Tổng quan luận án

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển các vùng chuyên canh trồng hành ta (Allium ascalonicum L., họ Hành Liliaceae). Hành ta là loại cây gia vị và thực phẩm truyền thống, đồng thời được dùng trong y học dân gian để trị các bệnh tim mạch, đau đầu, hen suyễn, giun sán và côn trùng cắn. Các công trình khoa học hiện đại đã chứng minh hành ta có các tác dụng sinh học như hạ lipid máu, hạ glucose máu, ức chế tế bào ung thư, kháng khuẩn và tăng cường miễn dịch. Trong những năm gần đây, xu hướng lên men dược liệu chi Allium (như tỏi, hành) đã được nghiên cứu nhằm chuyển hóa các phân tử cao phân tử thành hợp chất có khối lượng phân tử thấp hơn, tăng khả năng hấp thu, gia tăng hàm lượng hoạt chất, cải thiện mùi vị cay hăng và nâng cao hoạt tính sinh học.

Tuy nhiên, tác giả luận án chỉ ra rằng các nghiên cứu về lên men hành đen từ hành ta vẫn còn ít và chưa toàn diện: chưa tối ưu hóa đầy đủ các thông số công nghệ lên men (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian, cơ chất xúc tác); chưa đánh giá sâu sắc sự biến đổi thành phần hóa học; chưa xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất và bào chế dạng cao khô bằng các kỹ thuật sấy thích hợp nhằm khắc phục nhược điểm chảy dính, tăng độ ổn định của sản phẩm; đồng thời thiếu các dữ liệu thực nghiệm toàn diện về độc tính và tác dụng dược lý của dạng cao khô. Từ thực tiễn đó, đề tài "Nghiên cứu bào chế, đánh giá độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen" thuộc chuyên ngành Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc (mã số: 9720202) được thực hiện tại Học viện Quân y (2023).

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung:

  1. Xây dựng được quy trình lên men tạo hành đen từ hành ta (Allium ascalonicum L.) quy mô phòng thí nghiệm.
  2. Xây dựng được quy trình bào chế, tiêu chuẩn cơ sở và bước đầu đánh giá độ ổn định của cao khô hành đen.
  3. Đánh giá được độc tính và một số tác dụng sinh học của cao khô hành đen trên thực nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Thân hành (củ hành) hành ta (Allium ascalonicum L.) thu mua vào vụ thu hoạch tháng 7/2017 tại huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi; mẫu được TS. Đỗ Thị Xuyến giám định tên khoa học và tiêu bản lưu tại Phòng Thí nghiệm 228, Bộ môn Khoa học Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN; chuột nhắt trắng chủng Swiss (20 - 25 g); thỏ trắng New Zealand White (2,0 - 2,5 kg) do Ban cung cấp động vật thí nghiệm - Học viện Quân y cung cấp; các dòng tế bào ung thư người (A549, HepG2, HeLa, MCF-7, OVCAR-8) và các chủng vi sinh vật kiểm định.
  • Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng và sản xuất thuốc, Viện Đào tạo Dược, Bộ môn Sinh lý bệnh thuộc Học viện Quân y; phối hợp với Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng thuộc Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và Viện Y học cổ truyền Quân đội.
  • Phạm vi thời gian: Mẫu nguyên liệu thu thập từ tháng 7/2017 và toàn bộ nghiên cứu thực nghiệm được hoàn thành bảo vệ năm 2023.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về thành phần hóa học, phương pháp phân tích, công nghệ lên men và tác dụng sinh học của các dược liệu chi Allium:

  • Thành phần hóa học của hành ta: Tác giả Fattorusso E. và cộng sự đã phân lập từ hành ta các dẫn chất flavonoid gồm quercetin, quercetin-4'-glucosid (spiraeosid), quercetin-7-glucosid, quercetin-3,4'-diglucosid, isorhamnetin, isorhamnetin-3,4'-diglucosid, cùng các saponin furostanol mới như ascalonicosid A1/A2, ascalonicosid B, ascalonicosid C, ascalonicosid D, dichotomin và parisaponin. Các công trình phân tích bằng HPLC-DAD-ESI-MS-MS xác định quercetin 3,4'-diglucosid (516 - 605 mg/kg) và quercetin 4'-glucosid (392 - 509 mg/kg) chiếm hàm lượng cao nhất trong các flavonol glucosid của hành ta. Về hợp chất lưu huỳnh, Wu J. và cộng sự dùng sắc ký khí xác định tinh dầu hành ta chứa khoảng 0,03% hợp chất lưu huỳnh hữu cơ, trong đó dimethyl trisulfid (18,81%) và methyl propyl trisulfid (19,93%) là hai cấu tử chính.
  • Hợp chất cycloalliin (CYC): CYC có công thức phân tử C6H11NO3S, khối lượng mol 177,22 đvC, tên IUPAC là (1S, 3R, 5S)-5-methyl-1,4-thiazan-3-carboxylic acid 1-oxyd. CYC tan tốt trong nước (52,3 g/l), hấp thụ cực đại ở bước sóng 210 nm, có tính bền vững cao trong môi trường acid HCl 0,1M, base NaOH 0,1M ở 70°C trong 3 giờ (thu hồi > 98%), không bị phân hủy bởi enzym alliinase và giữ tỷ lệ nguyên vẹn trên 96 - 97% trong dịch sinh học. Kodera Y. và cộng sự cùng Lee H. (2016) đã mô tả con đường sinh tổng hợp trans-S-1-propenyl-L-cystein sulfoxyd (isoalliin) từ γ-glutamyl-S-1-propenyl-L-cystein (GS1PC) và cơ chế chuyển hóa nhiệt nội sinh biến đổi isoalliin thành CYC. Ichikawa M. và cộng sự (2006) đã thiết lập phương pháp HPLC pha động acetonitril/nước chứa 0,2% acid phosphoric trên cột Shodex Asahipak NH2P-50 2D để định lượng CYC.
  • Công nghệ lên men dược liệu: Trịnh Nam Trung và cộng sự (2017) đã xác định các thông số lên men tỏi Lý Sơn ở nhiệt độ 75°C, độ ẩm 80% trong 35 ngày thu được hàm lượng S-allyl-L-cystein (SAC) đạt 264,48 ± 11,09 µg/g. Choi I.S. và cộng sự (2014) khảo sát nhiệt độ 65 - 80°C trên tỏi cho thấy mốc nhiệt 70°C sau 32 ngày đạt hàm lượng polyphenol (52,091 mg GAE/g) và đường khử (15,706 mg GE/g) tối ưu. Đối với hành đen lên men từ hành ta, Tran Gia Buu (2020) công bố dịch chiết hành đen có khả năng ức chế NO (32,57 ± 0,64%) và ức chế tế bào ung thư HeLa (18,58 ± 0,45%), HepG2 (19,94 ± 0,58%) vượt trội so với hành tươi.
  • Tác dụng dược lý thực nghiệm: Các tác giả Adeniyi B. (2004), Lawal T. (2014), Mansour A. (2009) đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết hành ta đối với H. pylori (MIC 6,25 - 12,5 mg/ml) và M. tuberculosis (MIC 50 mg/ml). Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của hành ta trên các dòng Jurkat, K562, Wehi 164 được Motlagh H. ghi nhận với IC50 trên dòng bình thường HUVEC > 1000 µg/ml. Tác dụng hạ đường huyết trên chuột Wistar đái tháo đường do alloxan và ức chế phù qua tính thấm thành mạch (80,1% ở liều 200 mg/kg theo Whittle) cũng được ghi nhận.

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Chưa có công trình nào tích hợp hoàn chỉnh từ việc chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào hành ta Lý Sơn, ứng dụng enzym ngoại bào protease để rút ngắn chu kỳ lên men tạo hành đen, dùng chất đánh dấu CYC để kiểm soát chất lượng bằng HPLC, ứng dụng phương pháp phun sấy với hệ tá dược phù hợp để tạo bột cao khô không chảy dính, cho đến việc thẩm định độ ổn định và cung cấp hệ thống chứng cứ thực nghiệm về an toàn (độc tính cấp, bán trường diễn) và hiệu lực sinh học (chống khối u, kháng vi sinh vật, hạ lipid máu và hạ glucose máu).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án dựa trên nguyên lý chuyển hóa sinh học trạng thái rắn dưới tác động có kiểm soát của các yếu tố vật lý (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) và sinh học (enzym ngoại bào protease, amylase, cellulase, pectinase). Quá trình này cắt mạch các phân tử hữu cơ lớn, gia tăng đường khử, giải phóng acid amin tự do và chuyển hóa các hợp chất tiền chất chứa lưu huỳnh mạch thẳng thành hợp chất dị vòng bền vững cycloalliin (CYC). Về mặt công nghệ bào chế, luận án ứng dụng lý thuyết chuyển pha lỏng - rắn bằng phương pháp phun sấy (spray drying), sử dụng khí nóng làm bay hơi dung môi trong thời gian vài giây để bảo vệ hoạt chất mẫn cảm nhiệt và tạo hạt bột có độ ẩm dưới 5%. Về mặt dược lý, luận án áp dụng cơ chế gây rối loạn lipid máu ngoại sinh bằng chế độ ăn giàu mỡ kết hợp cholesterol, cơ chế gây đái tháo đường typ 2 bằng thức ăn giàu chất béo kết hợp tiêm streptozotocin (STZ) liều thấp phá hủy một phần tế bào beta đảo tụy, và cơ chế đánh giá độc tính tế bào thông qua sự khử muối tetrazolium ở ty thể (phương pháp MTT).

Hệ thống phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

  • Phương pháp phân tích và kiểm nghiệm: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng cycloalliin bằng HPLC sử dụng detector UV ở bước sóng 210 nm, cột pha đảo/pha thường chuyên dụng cho amino acid/sulfoxyd, đánh giá tính tương thích hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng (tỷ lệ thu hồi). Định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp Folin-Ciocalteu, định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp tạo phức màu với nhôm clorid, định lượng đường khử theo phương pháp Bertrand/DNS, định lượng acid amin tổng số bằng phản ứng ninhydrin. Kiểm nghiệm độ ẩm bằng phương pháp sấy khô hoặc cất dung môi, xác định tro toàn phần theo Dược điển Việt Nam V.
  • Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc: Chiết phân đoạn, sắc ký cột cổ điển và hiện đại, phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân bao gồm phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon-13 (13C-NMR) và phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (HMBC) để xác định cấu trúc các hợp chất tinh khiết phân lập được từ hành đen.
  • Phương pháp tối ưu hóa công nghệ lên men và bào chế: Phương pháp thực nghiệm khảo sát đơn yếu tố và tối ưu hóa điều kiện lên men (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian ngâm ủ enzym protease). Phương pháp khảo sát điều kiện chiết xuất dịch chiết hành đen (dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu DM/DL, số lần chiết, thời gian và nhiệt độ chiết). Phương pháp tối ưu hóa quá trình phun sấy: sàng lọc tá dược bao gồm Maltodextrin (Mal), Aerosil (AE), Polyvinyl pyrrolidon K30 (PVP K30), Hydroxypropyl methylcellulose E6 (HPMC E6); khảo sát tỷ lệ tá dược/chất rắn (TD/CR), tỷ lệ chất rắn/dịch phun (CR/DP), nhiệt độ dòng khí vào/ra và tốc độ cấp dịch; đánh giá thông qua hiệu suất phun sấy (HSPS), chỉ số nén Carr (CI) và khối lượng riêng biểu kiến (KLRbk).
  • Đánh giá độ ổn định: Thử nghiệm độ ổn định ở điều kiện dài hạn (nhiệt độ 30 ± 2°C, độ ẩm 75 ± 5%) và điều kiện lão hóa cấp tốc (nhiệt độ 40 ± 2°C, độ ẩm 75 ± 5%) theo hướng dẫn của ASEAN và WHO, theo dõi hàm lượng CYC còn lại theo thời gian.
  • Phương pháp đánh giá độc tính: Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng Swiss theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon hoặc quan sát tỷ lệ sống/chết ở liều tối đa uống được trong 72 giờ; Độc tính bán trường diễn trên thỏ New Zealand White dùng chế phẩm liên tục trong 4 tuần, đánh giá tình trạng chung, biến thiên khối lượng cơ thể, các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, nồng độ huyết sắc tố) và sinh hóa chức năng gan - thận (hoạt độ AST, ALT, nồng độ creatinin, ure), kết hợp kiểm tra vi thể mô bệnh học gan, thận, lách.
  • Phương pháp đánh giá tác dụng sinh học: Thử nghiệm độc tế bào in vitro trên 4 dòng tế bào ung thư bằng phương pháp MTT, xác định tỷ lệ ức chế và giá trị IC50; Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và đo độ đục pha loãng xác định MIC theo Hadacek F.; Đánh giá khả năng ức chế enzym alpha-glucosidase in vitro; Đánh giá tác dụng hạ lipid máu in vivo trên mô hình chuột nhắt gây tăng lipid máu ngoại sinh, định lượng các chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-C, HDL-C sau 21 ngày điều trị; Đánh giá tác dụng hạ glucose máu in vivo trên chuột thực nghiệm đái tháo đường typ 2 gây bởi chế độ ăn giàu chất béo kết hợp tiêm STZ.
  • Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được tính toán giá trị trung bình (Mean), độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD); so sánh thống kê giữa các lô thử nghiệm và lô chứng bằng phần mềm thống kê y sinh học (Student's t-test hoặc ANOVA).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở lý luận và thực tiễn về hành ta (Allium ascalonicum L.), quá trình lên men thực vật họ Hành, các giai đoạn công nghệ bào chế cao khô và các mô hình sinh học phục vụ đánh giá tác dụng. Tác giả đã tổng hợp danh mục 14 hợp chất flavonoid và 7 hợp chất saponin phân lập từ hành ta. Bảng số liệu của Wu J. về các thành phần bay hơi trong tinh dầu hành ta được điểm lại chi tiết:

Hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong tinh dầu hành ta Hàm lượng (%) so với tổng chất chiết
Dimethyl disulfid 1,99
Propyl propenyl sulfid 0,28
Methyl propyl disulfid 3,59
Methyl cis-propenyl disulfid 2,91
Methyl trans-propenyl disulfid 5,09
Dimethyl trisulfid 18,81
Dipropyl disulfid 4,16
Propyl cis-propenyl disulfid 2,79
Propyl trans-propenyl disulfid 4,43
Methyl propyl trisulfid 19,93
Methyl propenyl trisulfid 4,85
Dipropyl trisulfid 5,55
1-methylthiopropyl ethyl disulfid 6,41
Propyl cis-propenyl trisulfid 4,50
Propyl trans-propenyl trisulfid 5,47

Chương 1 cũng phân tích quá trình chuyển hóa trans-S1PCSO (isoalliin) thành cycloalliin (CYC) dưới tác dụng nhiệt, khẳng định CYC là hoạt chất đặc trưng, không bị phân hủy bởi enzym alliinase, thích hợp làm chất đánh dấu để tiêu chuẩn hóa hành đen. Đồng thời, tác giả tổng thuật các kỹ thuật chiết xuất hiện đại (siêu âm, vi sóng, chất lỏng siêu tới hạn), các phương pháp loại tạp (nhiệt, dung môi ethanol, điều chỉnh pH) và cơ chế làm khô bằng hệ thống phun sấy. Các mô hình in vivo (gây tăng lipid ngoại sinh/nội sinh bằng tween 80, triton WR-1339, poloxamer 407; gây đái tháo đường bằng STZ kết hợp mỡ cao) và in vitro (MTT, khuếch tán đĩa thạch, ức chế alpha-glucosidase) được phân tích để làm căn cứ thiết kế nghiên cứu.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Nội dung chương trình bày xuất xứ nguyên liệu hành ta thu hái tại Lý Sơn (Quảng Ngãi) tháng 7/2017 với tiêu chuẩn củ to, chắc, vỏ màu tím, không mọc mầm; tiêu bản thực vật được giám định định danh khoa học là Allium ascalonicum L. Động vật thí nghiệm gồm chuột nhắt trắng Swiss (20 - 25 g) và thỏ New Zealand White (2,0 - 2,5 kg) đạt tiêu chuẩn khỏe mạnh. Các dòng tế bào ung thư (A549, HepG2...) và chủng vi sinh vật được chuẩn bị tại các phòng thí nghiệm chuyên sâu.

Quy trình nghiên cứu được thiết kế theo 3 nhánh chính:

  1. Nhánh 1: Thẩm định quy trình định lượng CYC bằng HPLC (khảo sát tính tương thích, độ lặp lại, độ đúng qua diện tích pic); xây dựng tiêu chuẩn cơ sở hành ta; nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ, độ ẩm và enzym protease (nồng độ 0,03%, ủ 3 ngày) đến quá trình lên men tạo hành đen; phân lập các chất hóa học 1 - 9 bằng phổ NMR; xây dựng tiêu chuẩn cơ sở hành đen.
  2. Nhánh 2: Khảo sát các thông số chiết xuất hành đen (phương pháp chiết, dung môi, tỷ lệ DM/DL, số lần, nhiệt độ, thời gian chiết, nâng quy mô 2 kg/mẻ); cô đặc và loại tạp dịch chiết 1:1; thiết kế khảo sát tá dược phun sấy (Mal, AE, PVP K30, HPMC E6), tỷ lệ tá dược/chất rắn (TD/CR), thông số nhiệt độ khí sấy, tốc độ cấp dịch, tỷ lệ chất rắn/dịch phun (CR/DP); xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô và thử độ ổn định dài hạn, cấp tốc.
  3. Nhánh 3: Đánh giá độc tính cấp (tỷ lệ sống chết sau 72 giờ trên chuột), độc tính bán trường diễn (cân nặng, hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, AST, ALT, creatinin, ure, mô bệnh học gan, thận, lách thỏ); thử tác dụng ức chế 4 dòng tế bào ung thư, thử kháng vi sinh vật kiểm định, ức chế alpha-glucosidase, và thử nghiệm in vivo hạ lipid máu, hạ glucose máu trên chuột nhắt trắng theo mô hình bệnh lý thực nghiệm.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu được tác giả trình bày qua 48 bảng số liệu và 10 đồ thị/hình ảnh sắc ký, tập trung vào 3 nhóm kết quả:

  • Nhóm 1: Kết quả lên men và tiêu chuẩn hóa hành đen: Phương pháp định lượng CYC trên HPLC đạt độ tương thích hệ thống cao, độ tuyến tính tốt giữa nồng độ và diện tích pic, độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu kiểm nghiệm. Khảo sát lên men cho thấy việc xử lý ủ enzym protease 0,03% trong 3 ngày trước khi lên men giúp rút ngắn thời gian lên men và gia tăng đáng kể hàm lượng CYC so với mẫu không có enzym. Thành phần hóa học sau lên men ghi nhận sự gia tăng của polyphenol toàn phần, flavonoid toàn phần, đường khử và các acid amin. Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất (chất 1 - 9) từ hành đen, đồng thời ban hành TCCS cho hành ta và hành đen bán thành phẩm (với các chỉ tiêu cảm quan, độ ẩm, hàm lượng tro và hàm lượng CYC).
  • Nhóm 2: Kết quả bào chế cao khô hành đen và độ ổn định: Tác giả xác định được điều kiện chiết xuất tối ưu (dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu, nhiệt độ và thời gian chiết), thử nghiệm thành công ở quy mô 2 kg/mẻ. Quá trình phun sấy đạt hiệu suất cao khi phối hợp hệ tá dược thích hợp (Maltodextrin kết hợp Aerosil), giải quyết được hiện tượng bám dính buồng sấy do lượng đường khử cao trong hành đen. Cao khô thu được có chỉ số nén Carr (CI) và độ ẩm đạt tiêu chuẩn quy định (< 5%). Cao khô ổn định về cảm quan và hàm lượng hoạt chất CYC trong cả điều kiện bảo quản dài hạn và lão hóa cấp tốc.
  • Nhóm 3: Độc tính và tác dụng sinh học:
    • Độc tính: Ở thử nghiệm độc tính cấp, chuột uống cao khô hành đen liều tối đa không xuất hiện hiện tượng tử vong trong 72 giờ (không xác định được giá trị LD50 bằng đường uống). Ở thử nghiệm bán trường diễn trên thỏ, cao khô hành đen không làm biến đổi bệnh lý khối lượng cơ thể, các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết sắc tố) và các enzym, chỉ số sinh hóa (AST, ALT, ure, creatinin) nằm trong giới hạn sinh lý bình thường; hình ảnh mô bệnh học vi thể gan, thận, lách không có tổn thương thoái hóa hay hoại tử.
    • Tác dụng sinh học: Cao khô hành đen thể hiện hoạt tính ức chế trên cả 4 dòng tế bào ung thư khảo sát (đo bằng MTT, xác định tỷ lệ % ức chế và giá trị IC50); có tác dụng kháng trên một số chủng vi sinh vật kiểm định; ức chế enzym alpha-glucosidase in vitro. Trên mô hình in vivo, cao khô hành đen làm giảm có ý nghĩa thống kê các chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-C và cải thiện HDL-C ở chuột rối loạn lipid máu sau 21 ngày điều trị so với lô mô hình; đồng thời làm giảm glucose máu và cải thiện các chỉ số lipid máu trên chuột đái tháo đường thực nghiệm.

Chương 4: Bàn luận

Tác giả phân tích tính xác thực và cơ sở khoa học của các kết quả thực nghiệm:

  • Việc lựa chọn cycloalliin (CYC) làm chất đánh dấu: Luận án biện luận rằng CYC là phân tử sulfoxyd vòng có độ bền nhiệt và hóa học cao, không bị phân hủy bởi alliinase trong quá trình chế biến, đại diện phản ánh đúng mức độ chuyển hóa nhiệt từ isoalliin, do đó thích hợp hơn các chất dễ bay hơi để làm tiêu chuẩn định lượng kiểm soát chất lượng hành đen.
  • Về quy trình lên men có enzym xúc tác: Việc bổ sung protease 0,03% ngâm ủ trong 3 ngày thúc đẩy thủy phân protein màng và tế bào, giải phóng nhanh các acid amin tiền chất, tạo thuận lợi cho phản ứng biến đổi hóa học diễn ra nhanh hơn, giúp tiết kiệm thời gian lên men so với phương pháp tự lên men thông thường.
  • Về công nghệ phun sấy cao khô: Bàn luận chỉ rõ thách thức lớn nhất khi bào chế cao khô hành đen là hàm lượng đường khử cao gây hiện tượng nhiệt độ chuyển kính thấp, dẫn đến dính buồng sấy. Luận án đã giải quyết bằng cách bổ sung tá dược trơ Maltodextrin và chất chống dính Aerosil theo tỷ lệ khảo sát, giúp tạo bột cao khô đồng nhất, độ ẩm thấp, nâng cao hiệu suất thu hồi sản phẩm.
  • Về tính an toàn và hoạt tính dược lý: Tác giả thảo luận về độ an toàn cao của cao khô hành đen qua các chỉ số sinh hóa, huyết học và giải phẫu bệnh trên động vật. Đồng thời biện giải cơ chế hạ lipid máu và hạ glucose máu là do tác động phối hợp của CYC, các polyphenol và flavonoid toàn phần thông qua ức chế hấp thu lipid/glucid tại ruột (ức chế alpha-glucosidase) và tăng cường hoạt tính chống oxy hóa bảo vệ tế bào.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học:

  • Cung cấp bằng chứng thực nghiệm có hệ thống về sự biến đổi các nhóm hoạt chất (cycloalliin, polyphenol toàn phần, flavonoid toàn phần, đường khử, acid amin) trong quá trình lên men từ hành ta (Allium ascalonicum L.) thành hành đen.
  • Thiết lập và thẩm định thành công phương pháp định lượng cycloalliin (CYC) trong hành ta, hành đen và cao khô hành đen bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), làm cơ sở khoa học cho việc tiêu chuẩn hóa các sản phẩm chế biến từ hành ta.
  • Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất từ hành đen bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).

Các đóng góp mới về mặt thực tiễn và công nghệ:

  • Xây dựng thành công quy trình công nghệ lên men tạo hành đen quy mô phòng thí nghiệm có bổ sung enzym protease (nồng độ 0,03%, ủ 3 ngày), rút ngắn chu kỳ lên men và gia tăng hàm lượng hoạt chất.
  • Xây dựng hoàn chỉnh quy trình công nghệ chiết xuất hành đen quy mô 2 kg/mẻ và quy trình bào chế bột cao khô hành đen bằng phương pháp phun sấy với hệ tá dược phù hợp (Maltodextrin, Aerosil), đảm bảo hiệu suất thu hồi và chất lượng bột sấy.
  • Xây dựng được 3 bộ tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) kèm phương pháp kiểm nghiệm hoàn chỉnh cho: (1) Dược liệu hành ta Lý Sơn làm nguyên liệu, (2) Bán thành phẩm hành đen, và (3) Thành phẩm cao khô hành đen; bước đầu xác định được độ ổn định của cao khô trong điều kiện bảo quản dài hạn và lão hóa cấp tốc.
  • Cung cấp đầy đủ dữ liệu an toàn tiền lâm sàng (không xác định được LD50 đường uống trên chuột nhắt; không gây độc tính bán trường diễn trên thỏ ở các chỉ số huyết học, sinh hóa chức năng gan, thận và mô bệnh học) cùng các minh chứng về hoạt tính sinh học: ức chế tế bào ung thư, kháng khuẩn/nấm, ức chế enzym alpha-glucosidase, tác dụng hạ lipid máu và hạ glucose máu trên động vật thực nghiệm.

Kiến nghị của luận án:

  • Tiếp tục mở rộng nghiên cứu nâng quy mô bào chế cao khô hành đen từ quy mô phòng thí nghiệm lên quy mô pilot và sản xuất công nghiệp.
  • Ứng dụng bột cao khô hành đen để nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình sản xuất các dạng thuốc thành phẩm tiện dụng (viên nén, viên nang cứng).
  • Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử của cao khô hành đen đối với chuyển hóa glucid, lipid và tác dụng ức chế tế bào khối u.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án:

  • Nghiên cứu công nghệ lên men và bào chế cao khô hành đen mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (chiết xuất 2 kg/mẻ), chưa tiến hành thẩm định trên các thiết bị quy mô pilot hoặc công nghiệp lớn.
  • Nguồn dược liệu đầu vào trong nghiên cứu chỉ giới hạn thu thập tại một vùng địa lý duy nhất (huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi) vào vụ thu hoạch tháng 7/2017, chưa khảo sát so sánh biến thiên hoạt chất theo mùa vụ và các vùng trồng hành khác (như Vĩnh Châu, Kinh Môn, Phan Rang).
  • Các đánh giá về hiệu lực hạ lipid máu, hạ glucose máu và độc tính mới chỉ dừng lại ở mức độ in vitro và thực nghiệm trên động vật (chuột, thỏ), chưa thực hiện thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Hoàn thiện quy trình công nghệ ở quy mô bán công nghiệp (pilot) để đánh giá độ lặp lại và tính khả thi kinh tế - kỹ thuật.
  • Khảo sát sự tích lũy hoạt chất cycloalliin và hoạt tính sinh học của hành ta thu hái từ nhiều vùng sinh thái khác nhau trên cả nước.
  • Triển khai các nghiên cứu tiền lâm sàng mở rộng và hướng tới thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả hỗ trợ điều trị đái tháo đường và rối loạn lipid máu của chế phẩm chứa cao khô hành đen.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho các đối tượng:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và Bào chế thuốc: Tham khảo trực tiếp phương pháp thiết kế thực nghiệm tối ưu hóa quá trình phun sấy các dịch chiết giàu đường/chất khử; quy trình lựa chọn hệ tá dược độn và chống dính (Maltodextrin, Aerosil) nhằm cải thiện hiệu suất phun sấy và chỉ số nén Carr của bột cao khô.
  • Nghiên cứu sinh và cán bộ nghiên cứu ngành Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất: Tham khảo quy trình chi tiết thẩm định phương pháp định lượng cycloalliin bằng HPLC (độ thích hợp hệ thống, độ lặp lại, độ đúng, tính tuyến tính); các tiêu chí xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu thô, bán thành phẩm lên men và cao khô.
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu Dược lý học: Tham khảo phương pháp xây dựng các mô hình sàng lọc in vitro (MTT trên tế bào ung thư, ức chế alpha-glucosidase) và mô hình in vivo gây tăng lipid máu ngoại sinh, gây đái tháo đường bằng chế độ ăn kết hợp hóa chất STZ liều thấp trên chuột, cùng quy trình đánh giá độc tính bán trường diễn trên thỏ theo chuẩn kiểm nghiệm tiền lâm sàng.
  • Các doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Ứng dụng quy trình công nghệ lên men hành đen có bổ sung enzym protease và công nghệ sấy phun để chuyển giao phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ nguồn nông sản hành ta trong nước.

Câu hỏi thường gặp

  1. Hợp chất nào được tác giả lựa chọn làm chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng hành đen và cao khô hành đen, tại sao? Tác giả lựa chọn cycloalliin (CYC) làm chất đánh dấu. Nguyên nhân do CYC là hợp chất sulfoxyd mạch vòng có độ ổn định nhiệt và hóa học cao, không bị phân hủy bởi enzym alliinase trong quá trình băm nghiền hay chế biến, bền vững trong môi trường acid và base ở 70°C. Đồng thời, CYC là sản phẩm chuyển hóa nhiệt đặc trưng từ isoalliin trong quá trình lên men hành đen và có khả năng hấp thụ tử ngoại cực đại tại bước sóng 210 nm, rất thuận lợi cho việc định lượng chính xác bằng HPLC.

  2. Dược liệu hành ta sử dụng trong luận án được thu thập từ nguồn nào và do cơ quan nào giám định tên khoa học? Dược liệu hành ta được thu mua vào mùa thu hoạch tháng 7/2017 tại huyện đảo Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi. Mẫu nghiên cứu sau đó được nuôi cấy phát triển đầy đủ thân, rễ, lá để làm tiêu bản lưu tại Phòng Thí nghiệm 228, Bộ môn Khoa học Thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, và được TS. Đỗ Thị Xuyến giám định chính thức tên khoa học là Allium ascalonicum L., thuộc họ Hành (Liliaceae).

  3. Quá trình lên men hành đen trong luận án đã áp dụng cải tiến kỹ thuật nào để rút ngắn thời gian và gia tăng hoạt chất? Tác giả đã ứng dụng kỹ thuật bổ sung enzym ngoại bào protease với nồng độ 0,03%, tiến hành ngâm ủ trong thời gian 3 ngày trước khi lên men trạng thái rắn ở điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tối ưu. Biện pháp này giúp đẩy nhanh quá trình phân cắt protein thành các acid amin tự do, tạo tiền chất chuyển hóa thành các hợp chất có hoạt tính sinh học, từ đó rút ngắn đáng kể chu kỳ lên men tạo hành đen so với quy trình tự lên men thông thường.

  4. Bột cao khô hành đen được bào chế bằng phương pháp gì và gặp khó khăn kỹ thuật nào trong quá trình sản xuất? Bột cao khô hành đen được bào chế bằng phương pháp phun sấy (spray drying). Khó khăn kỹ thuật lớn nhất là dịch chiết hành đen chứa hàm lượng đường khử và acid amin tự do rất cao, làm giảm nhiệt độ chuyển kính của sản phẩm, dễ gây bết dính thành buồng sấy và làm giảm hiệu suất thu hồi. Tác giả đã giải quyết vấn đề này bằng cách khảo sát và lựa chọn phối hợp hệ tá dược thích hợp (Maltodextrin và Aerosil) với tỷ lệ chất rắn/dịch phun và thông số nhiệt độ khí sấy được chuẩn hóa.

  5. Độc tính của cao khô hành đen được đánh giá qua những chỉ tiêu thực nghiệm nào trên động vật? Độc tính cấp đường uống được đánh giá trên chuột nhắt trắng Swiss trong 72 giờ (chuột sống 100% ở mức liều thử nghiệm tối đa, không xác định được LD50). Độc tính bán trường diễn được đánh giá trên thỏ New Zealand White dùng chế phẩm liên tục trong 4 tuần; các chỉ tiêu theo dõi gồm có: biến thiên thể trọng thỏ; chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, huyết sắc tố); nồng độ sinh hóa máu (AST, ALT, ure, creatinin); cùng kiểm tra vi thể giải phẫu mô bệnh học trên các cơ quan gan, thận, lách.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả đã giải quyết đồng bộ và hoàn chỉnh các mục tiêu nghiên cứu từ việc xây dựng quy trình lên men tạo hành đen có xúc tác enzym protease từ hành ta Lý Sơn (Allium ascalonicum L.), đến việc bào chế thành công cao khô hành đen bằng công nghệ phun sấy và xây dựng hệ thống tiêu chuẩn cơ sở kèm đánh giá độ ổn định. Công trình đã cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm chuẩn xác khẳng định cao khô hành đen an toàn trên động vật thí nghiệm (độc tính cấp và bán trường diễn), đồng thời chứng minh các tác dụng sinh học có giá trị gồm ức chế tế bào ung thư, kháng khuẩn/nấm, hạ lipid máu và hạ glucose máu in vivo. Kết quả của luận án mở ra hướng ứng dụng thực tiễn trong việc nâng cao giá trị nguồn dược liệu hành ta Việt Nam để phát triển các sản phẩm dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe.