Phần Mở đầu: Nêu tính cấp thiết của luận án, khái quát chung về nội dung và mục đích nghiên cứu của luận án. Tổng quan: Giới thiệu về các đối tượng nghiên cứu, phương pháp nghiên cứu cũng như các nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến các đối tượng và phương pháp nghiên cứu. Thực nghiệm: Trình bày về vật liệu và các phương pháp chế tạo, nghiên cứu. Kết quả và thảo luận: Đánh giá về những kết quả nghiên cứu đã đạt được của luận án.
Các đóng góp mới Danh mục các công bố liên quan đến luận án Tài liệu tham khảo: Liệt kê các tài liệu tham khảo đã sử dụng để nghiên cứu và thực hiện luận án. Phụ lục: Trình bày các bảng biểu số liệu đo đạc liên quan tới kết quả của luận án. Tổng quan về collagen 1. Cấu tạo và cấu trúc phân tử collagen Đơn vị cấu trúc cơ bản của collagen là tropocollagen có chiều dài khoảng 300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm, gồm ba chuỗi polypeptide xoắn lại với nhau (Hình 1.
Các chuỗi trong collagen được ổn định bởi liên kết hydro giữa các nhóm –CO– và –NH– kế liền nhau trên mạch polypeptide [12]. Cấu trúc của collagen Mỗi chuỗi polypeptide chứa khoảng 1050 amino acid, trong đó chủ yếu là glycine (khoảng 33%), proline (25%) và hydroxyproline. Trong mỗi chuỗi polypeptide của collagen, các amino acid có sự lặp lại của bộ ba amino acid Gly-X- Y, (X thường là prolin, Y thường là hydroxyprolin hoặc hydroxylysin). Với những collagen không có cấu trúc sợi, sự lặp lại của bộ ba Gly-X-Y có thể bị gián đoạn ở những vị trí xác định trong những đoạn xoắn ba [13].
Hàm lượng các amino acid trong collagen có nguồn gốc từ cá thấp hơn collagen có nguồn gốc từ động vật. Amino acid trong collagen của cá ở môi trường ấm cao hơn môi trường lạnh. Các amino acid này giúp ổn định cấu trúc xoắn của collagen bởi nhóm hydroxyl của hydroxyprolin do hình thành liên kết hydro với nhóm carbonyl của chuỗi peptid kế bên và một phân tử nước làm cầu nối trung gian (Hình 1. Sự tham gia của hydroxyproline vào liên kết hydro giữa các chuỗi polypeptide Persikov đã nghiên cứu sự ổn định của phân tử collagen dựa trên trình tự Gly-X-Hyp và Gly-Pro-Y, từ đó xác định được các amino acid trên các vị trí X và Y, ở vị trí của X thường gặp các amino acid: Pro, Glu, Ala, Lys, Arg, Gln, và Asp; ở vị trí Y thường gặp các amino acid là: Hyp, Arg, Met, Ile, Gln, và Ala; các amino acid thơm và Gly ít ổn định ở cả hai vị trí X và Y [14].
Độ ổn định nhiệt của collagen được tăng lên nhờ hydroxyprolin. Sakikabara đã nghiên cứu (1973) chỉ ra sự ổn định của mạch polypeptide (Pro-Hyp-Gly)10 (Tm = 58oC) cao hơn so với mạch polypeptide (Pro-Pro-Gly)10 (Tm = 24oC) [15]. Sự bền nhiệt này là do nhóm hydroxyl của Hyp hướng ra phía bề mặt ngoài cấu trúc xoắn ốc, không tham gia vào liên kết hydro bên trong cấu trúc nên nhóm này sẽ tham gia hình thành liên kết hydro nhờ cầu nối trung gian là phân tử nước [15]. Lúc này, nhóm hydroxyl đóng vai trò liên kết với phân tử H2O nội và ngoại phân tử thành những cầu nước liên tục nhau [16].
Do đó, sự lặp lại của bộ ba amino acid Gly-X-Y trong mỗi chuỗi polypeptide cho phép hình thành cấu trúc xoắn ba với amino acid glycine cuộn vào bên trong lõi xoắn ốc còn các amino acid X và Y lộ ra phía bề mặt ngoài (Hình 1. Cấu trúc xoắn ba của collagen 6 Trong thành phần cấu tạo của collagen, số lượng các amino acid có tính acid gần bằng số lượng các amino acid có tính base. Vì vậy, collagen vẫn giữ được trạng thái cân bằng về điện trong những điều kiện sinh lý khác nhau [17]. Các phương pháp thường được dùng để tách các phân tử collagen từ các bó sợi là dùng các enzyme (như pepsin) để phân cắt các chuỗi polypeptide ra khỏi phân tử collagen (loại bỏ được các liên kết ngang ngoại phân tử), do đó dễ dàng thu hồi collagen [17].
Trong động vật, các phân tử collagen sẽ kết tụ với nhau tạo thành vi sợi (microfibril). Các vi sợi là đơn vị cấu trúc để hình thành các sợi, bó sợi lớn hơn và các mạng lưới có trong mô, xương và các màng cơ bản (Hình 1. Một số dạng sinh học của chuỗi xoắn 3 collagen 1. Phân loại collagen Trong cơ thể người, tồn tại 28 loại collagen được được liệt kê trong Bảng 1.
Chúng gồm hai nhóm chính: dạng sợi và không phải dạng sợi gồm: collagen dạng màng, chuỗi hạt, chuỗi ngắn, dạng chuyển màng và một số loại khác. Collagen dạng sợi Là dạng phổ biến với hàm lượng hơn 90% lượng collagen trong cơ thể. Collagen dạng sợi có chiều dài chu kỳ khoảng 64-67 nm, được lặp đi lặp lại. Mỗi sợi 7 collagen tạo bởi các đại phân tử tropocollagen với kích thước: dài 300 nm, rộng 15 nm và được sắp xếp so le nhau.
Hai phân tử liên tiếp cách nhau 40 nm (Hình 1. Sự sắp xếp của collagen dạng sợi Nhóm dạng sợi gồm: collagen loại I (có nhiều trong da, gân, xương, giác mạc, phổi, mạch máu); collagen loại II (thành phần quan trọng của sụn); collagen loại III (có tính chất đàn hồi do vậy có nhiều trong mô liên kết như : như phổi, da, mạch máu); collagen loại V được liên kết với loại I (có trong giác mạc); collagen loại XI được liên kết với loại II (có trong cấu tạo của sụn) (Bảng 1. Collagen dạng sợi có mỗi chuỗi α, có vùng xoắn ốc dài và lặp lại liên tục của bộ ba (Gly-X- Y)n, (n = 337–343, tuỳ thuộc loại collagen) [20]. Cấu trúc các loại collagen [20] Dạng collagen Loại Cấu trúc phân tử I [α1(I)]2α2(I) II [α1(II)]3 III [α1(III)]3 Dạng sợi V [α1(V)]3; [α1(V)]2α2(V); α1(V)α2(V) α3(V) XI α1(XI)α2(XI)α3(XI) XXIV [α1(XXIV)]3 XXVII [α1(XXVII)]3 [α1(IV)]2α2(IV); α3(IV)α4(IV) α5(IV); Dạng màng IV [α5(IV)]2α6(IV) 8 VII [α1(VII)]3 XV [α1(XV)]3 XVIII [α1(XVIII)]3 Dạng chuỗi hạt VI α1(VI)α2(VI)α3(VI); α1(VI)α2(VI)α4(VI) Dạng chuỗi VIII [α1(VIII)]3; [α2(VIII)]3; [α1(VIII)]2α2(VIII) ngắn X [α1(X)]3 IX α1(IX)α2(IX)α3(IX) XII [α1(XII)]3 XIV [α1(XIV)]3 FACIT XVI [α1(XVI)]3 collagen XIX [α1(XIX)]3 XX [α1(XX)]3 XXI [α1(XXI)]3 XXII [α1(XXII)] XIII [α1(XIII)]3 Collagen XVII [α1(XVII)]3 chuyển màng XXIII [α1(XXIII)]3 XXV [α1(XXV)]3 Các loại XXVI [α1(XXVI)]3 collagen khác XXVIII [α1(XXVIII)]3 1.
Collagen dạng màng [12] Collagen loại IV là dạng phổ biến nhất, là thành phần màng phân cách giữa các cơ quan, màng trong, hạ bì, mô cơ và tế bào thần kinh và mô cơ. Collagen IV dài hơn và bị bị gián đoạn một số vị trí trong chu trình lặp bộ ba Gly-X-Y. Phân tử có hai đầu đầu 7S và NC1 khác với dạng sợi là không có hai đầu teleopeptide N và C. Phân tử collagen IV kết tụ lại với nhau nhờ vào sự hình thành liên kết tại hai vùng 7S và NC1, sự tương tác tại các vùng xoắn ốc và tương tác giữa các thành phần khác của màng để hình thành lên cấu trúc mạng lưới (Hình 1.
Sự sắp xếp của một số loại collagen không tạo cấu trúc sợi Trong số collagen của động vật thì vùng xoắn ốc của collagen VII là dài nhất (chiều dài 420 nm) vàbị gián đoạn tại các điểm ở hai đầu vùng NC1 và NC2. Collagen này có ở ranh giớ nối giữa lớp trung và biểu bì, với chức năng sợi neo giữ các cấu trúc (Hình 1. Collagen loại XVIII và XV có nhiều đoạn kết tụ lại với nhau, gọi là loại hỗn hợp. Hai loại này tạo liên kết với các màng và liên kết cộng hoá trị với các chuỗi glycosaminoglycan gọi là các proteoglycan.
Collagen chuỗi hạt Collagen chuỗi hạt là loại phổ biến đóng vai trò duy trì hình dạng và trạng thái các mô. Các phân tử chuỗi hạt có các vùng xoắn ốc ngắn (bằng 1/3 so với dạng sợi). Phân tử collagen VI liên kết với nhau tao chuỗi hạt, có chiều dài chu kỳ 110 nm (Hình 1. Collagen chuỗi ngắn Gồm collagen loại X và VIII, là thành phần của tế bào sụn và biểu bì.
Vùng xoắn ba có chiều dài bằng 1/2 dạng sợi và có nhiều vùng gián đoạn. Hai loại này tham gia hình thành giác mạc (collagen VIII) và sụn (collagen X) (Hình 1. FACIT collagen Là loại collagen đầu tiên được tìm thấy. Loại này có collagen IX, là thành phần chính của sợi collagen trong sụn.
Collagen IX là heterotrime dạng α1(IX)α2(IX)α3(IX) gồm: phân tử glycosaminoglycan liên kết với chuỗi α2(IX) nên 10 gọi là proteoglycan. Trên bề mặt các collagen II và XI liên kết với collagen IX có trong sụn bằng với các dẫn xuất của lysin bằng liên kết cộng hoá trị. Collagen sợi không liên kết với collagen XVI, XIX và XXII mà được phân bố trong các mô khác nhau, như collagen XXII có ở màng biên giữa các mô; collagen collagen loại I liên kết với XII có trong dây chằng, giác mạc, gân, và da. Tính chất của collagen 1.
Sự hút ẩm của collagen Collagen không tan trong H2O nhưng hút ẩm làm tăng thể tích, độ bền liên kết giảm. Khi hút nước, collagen bị ion hóa do tương tác giữa các nhóm phân cực khác với kiểu Van der Waals. Phân tử H2O phân cực gây ảnh hưởng đến liên kết hydro của chuỗi polypeptide trong collagen làm yếu liên kết. Collagen liên kết với H2O và dãn nở làm tăng độ dày lên khoảng 25% mà độ dài không tăng kết quả tổng thể tích phân tử collagen tăng lên [19].
Tỉ lệ giãn nở của collagen có giới hạn (7 % cho sợi ướt và 5 % cho sợi khô). Ở 60 oC, dưới tác động của chất điện ly, collagen hút ẩm, trương nở và co ngắn bằng 1/3 - 1/4 chiều dài ban đầu. Tiếp tục đun nóng, collagen bị thủy phân thành gelatin. Collagen tan trong glyxerin, acetic acid, dung dịch ure và không tan trong H2O lạnh.
Độ bền kéo đứt của collagen lớn dùng làm băng gạc trong y học, xương, gân, dây chằng, sụn và da. Kết hợp với keratin làm tăng độ mềm, độ dẻo dai của da. Trong quá trình lão hóa, collagen bị thoái hóa sẽ gây ra nếp nhăn trên da [21]. Đun sôi dung dịch collagen tạo thành gelatin, khi đó vòng xoắn ba mở xoắn do phá vỡ các liên kết hydro.
Gelaton và galactose là các sản phẩm thủy phân của gelatin. Tỷ lệ giữa gelatin/gelaton/galatose phụ thuộc vào thời gian đun và nhiệt độ đun. Enzym trysin và pepsin có tác dụng thủy phân chậm collagen và thủy phân nhanh gelatin. Collagen bị kết tủa tạo sợi dày khi bổ sung alchol, acetone hoặc muối đặc biệt là heparin [21].
C102H149N31O38 + H2O → C102H151N31O39 Collagen Gelatin C102H151N31O39 + 2 H2O → C55H85N17O22 + C47H70O19 + 7N2 Gelatin Gelstose Gletone 11 1. Sự tương tác của collagen với acid và kiềm Collagen là chất lưỡng tính, nó có thể tác dụng với acid và kiềm do trên mạch của phân tử collagen tồn tại các gốc carboxyl và amino [21]. Trong môi trường acid, ion H+ tác dụng với nhóm amino tạo thành ion –NH3+.