Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Progesteron (PGT) là một hormon steroid tự nhiên được tiết ra chủ yếu từ hoàng thể ở nửa sau chu kỳ kinh nguyệt, giữ vai trò quan trọng trong việc tăng sinh nội mạc tử cung, giãn cơ trơn tử cung và duy trì thai kỳ. Trên lâm sàng, PGT được chỉ định phổ biến trong hỗ trợ sinh sản (ART) cho phụ nữ vô sinh do thiếu hụt hormon, suy buồng trứng, dọa sảy thai, điều trị rối loạn kinh nguyệt và liệu pháp hormon thay thế. Mặc dù có nhiều chế phẩm trên thị trường với các đường dùng khác nhau (viên nang uống Utrogestan, gel đặt âm đạo Crinone, dung dịch tiêm bắp Gestone, gel bôi qua da Progestogel 1%), việc sử dụng PGT qua đường uống gặp trở ngại lớn khi sinh khả dụng chỉ đạt khoảng 2,4% do bị chuyển hóa bước một rất mạnh tại gan, kết hợp với đặc tính độ tan rất thấp trong nước (7,00 – 8,81 mg/l) và hệ số phân bố dầu-nước cao (log P = 3,87).

Đường dùng qua da được xem là giải pháp tiềm năng nhằm tránh vòng tuần hoàn đầu qua gan và duy trì nồng độ thuốc ổn định. Tuy nhiên, PGT có khối lượng phân tử tương đối lớn (314,5 g/mol), tính thấm qua lớp sừng kém và dễ bị chuyển hóa một phần ngay tại da bởi enzyme 5α-reductase thành 5α-dihydro progesteron. Nghiên cứu trước đây của Dược sĩ Nguyễn Thị Ngân đã ứng dụng hệ eutecti giữa PGT và menthol nhằm tăng tính thấm in vitro; tuy nhiên, khi đưa hệ eutecti này vào nền hydrogel Carbopol 1% thân nước, sinh khả dụng in vivo trên động vật thí nghiệm vẫn rất thấp do nền gel kém tương thích với hỗn hợp eutecti thân dầu và không hỗ trợ khuếch tán qua hàng rào lipid của da. Để khắc phục hạn chế này, hệ organogel—cụ thể là organogel cấu trúc từ lecithin—được đề xuất làm chất mang mới nhờ cấu trúc lưỡng pha (chứa cả pha dầu và pha nước), khả năng tương hợp sinh học cao với da và độ hòa hợp tốt với hệ eutecti.

Đề tài "Nghiên cứu bào chế và đánh giá organogel chứa eutecti progesteron dùng qua da" được thực hiện nhằm giải quyết hai mục tiêu cụ thể:

  1. Nghiên cứu bào chế organogel chứa eutecti progesteron dùng qua da.
  2. Sơ bộ đánh giá sinh khả dụng của organogel chứa eutecti progesteron bào chế được và so sánh với chế phẩm đối chiếu dùng đường uống trên thị trường.

Đối tượng nghiên cứu là hệ eutecti PGT - menthol kết hợp với hệ nền organogel tạo từ lecithin, tá dược A (pha dầu) và tá dược B (pha nước). Động vật thí nghiệm bao gồm da lưng chuột nhắt trắng (dùng cho thử nghiệm giải phóng in vitro) và thỏ trắng đực trưởng thành khỏe mạnh (dùng cho thử nghiệm sinh khả dụng in vivo). Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Bào chế và Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội vào năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài tập trung vào hai cơ chế chính: sự tạo hệ eutecti để cải thiện độ tan/tính thấm và cấu trúc của hệ organogel cốt lỏng:

  • Cơ sở hệ Eutecti: Hỗn hợp eutecti giữa hai hoạt chất ở tỷ lệ xác định làm cản trở quá trình kết tinh của nhau, tạo ra hệ có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của từng chất đơn lẻ mà không sinh ra hợp chất hóa học mới. Theo phương trình Kasting, thông lượng khuếch tán ($J_m$) qua màng sinh học tỷ lệ nghịch với nhiệt độ nóng chảy ($T_m$) của chất thông qua thông số độ tan lý tưởng trong lipid của da ($S_{\text{lý tưởng}}$). Việc hạ điểm nóng chảy của PGT kết hợp giảm kích thước tiểu phân và tạo trạng thái kết tinh kém bền (metastable) giúp tăng đáng kể tốc độ hòa tan và khuếch tán của dược chất qua lớp sừng.
  • Cơ sở Organogel: Gel thân dầu (organogel) hình thành từ chất diện hoạt tự nhiên lecithin khi có mặt dung môi không phân cực và pha phân cực (nước). Cấu trúc organogel cốt lỏng (fluid-matrix) hình thành nhờ các micell nghịch đảo phát triển thành dạng sợi/chuỗi đan xen, giam giữ dung môi hữu cơ tạo thành mạng lưới ba chiều có đặc tính nhớt - đàn hồi. Tá dược B (poloxamer/chất diện hoạt thân nước) đóng vai trò chất đồng diện hoạt và chất ổn định mạng lưới.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp bào chế: Hệ eutecti PGT - menthol (tỷ lệ 15:85) được điều chế bằng phương pháp đun chảy cách thủy ở 65°C, làm lạnh và bảo quản ở -20°C ít nhất 1 tuần. Hệ nền organogel trắng được bào chế bằng cách phối hợp pha nước (chứa tá dược B 20%) vào pha dầu (lecithin và tá dược A tỷ lệ 1:1) dưới lực khuấy từ 100 vòng/phút, sau đó phối hợp đồng nhất với hệ eutecti.
  • Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa: Sử dụng phần mềm MODDE 12.0 với mô hình mặt tại tâm hỗn hợp trung tâm (Central Composite Face - CCF) gồm 11 công thức để khảo sát hai biến đầu vào: tỷ lệ PGT ($X_1$: 1 – 10%) và tỷ lệ pha nước trong hệ nền ($X_2$: 70 – 80%). Hai biến đầu ra được theo dõi là thông lượng khuếch tán qua màng da chuột ($Y_1$ - Flux) và thời gian trễ ($Y_2$ - $T_{\text{lag}}$).
  • Phương pháp phân tích và đánh giá:
    • In vitro: Đo kích thước tiểu phân và chỉ số đa phân tán (PDI) của organogel trắng bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) trên máy Zetasizer NanoZS90. Đánh giá khả năng giải phóng qua da lưng chuột nhắt trắng bằng bình khuếch tán Franz (Hanson Research, $V = 7$ ml, $S = 1,767$ cm$^2$, môi trường cồn-nước 50:50 ở 32°C). Định lượng PGT bằng hệ thống HPLC Shimadzu, cột Agilent C18 ($250 \times 4,6$ mm, 5 µm), pha động methanol:nước (80:20), bước sóng UV 254 nm.
    • In vivo: Đánh giá sinh khả dụng trên 9 thỏ trắng đực (khối lượng ~2 kg) chia làm 2 nhóm: nhóm bôi organogel tối ưu trên da lưng ($n = 4$, liều 10 mg/kg) và nhóm uống dịch nhân viên nang Utrogestan 100mg qua sonde ($n = 5$, liều 10 mg/kg). Mẫu huyết tương được xử lý bằng kỹ thuật chiết QuEChERS (sử dụng dung môi acetonitril, muối $\text{MgSO}_4$, $\text{NaCl}$ và chất nội chuẩn đồng vị PGT-d9). Định lượng PGT trong huyết tương bằng hệ thống LC-MS/MS Agilent 6460 QQQ với cột Agilent Eclipse XD8-C18 ($3,0 \times 150$ mm, 3,5 µm).
    • Xử lý dược động học: Phân tích phi ngăn (NCA) bằng phần mềm Phoenix 8 để tính các thông số $C_{\text{max}}$, $T_{\text{max}}$, $\text{AUC}_{0-\infty}$, MRT và $\lambda_z$.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các kiến thức lý thuyết và thực tiễn liên quan đến bốn nội dung trọng tâm:

  • Dược chất Progesteron: Trình bày cấu trúc hóa học ($C_{21}H_{30}O_2$, phân tử lượng 314,5 g/mol, nhiệt độ nóng chảy 121°C), tác dụng sinh lý, chỉ định và danh mục các chế phẩm thương mại (Crinone 8%, Utrogestan 100mg/200mg, Gestone 100mg/2ml, Progestogel 1%). Điểm lại các nghiên cứu tăng thấm qua da gần đây như dùng vi nhũ tương chứa tributyrin và silicon dioxid, dung dịch propylen glycol kết hợp mono-diglycerid trung bình (MCG), hoặc gắn liposome màng carrageenan.
  • Hệ Eutecti: Phân tích bản chất vật lý của điểm eutecti (nhiệt độ nóng chảy thấp nhất, tiểu phân kết tinh mịn đồng đều) và cơ chế tăng tính thấm qua da dựa trên phương trình Kasting, định luật Fick, hiện tượng vi hạt và dạng thù hình kém ổn định.
  • Hệ Organogel: Phân loại theo khối lượng phân tử chất tạo gel (LMWO và polyme), phân biệt cơ chế hình thành organogel cốt rắn và cốt lỏng. Phân tích sâu về organogel lecithin (LO) và pluronic lecithin organogel (PLO), đồng thời dẫn chứng các nghiên cứu đưa aceclofenac, piroxicam, silymarin và diltiazem vào PLO nhằm tăng cường hấp thu qua da.
  • Sinh khả dụng và dược động học: Định nghĩa các thông số đặc trưng ($T_{\text{max}}$, $C_{\text{max}}$, $\text{AUC}$, MRT) và so sánh ưu nhược điểm của các mô hình động vật thí nghiệm (chuột, thỏ, lợn) trong đánh giá thuốc bôi qua da.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm, trang thiết bị và các tiêu chuẩn thẩm định:

  • Nêu rõ nguồn gốc nguyên liệu đạt chuẩn (PGT đạt USP 41 từ Hubei Gedian Humanwell, menthol, lecithin, tá dược A, tá dược B và chất nội chuẩn PGT-d9) cùng hệ thống máy móc (HPLC Shimadzu, LC-MS/MS Agilent 6460 QQQ, Zetasizer NanoZS90, hệ khuếch tán Hanson).
  • Quy trình phối hợp tạo hệ eutecti (tỷ lệ PGT:menthol = 15:85 ở 65°C) và organogel trắng (pha nước chứa tá dược B 20% trộn vào pha dầu chứa lecithin và tá dược A).
  • Thẩm tra phương pháp phân tích: HPLC định lượng PGT in vitro đạt độ tuyến tính trong khoảng 6 – 150 µg/ml ($R^2 = 0,9999$), độ lặp lại diện tích pic có RSD = 1,94% (< 2%). Phương pháp LC-MS/MS định lượng PGT trong huyết tương thỏ đạt độ tuyến tính từ 2 đến 2000 ng/ml ($R^2 = 0,9997$), độ thu hồi trung bình đạt 98,9% với RSD = 2,09% (đáp ứng tiêu chuẩn AOAC).
  • Thiết lập quy trình khuếch tán Franz qua da chuột và quy trình lấy mẫu máu thỏ tại các mốc thời gian cụ thể (lên tới 32 giờ đối với đường bôi và 360 phút đối với đường uống) kèm kỹ thuật chiết QuEChERS.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm từ khâu thăm dò đến tối ưu hóa và thử nghiệm in vivo:

  • Nghiên cứu organogel trắng: Đánh giá 7 mẫu có tỷ lệ pha nước/pha dầu từ 2/8 đến 8/2. Kích thước tiểu phân tăng dần từ 420,2 nm lên 3308 nm. Kích thước hạt tăng vọt tại vùng chuyển pha giữa tỷ lệ 5/5 (777,1 nm) và 6/4 (1290 nm), giao điểm hai đường tuyến tính cắt nhau tại tỷ lệ nước/dầu khoảng 5,5/4,5. Hiện tượng này minh chứng cho sự phát triển của các micell đảo hình cầu thành chuỗi hình trụ đan xen giữ dung môi, làm tăng độ đặc và thể chất bán rắn của gel. Do đó, dải tỷ lệ nước/dầu từ 5/5 đến 8/2 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát.
  • Sàng lọc tỷ lệ thành phần: Khảo sát giới hạn nồng độ PGT (1 – 10%) và tỷ lệ pha nước (70 – 80%). Khi tỷ lệ pha nước dưới 70%, gel sau khi thêm eutecti có thể chất lỏng hoặc sệt; khi tỷ lệ pha nước đạt 80% kết hợp 10% PGT, lượng chất rắn quá lớn (chiếm 66,67% tổng lượng mẫu) khiến gel khó đồng nhất.
Công thức Tỉ lệ PGT (%) Tỉ lệ pha nước (%) Thông lượng khuếch tán – Flux (µg/cm$^2$.giờ) Thời gian trễ – $T_{\text{lag}}$ (giờ)
N1 1,0 70 70,31 6,65
N2 10,0 70 251,16 4,94
N3 1,0 80 39,72 7,49
N4 10,0 80 94,85 2,11
N5 1,0 75 80,15 7,40
N6 10,0 75 272,08 4,74
N7 5,5 70 222,20 5,79
N8 5,5 80 243,78 6,99
N9 5,5 75 229,44 5,72
N10 5,5 75 280,34 4,78
N11 5,5 75 273,16 6,25
  • Phân tích mô hình tối ưu hóa: Xử lý 11 công thức bằng phần mềm MODDE 12.0 cho thấy biến tỷ lệ PGT ($X_1$) có ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê ($p < 0,05$) đến cả hai biến đầu ra: làm tăng thông lượng khuếch tán (hệ số hồi quy $+0,756$) và làm giảm thời gian trễ (hệ số hồi quy $-1,045$). Tỷ lệ pha nước ($X_2$) không ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến hai biến đầu ra. Mô hình dự đoán thông lượng khuếch tán có $R^2 = 0,905$ và $Q^2 = 0,170$.
  • Đánh giá sinh khả dụng in vivo: Công thức tối ưu được dự đoán và bào chế có tỷ lệ PGT 7,38% và tỷ lệ pha nước trong nền 72,87%. Thử nghiệm trên mô hình thỏ cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai đường dùng:
Thông số dược động học Hệ eutecti – organogel qua da Chế phẩm viên uống đối chiếu
Liều dùng 10 mg/kg 10 mg/kg
$T_{\text{max}}$ $4,00 \pm 0,61$ giờ $9,00 \pm 2,45$ phút
$C_{\text{max}}$ (ng/ml) $72,54 \pm 14,79$ $407,74 \pm 322,15$
$\text{AUC}_{0-\infty}$ (ng.giờ/ml) $708,54 \pm 120,20$ $291,01 \pm 224,41$
MRT (giờ) $9,93 \pm 0,37$ $1,66 \pm 0,68$
$\lambda_z$ (giờ$^{-1}$) $0,0794 \pm 0,00289$ $0,395 \pm 0,206$

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công công thức organogel chứa eutecti PGT dùng qua da với thành phần tối ưu xác định:

Thành phần Vai trò trong công thức Tỉ lệ khối lượng (%)
Progesteron Dược chất (trong hệ eutecti) 7,38
Menthol Chất tạo eutecti 41,81
Lecithin Tá dược tạo gel thân dầu (pha dầu) 6,89
Tá dược A Dung môi không phân cực (pha dầu) 6,89
Tá dược B Polyme đồng diện hoạt (pha nước, dung dịch 20%) 7,41
Nước Dung môi phân cực (pha nước) 29,62

Các kết quả định lượng cụ thể đạt được:

  • Công thức tối ưu đạt thông lượng khuếch tán qua màng da chuột in vitro là 289,00 µg/cm$^2$.giờ và thời gian trễ $T_{\text{lag}} = 5,39$ giờ.
  • Trên mô hình thỏ thực nghiệm, hệ eutecti – organogel dùng qua da cho diện tích dưới đường cong $\text{AUC}_{0-\infty}$ đạt $708,54 \pm 120,20$ ng.giờ/ml, cao gấp 2,43 lần (tương ứng 243,48%) so với viên nang uống Utrogestan ($291,01 \pm 224,41$ ng.giờ/ml).
  • Dạng dùng qua da kéo dài thời gian lưu giữ trung bình trong tuần hoàn (MRT đạt $9,93 \pm 0,37$ giờ so với $1,66 \pm 0,68$ giờ của đường uống), nồng độ đỉnh $C_{\text{max}}$ thấp hơn khoảng 5,6 lần ($72,54$ ng/ml so với $407,74$ ng/ml), giúp duy trì nồng độ thuốc ổn định trong huyết tương và hạn chế dao động nồng độ đỉnh có thể gây tác dụng không mong muốn.

Về mặt đóng góp khoa học, nghiên cứu đã giải quyết được hạn chế lớn của đề tài trước đó (sử dụng nền Carbopol 1% thân nước cho sinh khả dụng in vivo kém). Việc thay thế bằng organogel từ lecithin tạo ra môi trường tương thích lưỡng pha, giúp hòa tan và cố định hệ eutecti PGT - menthol, đồng thời tương hợp tốt với lipid của lớp sừng để giải phóng dược chất kéo dài vào hệ tuần hoàn.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự chỉ ra một số hạn chế trong quá trình thực hiện:

  • Độ lặp lại của thông số in vitro: Biến đầu ra thời gian trễ ($T_{\text{lag}}$) trong mô hình tối ưu hóa có hệ số dự đoán $Q^2 < 0,1$ ($Q^2 = -0,340$). Nguyên nhân xuất phát từ độ lặp lại chưa cao tại các điểm tâm thí nghiệm do sự khác biệt sinh học tự nhiên giữa các mẫu da chuột (tuổi, trọng lượng, kỹ thuật lấy da và cạo lông tạo sai số giữa các lần đo).
  • Phạm vi khảo sát cấu trúc gel: Đề tài mới dừng lại ở việc quan sát cảm quan và đo kích thước giọt bằng DLS, chưa đi sâu phân tích đặc tính lưu biến học (rheology), độ nhớt động học cũng như cấu trúc siêu vi của mạng lưới micell đảo.
  • Quy mô thử nghiệm in vivo: Thử nghiệm sinh khả dụng mới dừng ở mức sơ bộ trên động vật thí nghiệm (mô hình thỏ với cỡ mẫu $n = 4$ và $n = 5$), chưa thực hiện trên người tình nguyện khỏe mạnh.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả kiến nghị:

  • Tiếp tục hoàn thiện công thức bào chế hệ eutecti – organogel.
  • Đi sâu nghiên cứu, đánh giá các đặc tính hóa lý chuyên sâu của hệ như cấu trúc vi mô và đặc tính lưu biến học.

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn cao cho các nhóm đối tượng sau:

  • Sinh viên và học viên ngành Bào chế và Công nghệ Dược phẩm: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình ứng dụng hệ eutecti trong bào chế dạng thuốc dùng qua da nhằm tăng độ tan và tính thấm cho các hoạt chất thuộc nhóm steroid thực tế tan kém trong nước.
  • Nghiên cứu viên về hệ phân phối thuốc qua da (TDDS): Tham khảo phương pháp xây dựng hệ nền organogel từ phospholipid tự nhiên (lecithin), kỹ thuật tối ưu hóa công thức đa biến bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (CCF) thông qua phần mềm MODDE.
  • Cán bộ phân tích và kiểm nghiệm sinh học: Cung cấp quy trình chiết mẫu sinh học bằng kỹ thuật QuEChERS cải tiến kết hợp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) sử dụng nội chuẩn đồng vị PGT-d9 để định lượng hoạt chất steroid trong huyết tương động vật.

Câu hỏi thường gặp

1. Tỷ lệ thành phần trong hệ eutecti giữa progesteron và menthol được lựa chọn là bao nhiêu và được bào chế như thế nào?
Tỷ lệ PGT : menthol được lựa chọn là 15 : 85 (khối lượng/khối lượng). Hỗn hợp được bào chế bằng cách cân chính xác hai chất vào ống nghiệm thủy tinh đậy kín, đun chảy cách thủy ở 65°C cho đến khi hỗn hợp chảy lỏng hoàn toàn, trộn đều, làm mát về nhiệt độ phòng, để ổn định 12 giờ và bảo quản ở -20°C ít nhất 1 tuần trước khi phối hợp vào gel.

2. Điểm chuyển pha tạo cấu trúc organogel cốt lỏng của hệ nền trắng xuất hiện ở tỷ lệ nước/dầu nào?
Khi khảo sát tỷ lệ pha nước/pha dầu từ 2/8 đến 8/2, kích thước tiểu phân tăng vọt khi chuyển từ tỷ lệ 5/5 (777,1 nm) sang 6/4 (1290 nm). Hai đường tuyến tính biểu diễn kích thước tiểu phân cắt nhau tại tỷ lệ nước/dầu khoảng 5,5/4,5. Đây là điểm chuyển biến cấu trúc từ các micell đảo hình cầu sang micell hình trụ dạng sợi liên kết mạng lưới ba chiều cố định dung môi.

3. Yếu tố đầu vào nào có ảnh hưởng quyết định đến thông lượng khuếch tán và thời gian trễ trong mô hình MODDE?
Biến tỷ lệ PGT ($X_1$) có ảnh hưởng mang ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% ($p < 0,05$) đến cả hai biến đầu ra: tăng nồng độ PGT làm tăng thông lượng khuếch tán (hệ số hồi quy $+0,756$) và làm giảm thời gian trễ (hệ số hồi quy $-1,045$). Trong khi đó, biến tỷ lệ pha nước trong hệ nền ($X_2$) không ảnh hưởng có ý nghĩa thống kê đến khả năng giải phóng dược chất.

4. Sinh khả dụng của hệ organogel bôi qua da so với viên nang Utrogestan đường uống trên mô hình thỏ khác nhau như thế nào?
Hệ eutecti – organogel qua da có mức độ hấp thu $\text{AUC}{0-\infty}$ đạt $708,54 \pm 120,20$ ng.giờ/ml, cao gấp 2,43 lần so với viên uống Utrogestan ($291,01 \pm 224,41$ ng.giờ/ml). Đồng thời, dạng gel bôi đạt đỉnh nồng độ chậm hơn nhiều ($T{\text{max}} = 4,00$ giờ so với 9,00 phút của đường uống), nồng độ đỉnh thấp hơn ($C_{\text{max}} = 72,54$ ng/ml so với $407,74$ ng/ml) và thời gian lưu giữ thuốc trong cơ thể kéo dài hơn (MRT đạt $9,93$ giờ so với $1,66$ giờ).

Kết luận

Khóa luận đã xây dựng thành công công thức organogel tối ưu chứa eutecti progesteron – menthol (7,38% PGT, 41,81% menthol, 6,89% lecithin, 6,89% tá dược A, 7,41% tá dược B và 29,62% nước) đạt thông lượng giải phóng in vitro qua da chuột là 289,00 µg/cm$^2$.giờ. Thử nghiệm in vivo trên thỏ chứng minh dạng gel bôi qua da giúp tăng sinh khả dụng lên 2,43 lần so với viên nang uống Utrogestan trên thị trường nhờ khắc phục hiện tượng chuyển hóa bước một qua gan. Dạng bào chế này giúp duy trì nồng độ hormon ổn định kéo dài trong tuần hoàn, mở ra tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh lý cần bổ sung progesteron an toàn và tiện dụng.