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Khoa Hóa học (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN), Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia.
  • Phạm vi thời gian: Luận án hoàn thành và nghiệm thu năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tác giả đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu tổng hợp afatinib và khung quinazolin trên thế giới theo từng nhóm phản ứng chính:

Các hướng nghiên cứu tổng hợp afatinib đã công bố

  • Quy trình của hãng Boehringer Ingelheim (2002, 2003): Đăng ký trong các sáng chế WO0250043A1 và WO03094921A2, xuất phát từ acid 2-amino-4-fluoro-5-nitrobenzoic hoặc 2-amino-4-cloroanilin, tạo nhánh nối đôi trans thông qua phản ứng Wittig-Horner-Emmons giữa trung gian dialkyl phosphonat với 2-(dimethylamino)acetaldehyd hoặc acid sulfonic tương ứng. Phương pháp này cho độ chọn lọc trans cao nhưng trải qua nhiều giai đoạn phức tạp.
  • Quy trình của Liu và cộng sự (2019): Đi từ trung gian N-4-[(3-cloro-4-fluorophenyl)]-7-{[(3S)-tetrahydrofuran-3-yl]oxy}-4,6-quinazolindiamin và acid (E)-but-2-enoic qua 6 giai đoạn. Ưu điểm là 5/6 giai đoạn cho hiệu suất trên 80%, nhưng giai đoạn acyl hóa có hiệu suất thấp, phải dùng dung môi độc hại (dioxan, THF) và tác nhân đắt tiền (POCl3, AIBN, formamidin acetat).
  • Quy trình của Li và cộng sự (2016): Đi từ 3-bromo-6-nitrophenol, rút ngắn xuống 5 phản ứng với hiệu suất trên 85%. Tuy nhiên, phương pháp sử dụng nhôm trimethyl, dung môi toluen thể tích lớn và phải tinh chế qua sắc ký cột, không phù hợp điều kiện triển khai thực tế trong nước.
  • Quy trình của Xu và cộng sự (2013-2015): Tiếp cận theo các hướng: (1) Ngưng tụ trực tiếp với 3-cloro-4-fluoroanilin nhờ tác nhân ghép cặp BOP và base DBU; (2) Đi từ methyl 3-amino-4-hydroxybenzoat qua dẫn chất clo hóa; (3) Đi từ 4-cyanophenol qua 8 giai đoạn. Nhược điểm lớn của việc gắn vòng (S)-tetrahydrofuran ở giai đoạn đầu là làm hao hụt nguyên liệu quang hoạt đắt tiền qua nhiều bước chuyển hóa tiếp theo.
  • Quy trình của Tatjana K. và cộng sự (2018): Gồm 5 giai đoạn, sử dụng dạng amid của acid (E)-dimethylaminobut-2-enoic phản ứng ghép với dẫn chất chứa iod.
Tác giả / Tổ chức Năm Nguyên liệu khởi đầu Đặc điểm chính Hạn chế
Boehringer Ingelheim 2002, 2003 Acid 2-amino-4-fluoro-5-nitrobenzoic Phản ứng Wittig-Horner-Emmons tạo nối đôi trans Nhiều bước, quy trình tạo phosphonat phức tạp
Li và CS 2016 3-Bromo-6-nitrophenol Rút ngắn 5 bước, hiệu suất >85% Dùng Al(Me)3, sắc ký cột, dung môi toluen lớn
Tatjana K. và CS 2018 Dẫn chất iod 5 giai đoạn Chi phí nguyên liệu iod cao
Liu và CS 2019 Dẫn chất quinazolindiamin 6 giai đoạn Bước acyl hóa hiệu suất thấp, dùng AIBN, dioxan
Xu và CS 2013–2015 4-Cyanophenol / 3,4-AHBA Gắn sớm vòng (S)-tetrahydrofuran Quy trình 8 bước, hao hụt cấu tử quang hoạt

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Luận án lựa chọn thiết kế con đường tổng hợp hội tụ (convergent synthesis):

  1. Xây dựng khung quinazolin và chuyển hóa nhóm thế tại vị trí C-7 thành dẫn xuất sulfon rời đi tốt.
  2. Tổng hợp riêng phân đoạn mạch nhánh quang hoạt (S)-3-hydroxytetrahydrofuran từ nguyên liệu ban đầu giá rẻ là acid L-malic.
  3. Tổng hợp phân đoạn mạch nhánh acid (E)-4-dimethylaminobut-2-enoic hydroclorid từ acid crotonic.
  4. Gắn phân đoạn chiral (S)-tetrahydrofuran vào khung quinazolin ở giai đoạn muộn để bảo toàn nguyên liệu bất đối, sau đó khử nhóm nitro thành amin, tạo liên kết amid chọn lọc cấu hình E và tạo muối dimaleat dạng kết tinh A ổn định.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

  • Hóa học tổng hợp hữu cơ - dược chất: Ứng dụng lý thuyết tổng hợp dị vòng quinazolin (phương pháp Niementowski cải tiến và ngưng tụ formamid), phản ứng thế ái nhân trên nhân thơm hoạt hóa (SNAr thông qua nhóm rời đi sulfon), phản ứng khử chọn lọc nhóm nitro bằng hệ khử kim loại (Fe/NH4Cl), phản ứng ghép liên kết amid qua dẫn chất clorid acid/oxalyl clorid và phản ứng tạo muối chọn lọc dạng thù hình kết tinh.
  • Dược động học và cơ chế tác dụng: Khung phân tích tương tác ức chế không thuận nghịch tyrosine kinase của họ thụ thể ErbB (liên kết cộng hóa trị Michael acceptor tại nhóm acrylamid mang nối đôi trans với gốc cystein của kinase).
  • Hóa phân tích và kiểm nghiệm dược phẩm: Phương pháp xác định cấu trúc phân tử và đánh giá độ tinh khiết hóa học, tạp chất đối quang theo hướng dẫn ICH, Dược điển Việt Nam V và các tài liệu chuyên khảo quốc tế.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp tổng hợp hóa học: Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến từng phản ứng ở quy mô nhỏ (2 g/mẻ) gồm: tỷ lệ mol các chất phản ứng, dung môi, tác nhân xúc tác, nhiệt độ và thời gian phản ứng. Sau khi tối ưu hóa, quy trình được nâng quy mô lên 20 g/mẻ và đánh giá độ lặp lại qua 3 mẻ độc lập.
  • Phương pháp xác định cấu trúc:
    • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, DEPT).
    • Phổ tương quan 2 chiều (HSQC, HMBC).
    • Phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR).
    • Nhiệt độ nóng chảy ($t^o_{\text{nc}}$) và phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) để kiểm tra dạng kết tinh thù hình.
  • Phương pháp kiểm nghiệm chất lượng:
    • Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với chương trình gradient kiểm soát hàm lượng hoạt chất, tạp chất liên quan và tạp chất đối quang.
    • Sắc ký khí (GC) xác định dung môi tồn dư.
    • Phép đo quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) định lượng tạp chất kim loại (nickel).
    • Phương pháp chuẩn độ Karl-Fischer xác định hàm lượng nước.
    • Phương pháp chuẩn độ thể tích xác định hàm lượng acid maleic.
  • Phương pháp nghiên cứu độ ổn định: Đánh giá mẫu sản phẩm đóng gói kín theo 2 điều kiện:
    • Điều kiện lão hóa cấp tốc: Nhiệt độ $40 \pm 2^\circ\text{C}$, độ ẩm tương đối $75 \pm 5%$ RH trong 6 tháng.
    • Điều kiện dài hạn (điều kiện thực): Nhiệt độ $25 \pm 2^\circ\text{C}$, độ ẩm tương đối $60 \pm 5%$ RH trong 12 tháng.
    • Sử dụng phần mềm Minitab để tính toán và dự đoán tuổi thọ sản phẩm.
  • Phương pháp thử độc tính cấp: Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng theo hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD 423) và phân loại độc tính theo Hệ thống Hài hòa Toàn cầu (GHS).

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Phần Đặt vấn đề trình bày gánh nặng bệnh tật của ung thư phổi trên thế giới và tại Việt Nam, vai trò lâm sàng của afatinib dimaleat như một liệu pháp nhắm trúng đích quan trọng cho ung thư phổi không tế bào nhỏ di căn có đột biến EGFR. Tác giả phân tích lý do giá thành thuốc biệt dược quá cao và khẳng định việc chủ động nghiên cứu quy trình tổng hợp hoạt chất afatinib dimaleat đạt tiêu chuẩn cơ sở ở quy mô phòng thí nghiệm mở rộng (20 g/mẻ) là tiền đề cần thiết cho việc tự chủ sản xuất nguyên liệu làm thuốc trong nước.

Chương 1. Tổng quan

Nội dung chương 1 gồm các tiểu mục lớn:

  • Tổng quan về afatinib dimaleat:
    • Cấu trúc phân tử: $C_{32}H_{33}ClFN_5O_{11}$ ($C_{24}H_{25}ClFN_5O_3 \cdot 2 C_4H_4O_4$), khối lượng phân tử 718,09 đvC. Thông số hóa lý phân tử afatinib base: HD = 2, HA = 8, FRB = 7, PSA = 88,6, cLogP = 1,569.
    • Dược lý: Ứng dụng điều trị NSCLC có đột biến del19, L858R hoặc T790M. Dược động học: $T_{\max} = 2 - 5\text{ giờ}$, liên kết protein huyết tương 95%, thể tích phân bố 2.800–4.700 L, thải trừ qua phân 85%, thời gian bán thải $t_{1/2} = 29,6\text{ giờ}$, độ thanh thải $Cl/F = 1.210\text{ mL/phút}$.
  • Tổng quan các dạng kết tinh của muối afatinib dimaleat: Tổng hợp dữ liệu về các dạng thù hình từ A đến N. Luận án nhấn mạnh dạng khan A là dạng ổn định nhất, không bị chuyển dạng và có độ tan sinh học tốt.
Dạng kết tinh Trạng thái Điều kiện kết tinh Góc theta đặc trưng ($2\theta \pm 0,2^\circ$)
Dạng A Khan Dung môi MeOH ở 60°C, cất loại dung môi, thêm cyclohexan 6,6; 10,6; 15,3; 16,3; 24,2
Dạng B Khan Dung môi THF ở nhiệt độ phòng, khuấy 1 giờ 19,3; 22,1; 25,6
Dạng C Khan Dung môi THF ở nhiệt độ phòng, khuấy qua đêm 5,5; 9,3; 18,8; 19,1; 21,5
Dạng D Khan Dung môi EtOH ở 70°C, làm lạnh và khuấy qua đêm 5,6; 9,5; 22,1; 26,3; 29,5
Dạng E Trihydrat Không công bố chi tiết điều kiện 5,5; 11,4; 17,7; 22,3; 25,5
Dạng G Hydrat Aceton ở 50°C hoặc Aceton : MeOH (19:1) ở 50°C 5,5; 9,0; 15,9; 17,1; 22,6
Dạng M Khan Acetonitril, sau đó thêm ethyl acetat 5,5; 10,9; 12,6; 17,3; 21,9; 25,1
Dạng N Khan Dung môi THF (cần mầm tinh thể dạng N) 5,2; 5,4; 15,7; 21,1; 27,4
  • Tổng quan phương pháp tạo khung quinazolin và tạo liên kết amid: Tổng kết các phản ứng kinh điển (Niementowski, ngưng tụ formamid, phản ứng qua base Schiff, phản ứng Bergman) và các tác nhân halogen hóa/ghép đôi amid hóa ($SOCl_2$, $(COCl)_2$, $POCl_3$, CDI, DCC, EDC, T3P, BroP, CDMT...).
  • Lựa chọn con đường tổng hợp: Lựa chọn phương án tổng hợp hội tụ 4 nhánh chính, kiểm soát cấu hình trans bằng cách tổng hợp sẵn acid (E)-4-dimethylaminobut-2-enoic hydroclorid.

Chương 2. Nguyên liệu, trang thiết bị và phương pháp nghiên cứu

  • Liệt kê đầy đủ các hóa chất, dung môi phân tích (đạt tiêu chuẩn AR hoặc HPLC) và danh mục máy móc thiết bị: máy đo điểm chảy hiển vi điện tử, máy đo phổ hồng ngoại FTIR, máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS, máy NMR Bruker 500 MHz, hệ thống HPLC Agilent 1260/1200 trang bị đầu dò DAD, tủ thử độ ổn định Binder.
  • Trình bày chi tiết quy trình thực nghiệm tổng hợp các chất trung gian:
    1. Tổng hợp dẫn chất quinazolin: $N-01 \rightarrow N-02 \rightarrow N-03 \rightarrow N-04 \rightarrow N-05$.
    2. Tạo dẫn chất sulfon $N-06a, N-06b$.
    3. Tổng hợp $(S)\text{-3-hydroxytetrahydrofuran}$ ($N-09$) từ acid L-malic qua $N-07$ (dimethyl (S)-malat) và $N-08$ ((S)-butan-1,2,4-triol).
    4. Phản ứng ether hóa tạo $N-10$, tiếp theo là khử nhóm nitro tạo amin $N-11$.
    5. Tổng hợp acid $(E)\text{-4-dimethylaminobut-2-enoic hydroclorid}$ ($N-13$) từ acid crotonic qua $N-12$ (acid (E)-4-bromobut-2-enoic).
    6. Ghép tạo afatinib base và phản ứng tạo muối afatinib dimaleat.
  • Xây dựng phương pháp phân tích HPLC với chương trình rửa giải gradient sử dụng pha động gồm đệm phosphat và acetonitril để định lượng và kiểm soát tạp chất.

Chương 3. Thực nghiệm và kết quả

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu khảo sát tối ưu hóa ở quy mô 2 g/mẻ, nâng quy mô 20 g/mẻ, kiểm nghiệm TCCS, độ ổn định và thử độc tính cấp:

                  [Acid L-malic]
                   (N-07 -> N-08)
                 [(S)-3-OH-THF (N-09)]
                                                  [Afatinib base]
                                               [Afatinib dimaleat (Form A)]

1. Khảo sát tối ưu hóa quy trình (2 g/mẻ)

  • Đóng vòng tạo N-02b: Ngưng tụ acid 2-amino-4-fluorobenzoic ($N-01b$) với formamid ở $140^\circ\text{C}$ với tỷ lệ mol $N-01b : \text{formamid} = 1 : 5$, cho hiệu suất cao.
  • Nitro hóa tạo N-03b: Khảo sát tác nhân $HNO_3 / H_2SO_4$, kiểm soát nhiệt độ từ $0 - 5^\circ\text{C}$ sau đó nâng lên nhiệt độ phòng, trung hòa bằng dung dịch kiềm để thu tủa.
  • Tổng hợp dẫn chất sulfon N-06a: Khảo sát phản ứng thế nucleophil nhóm halogen hoặc trung gian của $N-05b$ với natri benzensulfinat trong DMF ở $80 - 90^\circ\text{C}$, cho hiệu suất tạo $N-06a$ vượt trội và sản phẩm dễ kết tinh, độ tinh khiết cao.
  • Tổng hợp nhánh chiral N-09: Khảo sát ester hóa acid L-malic bằng $SOCl_2/\text{MeOH}$ thu $N-07$ (hiệu suất $>88%$), khử hóa bằng $NaBH_4$ trong THF thu $N-08$, sau đó đóng vòng với xúc tác acid $p\text{-toluensulfonic}$ thu $(S)\text{-3-hydroxytetrahydrofuran}$ ($N-09$).
  • Ether hóa tạo N-10: So sánh phản ứng thế giữa $N-09$ với $N-06a$ hoặc $N-05b$ dưới tác động của base $t\text{-BuOK}$ trong dung môi THF/DMF. Sử dụng trung gian sulfon $N-06a$ cho phản ứng êm dịu, thời gian ngắn hơn và hiệu suất cao hơn so với thế trực tiếp trên dẫn chất flo $N-05b$.
  • Khử nhóm nitro tạo N-11: Khảo sát tác nhân khử $Fe/NH_4Cl$ trong cồn-nước ở nhiệt độ hồi lưu. Phương pháp này bảo toàn nguyên vẹn liên kết ether bất đối và không gây khử vòng quinazolin so với phương pháp hydro hóa áp suất cao.
  • Tổng hợp N-13: Brom hóa acid crotonic bằng NBS trong $CCl_4$ có xúc tác benzoyl peroxid thu $N-12$, tiếp tục thế với dimethylamin trong ethanol và tạo muối hydroclorid thu $N-13$ giữ nguyên cấu hình trans.
  • Ghép amid và tạo muối: Hoạt hóa $N-13$ bằng oxalyl clorid với lượng vết DMF trong DCM ở $0 - 5^\circ\text{C}$, sau đó phản ứng với amin $N-11$ có mặt triethylamin thu afatinib base. Base được hòa tan trong methanol/aceton, phản ứng với acid maleic theo tỷ lệ mol $1 : 2,05$ ở $55 - 60^\circ\text{C}$, kết tinh trong cyclohexan thu afatinib dimaleat dạng A. Tinh chế lại bằng dung môi isopropanol (IPA) cho độ tinh khiết cao nhất.

2. Kết quả nâng quy mô 20 g/mẻ và kiểm nghiệm chất lượng

Quy trình được thực hiện lặp lại trên 3 mẻ 20 g, kết quả cho thấy độ ổn định cao về hiệu suất giữa các mẻ.

Hợp chất / Giai đoạn Khối lượng sản phẩm trung bình (g) Hiệu suất trung bình (%)
$N-02b$ (7-fluoroquinazolin-4(3H)-on) 18,52 87,4
$N-03b$ (7-fluoro-6-nitroquinazolin-4(3H)-on) 21,30 83,6
$N-05b$ (7-fluoro-N-(3-cloro-4-fluorophenyl)-6-nitroquinazolin-4-amin) 26,45 81,2
$N-06a$ (Dẫn chất sulfon trung gian) 31,20 85,8
$N-07$ (Dimethyl (S)-malat) 21,60 89,2
$N-08$ ((S)-butan-1,2,4-triol) 12,40 82,5
$N-09$ ((S)-3-hydroxytetrahydrofuran) 8,15 78,3
$N-10$ (Ether trung gian nitro) 24,10 82,6
$N-11$ (Amin trung gian sau khử) 18,90 86,4
$N-12$ (Acid (E)-4-bromobut-2-enoic) 27,80 72,5
$N-13$ (Acid (E)-4-dimethylaminobut-2-enoic HCl) 21,15 80,4
Afatinib base 19,85 76,8
Afatinib dimaleat thô 24,60 84,2
Afatinib dimaleat tinh chế (TCCS) 21,80 88,6

Sản phẩm afatinib dimaleat tổng hợp ở quy mô 20 g/mẻ được kiểm nghiệm theo Tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng, đạt đầy đủ các chỉ tiêu:

  • Bột kết tinh màu trắng đến vàng nhạt, tan tốt trong nước.
  • Định tính: Phổ IR, MS, $^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$ trùng khớp cấu trúc chuẩn; thời gian lưu HPLC tương đương mẫu đối chiếu.
  • Dạng kết tinh: Đạt dạng thù hình khan A (khẳng định bằng XRD).
  • Độ tinh khiết sắc ký (HPLC): Hàm lượng hoạt chất đạt $>99,0%$; tổng tạp chất $<0,5%$; không phát hiện đồng phân quang học không mong muốn (tạp đối quang $<0,1%$).
  • Kim loại nặng (AAS): Tạp chất nickel nằm trong giới hạn cho phép ($<10\text{ ppm}$).
  • Hàm lượng nước (Karl-Fischer): $<1,0%$.
  • Dung môi tồn dư (GC): Đều nằm dưới giới hạn ICH.

3. Kết quả đánh giá độ ổn định

  • Điều kiện lão hóa cấp tốc ($40^\circ\text{C}, 75%\text{ RH}$): Theo dõi tại các mốc 0, 1, 2, 3 và 6 tháng trên 3 lô mẫu. Các chỉ tiêu về cảm quan, hàm lượng hoạt chất, tạp chất phân hủy, độ ẩm và tạp đối quang đều không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê, nằm trong giới hạn TCCS.
  • Điều kiện dài hạn ($25^\circ\text{C}, 60%\text{ RH}$): Theo dõi trong 12 tháng, hoạt chất duy trì hàm lượng trên $99%$, không phát sinh tạp chất lạ.
  • Dự đoán tuổi thọ: Sử dụng phần mềm Minitab phân tích xu hướng suy giảm hàm lượng theo thời gian, kết quả ngoại suy tuổi thọ dự đoán của nguyên liệu là trên 36 tháng khi bảo quản ở điều kiện thường, tránh ẩm và ánh sáng.

4. Kết quả thử độc tính cấp

  • Đánh giá trên chuột nhắt trắng theo sơ đồ liều OECD 423 (bắt đầu từ mức liều 300 mg/kg, lặp lại và thử liều cao hơn).
  • Kết quả ghi nhận: Ở mức liều 300 mg/kg, chuột sống 100%, hoạt động bình thường, không có biểu hiện nhiễm độc cấp hay thay đổi thể trọng bất thường qua 14 ngày theo dõi.
  • Phân loại độc tính theo thang GHS: Afatinib dimaleat tổng hợp được xếp vào Nhóm 4 ($300\text{ mg/kg} < LD_{50} \le 2000\text{ mg/kg}$), tương đương với mức độ độc tính của nguyên liệu chuẩn theo các tài liệu công bố quốc tế.

Chương 4. Bàn luận

Tác giả đi sâu phân tích cơ chế hóa học và tính hợp lý của các giải pháp kỹ thuật:

  • Cơ chế phản ứng thế sulfon: Việc chuyển đổi vị trí C-7 thành nhóm phenylsulfon ($N-06a$) làm tăng mật độ thiếu hụt điện tích tại tâm phản ứng, giúp phản ứng thế với alcol bậc hai $(S)\text{-3-hydroxytetrahydrofuran}$ diễn ra trong điều kiện êm dịu ($40 - 50^\circ\text{C}$), hạn chế sự phân hủy của vòng tetrahydrofuran và không gây racemic hóa tâm bất đối.
  • Chọn lọc tác nhân khử nitro: Sử dụng bột sắt trong môi trường amoni clorid ($Fe/NH_4Cl$) cho phép khử chọn lọc nhóm nitro ở vị trí C-6 thành nhóm amin tự do ($N-11$) mà không làm ảnh hưởng đến cấu hình trans hay liên kết ether bất đối, đồng thời quy trình xử lý dịch chiết đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị áp suất cao như xúc tác $Pd/C - H_2$.
  • Bảo toàn cấu hình trans trong liên kết amid: Phản ứng ghép giữa $N-11$ và acid clorid của $N-13$ được thực hiện ở nhiệt độ thấp ($0 - 5^\circ\text{C}$) trong dung môi DCM với sự có mặt của triethylamin, ngăn ngừa hoàn toàn phản ứng đồng phân hóa sang dạng cis (Z).
  • Vấn đề an toàn lao động và môi trường: Luận án đề xuất giải pháp thu hồi dung môi (DCM, IPA, methanol), xử lý khí thải acid sinh ra từ phản ứng halogen hóa bằng hệ thống hấp thụ dung dịch kiềm, thay thế các dung môi đặc biệt độc hại như dioxan hay benzen bằng dung môi an toàn hơn.

Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về quy trình tổng hợp, tiêu chuẩn kiểm nghiệm và dữ liệu thử nghiệm an toàn, đồng thời đưa ra các kiến nghị về nghiên cứu mở rộng quy mô pilot và thử nghiệm bào chế viên nén.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn

  1. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình công nghệ tổng hợp afatinib dimaleat: Thiết kế thành công quy trình tổng hợp hội tụ qua các trung gian chủ chốt, đạt hiệu suất tổng thể ổn định, kiểm soát được cấu hình quang học (S) và cấu hình hình học (E) của phân tử mà không cần dùng phương pháp sắc ký cột phức tạp.
  2. Cải tiến phản ứng thế ái nhân qua trung gian sulfon: Ứng dụng thành công dẫn chất phenylsulfon trên khung quinazolin, giúp phản ứng ether hóa với $(S)\text{-3-hydroxytetrahydrofuran}$ đạt hiệu suất cao trong điều kiện nhẹ nhàng, tiết kiệm nguyên liệu quang hoạt đắt tiền.
  3. Chủ động nguồn nguyên liệu mạch nhánh: Thiết lập quy trình điều chế $(S)\text{-3-hydroxytetrahydrofuran}$ từ acid L-malic và acid $(E)\text{-4-dimethylaminobut-2-enoic hydroclorid}$ từ acid crotonic từ các hóa chất cơ bản, dễ tìm trên thị trường trong nước.
  4. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và dữ liệu khoa học toàn diện: Thiết lập trọn bộ tiêu chuẩn kiểm nghiệm TCCS cho nguyên liệu afatinib dimaleat (gồm cả định lượng tạp đối quang và định lượng nickel), cung cấp bộ dữ liệu độ ổn định đầy đủ (cấp tốc và dài hạn) cùng phân loại độc tính cấp theo tiêu chuẩn quốc tế OECD/GHS.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

  • Tiếp tục nghiên cứu nâng quy mô tổng hợp lên cấp độ pilot (vài trăm gam đến kilogam/mẻ) nhằm hoàn thiện các thông số công nghệ phục vụ sản xuất công nghiệp.
  • Ứng dụng nguyên liệu afatinib dimaleat tổng hợp được để nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế viên nén bao phim tương đương sinh học với biệt dược gốc Gilotrip/Giotrif.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế: Quy trình tổng hợp mới được khảo sát và khẳng định độ lặp lại ở quy mô phòng thí nghiệm mở rộng (20 g/mẻ), chưa được thử nghiệm trên các hệ thống thiết bị pilot chuyên dụng của nhà máy GMP. Dữ liệu độ ổn định dài hạn trong văn bản mới dừng ở mốc 12 tháng thực nghiệm.
  • Hướng nghiên cứu tiếp:
    • Tối ưu hóa các công đoạn thu hồi dung môi và tự động hóa các bước kiểm soát nhiệt độ ở quy mô lớn hơn.
    • Nghiên cứu độ ổn định dài hạn ở các mốc 24 và 36 tháng.
    • Triển khai nghiên cứu bào chế thuốc thành phẩm dạng viên nén bao phim 20 mg, 30 mg, 40 mg và 50 mg.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao cho:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên chuyên ngành Hóa dược, Công nghệ Dược phẩm và Hóa học hữu cơ: Tham khảo về phương pháp thiết kế con đường tổng hợp bất đối, kỹ thuật đóng vòng quinazolin, kỹ thuật bảo toàn cấu hình trans và các phương pháp phổ nghiệm hiện đại ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, 2D-NMR, MS, XRD).
  • Cán bộ nghiên cứu R&D tại các viện nghiên cứu và nhà máy dược phẩm: Tham khảo quy trình thực nghiệm chi tiết mẻ 20 g, các bước xử lý dịch chiết/kết tinh, phương pháp tinh chế bằng IPA và phương pháp kiểm nghiệm chất lượng hoạt chất chống ung thư bằng HPLC.
  • Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách dược: Cung cấp cơ sở khoa học và dữ liệu kỹ thuật về tính khả thi của việc tự chủ sản xuất nguyên liệu làm thuốc điều trị ung thư đích tại Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Afatinib dimaleat có công thức phân tử và khối lượng phân tử là bao nhiêu?

Afatinib dimaleat có công thức phân tử là $C_{32}H_{33}ClFN_5O_{11}$ (tương ứng với muối chứa 1 phân tử afatinib base $C_{24}H_{25}ClFN_5O_3$ và 2 phân tử acid maleic $C_4H_4O_4$), khối lượng phân tử là 718,09 đvC.

2. Dạng kết tinh nào của afatinib dimaleat được luận án lựa chọn để phát triển và vì sao?

Luận án lựa chọn dạng kết tinh khan A. Đây là dạng kết tinh ổn định nhất trong điều kiện môi trường xung quanh, không bị chuyển đổi dạng thù hình, hạn chế được sự thủy phân so với các dạng hydrat và có độ hòa tan tốt trong điều kiện sinh lý, phù hợp nhất để làm nguyên liệu sản xuất thành phẩm.

3. Nguyên liệu khởi đầu được sử dụng để tổng hợp mạch nhánh quang hoạt (S)-3-hydroxytetrahydrofuran (N-09) là gì?

Nhánh quang hoạt $N-09$ được tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là acid L-malic qua 3 bước chuyển hóa: ester hóa tạo dimethyl (S)-malat ($N-07$), khử hóa bằng $NaBH_4$ tạo (S)-butan-1,2,4-triol ($N-08$) và đóng vòng xúc tác acid tạo $(S)\text{-3-hydroxytetrahydrofuran}$ ($N-09$).

4. Tác nhân nào được sử dụng để khử chọn lọc nhóm nitro ở vị trí C-6 trên khung quinazolin?

Tác nhân khử được lựa chọn là bột sắt trong môi trường dung dịch amoni clorid ($Fe/NH_4Cl$) ở nhiệt độ hồi lưu. Phương pháp này khử chọn lọc nhóm nitro thành nhóm amin ($N-11$) mà không làm ảnh hưởng đến cấu hình quang học và liên kết ether của phân tử.

5. Kết quả thử độc tính cấp của afatinib dimaleat tổng hợp được phân loại như thế nào theo thang GHS?

Sản phẩm afatinib dimaleat tổng hợp được thử nghiệm trên chuột nhắt trắng theo hướng dẫn OECD 423 và được phân loại độc tính vào Nhóm 4 ($300\text{ mg/kg} < LD_{50} \le 2000\text{ mg/kg}$) theo Hệ thống Hài hòa Toàn cầu (GHS).

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Ngọc đã xây dựng thành công quy trình công nghệ tổng hợp hoạt chất afatinib dimaleat ở quy mô 20 g/mẻ thông qua con đường tổng hợp hội tụ hợp lý. Quy trình đạt độ lặp lại cao, sản phẩm tinh chế thu được ở dạng kết tinh khan A, đạt đầy đủ các chỉ tiêu theo Tiêu chuẩn cơ sở đã thiết lập và kiểm soát chặt chẽ tạp chất quang học cũng như kim loại nặng. Hoạt chất chứng minh được độ ổn định cao qua thử nghiệm lão hóa cấp tốc, điều kiện dài hạn và được xếp vào Nhóm 4 về độc tính cấp theo thang phân loại GHS, cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc phát triển thuốc điều trị ung thư phổi tại Việt Nam.