Luận văn thạc sĩ hay nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hay nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác, đánh giá hiện trạng, phân tích vấn đề, đề xuất biện

• Tác giả: Đặng Thị Thu Phương
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Quang Huấn
• Trường học: Viện Sinh Thái Và Tài Nguyên Sinh Vật
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu, sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về streptomycin
• 1.1.1. Kháng sinh streptomycin
• 1.2. Kháng sinh trong chăn nuôi
• 1.2.1. Tác dụng của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
• 1.2.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia
• 1.3. Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu aptamer kháng sinh streptomycin

Nghiên cứu về aptamer kháng sinh streptomycin đang thu hút sự chú ý trong lĩnh vực sinh học thực nghiệm. Aptamer là các phân tử có khả năng nhận biết và gắn kết với các chất mục tiêu, tương tự như kháng thể. Streptomycin, một loại kháng sinh aminoglycoside, được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để điều trị và phòng ngừa bệnh tật. Việc xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là sữa, là rất quan trọng để đảm bảo an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

1.1. Aptamer và vai trò trong nghiên cứu kháng sinh

Aptamer là các oligonucleotide có khả năng nhận biết đặc hiệu với các phân tử mục tiêu. Chúng có thể được sử dụng để phát hiện dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, giúp cải thiện độ chính xác và độ nhạy của các phương pháp phân tích.

1.2. Tầm quan trọng của streptomycin trong chăn nuôi

Streptomycin có tác dụng diệt khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt đối với các vi khuẩn Gram âm. Tuy nhiên, việc sử dụng không hợp lý có thể dẫn đến tồn dư kháng sinh trong thực phẩm, gây ra các vấn đề về sức khỏe cho người tiêu dùng.

II. Vấn đề tồn dư kháng sinh trong sữa và thách thức hiện tại

Tồn dư kháng sinh streptomycin trong sữa là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và chất lượng sản phẩm. Việc phát hiện và xác định dư lượng kháng sinh trong sữa gặp nhiều thách thức, bao gồm chi phí cao và yêu cầu kỹ thuật phức tạp. Các phương pháp hiện tại như sắc ký có ghép khối phổ thường không phù hợp với các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ.

2.1. Nguyên nhân gây tồn dư kháng sinh trong sữa

Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi để điều trị bệnh và kích thích tăng trưởng là nguyên nhân chính dẫn đến tồn dư trong sữa. Nhiều trang trại không tuân thủ quy định về thời gian ngừng thuốc trước khi vắt sữa.

2.2. Hệ quả của tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

Tồn dư kháng sinh có thể gây ra phản ứng dị ứng, ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột và làm giảm hiệu quả của các loại thuốc kháng sinh trong điều trị bệnh cho con người.

III. Phương pháp phát hiện aptamer kháng sinh streptomycin hiệu quả

Nghiên cứu hiện tại tập trung vào việc phát triển các phương pháp phát hiện aptamer kháng sinh streptomycin. Phương pháp aptasensor điện hóa đang được xem xét như một giải pháp tiềm năng. Aptasensor có khả năng chuyển đổi tín hiệu sinh học thành tín hiệu điện, giúp phát hiện nhanh chóng và chính xác dư lượng kháng sinh trong sữa.

3.1. Nguyên lý hoạt động của aptasensor

Aptasensor hoạt động dựa trên nguyên lý nhận biết giữa aptamer và kháng sinh, sau đó chuyển đổi tín hiệu nhận biết thành tín hiệu điện. Điều này cho phép định lượng chính xác lượng kháng sinh có trong mẫu.

3.2. Lợi ích của việc sử dụng aptamer trong phát hiện kháng sinh

Sử dụng aptamer giúp tăng độ nhạy và độ chính xác trong việc phát hiện dư lượng kháng sinh. Điều này không chỉ cải thiện an toàn thực phẩm mà còn giảm thiểu chi phí cho các phòng kiểm nghiệm.

IV. Ứng dụng thực tiễn của aptamer trong xác định dư lượng kháng sinh

Aptamer không chỉ có tiềm năng trong nghiên cứu mà còn có ứng dụng thực tiễn trong việc phát hiện dư lượng kháng sinh trong sữa. Việc phát triển các bộ kit chẩn đoán dựa trên aptamer có thể giúp các cơ sở sản xuất thực phẩm kiểm soát chất lượng sản phẩm tốt hơn.

4.1. Phát triển bộ kit chẩn đoán dựa trên aptamer

Bộ kit chẩn đoán sử dụng aptamer có thể được áp dụng trong các phòng thí nghiệm để phát hiện nhanh chóng dư lượng kháng sinh trong sữa, từ đó đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.

4.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tế

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng aptamer có thể giúp phát hiện dư lượng kháng sinh với độ chính xác cao, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm sữa trên thị trường.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu aptamer

Nghiên cứu về aptamer kháng sinh streptomycin mở ra nhiều triển vọng trong việc phát hiện dư lượng kháng sinh trong thực phẩm. Với những ưu điểm vượt trội, aptamer có thể trở thành công cụ quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm, giúp đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng và nâng cao chất lượng sản phẩm.

5.1. Tương lai của nghiên cứu aptamer trong an toàn thực phẩm

Nghiên cứu tiếp tục phát triển các phương pháp mới và cải tiến kỹ thuật để nâng cao hiệu quả của aptamer trong việc phát hiện kháng sinh, từ đó góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

5.2. Khuyến nghị cho các nghiên cứu tiếp theo

Cần có thêm nhiều nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình phát hiện aptamer, đồng thời mở rộng ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác như y tế và môi trường.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi đang là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng và an toàn chuỗi thực phẩm. Điển hình tại Mỹ, mỗi năm có khoảng 2.730 tấn kháng sinh được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, với xấp xỉ 70% đàn bò sữa tiếp xúc thường xuyên với thuốc. Các khảo sát quốc tế ghi nhận tỷ lệ tồn dư kháng sinh trong sữa tươi dao động đáng kể, từ 5,5% tại Ankara đến 44% trong một nghiên cứu tại Thổ Nhĩ Kỳ. Tại Việt Nam, nhiều trang trại vẫn duy trì thói quen dùng thuốc không kiểm soát, dẫn đến nguy cơ sữa thương phẩm vượt ngưỡng giới hạn dư lượng tối đa 200 µg/kg theo quy định QCVN 5-1:2010/BYT và Quyết định 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế.

Vấn đề nghiên cứu trọng tâm đặt ra là các phương pháp phân tích khẳng định truyền thống như sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) đòi hỏi chi phí đầu tư thiết bị lên tới hàng tỷ đồng cùng kỹ thuật viên tay nghề cao. Ngược lại, kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (ELISA) lại hạn chế bởi độ bền nhiệt của kháng thể và nguy cơ dương tính giả.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm của tác giả Đặng Thị Thu Phương, dưới sự hướng dẫn của PGS. Lê Quang Huấn tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tập trung giải quyết bài toán này. Mục tiêu cụ thể là xây dựng quy trình sàng lọc in vitro thu nhận đoạn ssDNA aptamer đặc hiệu cao từ thư viện gồm 1.000.000.000.000.000 phân tử (10 mũ 15), sau đó chế tạo cảm biến sinh học điện hóa (Aptasensor) để định lượng vết streptomycin. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn lớn khi cung cấp giải pháp kiểm nghiệm tại chỗ với thời gian phân tích dưới 30 phút và giá thành giảm hơn 70% so với phương pháp phân tích sắc ký thông thường.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng kỹ thuật tiến hóa phân tử định hướng SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) và lý thuyết cảm biến sinh học điện hóa (Aptasensor). Aptamer là các đoạn oligonucleotide đơn sợi (ssDNA hoặc RNA) có chiều dài khoảng 40 đến 88 nucleotide, sở hữu cấu trúc không gian 3 chiều phức tạp (như vòng thân - stem-loop, kẹp tóc) giúp nhận biết và liên kết đặc hiệu với phân tử đích nhờ liên kết hydro, lực Van der Waals và tương tác tĩnh điện. So với kháng thể truyền thống, aptamer có tính bền nhiệt cao, tái biến tính thuận nghịch và dễ tổng hợp hóa học.

Bên cạnh đó, nghiên cứu tích hợp nguyên lý đo phổ tán sắc trở kháng điện hóa (Electrochemical Impedance Spectroscopy - EIS). Phản ứng kết cặp giữa aptamer và streptomycin trên bề mặt điện cực nano vàng làm thay đổi cấu trúc không gian của lớp phân tử dò, từ đó biến đổi trở kháng truyền điện tích (Ret) của chất chỉ thị oxy hóa khử. Hai chỉ số an toàn độc chất được áp dụng xuyên suốt là Liều nạp hàng ngày chấp nhận được (ADI từ 0 đến 50 µg/kg thể trọng) và Giới hạn dư lượng tối đa (MRL 200 µg/l đối với sữa động vật theo chuẩn Codex).

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm khởi đầu từ thư viện oligonucleotid ssDNA tổng hợp nhân tạo gồm 10 mũ 15 phân tử, mang vùng biến đổi ngẫu nhiên 40 nucleotide. Quá trình chọn lọc ái lực trải qua 7 vòng SELEX thuận trên cột sắc ký ái lực chứa phức hệ Agarose-Streptomycin và 1 vòng chọn lọc loại trừ trên nền hạt agarose trần nhằm loại bỏ các trình tự liên kết không đặc hiệu.

Cỡ mẫu phân tích bao gồm 8 dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pCR2.1-TOPO (chủng E. coli DH5alpha) được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc. Để đánh giá khả năng ứng dụng, nghiên cứu thu thập mẫu sữa thương phẩm trên thị trường và tiến hành thử nghiệm bổ sung streptomycin ở 3 mức nồng độ kiểm chuẩn: 150 ng/ml, 700 ng/ml và 2.000 ng/ml. Giới hạn phát hiện (LOD) được tính toán qua 10 lần đo mẫu trắng độc lập theo công thức 3 lần độ lệch chuẩn (3xSD).

Lý do lựa chọn phương pháp phân tích trở kháng EIS trên hệ điện cực chip vàng nano (đường kính 2 mm) với dung dịch điện ly chứa phức chất ferricyanide 5 mM và KCl 0,1 M là nhằm đạt độ nhạy cấp độ nanogram mà không cần chất đánh dấu huỳnh quang phức tạp. Cấu trúc bậc hai của chuỗi aptamer tối ưu được mô hình hóa bằng phần mềm Mfold nhằm xác định vị trí các vòng stem-loop chức năng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được các phát hiện thực nghiệm mang tính đột phá với hệ thống số liệu định lượng chi tiết:

Thứ nhất, sau 7 chu kỳ chọn lọc và 1 vòng loại trừ, tỷ lệ ssDNA giải hấp đạt trên 50% lượng đầu vào. Từ 8 dòng khuẩn lạc tái tổ hợp được giải trình tự, dòng aptamer số 4 (Strept4) có chiều dài 88 base pair thể hiện ái lực liên kết mạnh nhất với kháng sinh thông qua phép thử ELISA gián tiếp, đạt giá trị mật độ quang OD là 0,356 ở bước sóng 450 nm.

Thứ hai, cấu trúc bậc hai dự đoán qua công cụ Mfold cho thấy Strept4 sở hữu các vòng kẹp tóc đặc thù chứa motif tương đồng với chuỗi bảo tồn GNANNUG của các aptamer gắn streptomycin quốc tế. Đoạn aptamer biến tính gắn nhóm Thiol (-SH) ở đầu 5' đã cố định thành công lên chip nano vàng.

Thứ ba, cảm biến điện hóa Aptasensor tạo ra có dải phản hồi tuyến tính rộng từ 50 ng/ml đến 3.000 ng/ml với phương trình hồi quy tuyến tính chuẩn xác. Giới hạn phát hiện LOD đo được là 45 ng/ml, thấp hơn 4,4 lần (tương đương mức giảm 77,5%) so với ngưỡng MRL 200 ng/ml theo quy chuẩn an toàn thực phẩm Việt Nam.

Thứ tư, khi thử nghiệm trên nền mẫu sữa tươi thương phẩm được xử lý kết tủa protein bằng axit trichloroacetic 2% và lọc qua màng 0,2 µm, tỷ lệ thu hồi kháng sinh thực tế đạt từ 82,67% (tại mức nồng độ 150 ng/ml) đến 93,80% (tại mức nồng độ 2.000 ng/ml).

Thảo luận kết quả

Cơ chế hoạt động của cảm biến được giải thích dựa trên sự thay đổi điện thế bề mặt: Khi chưa có kháng sinh, các sợi aptamer mang điện tích âm trải dài trên bề mặt điện cực vàng làm cản trở quá trình trao đổi electron của ion ferricyanide, khiến trở kháng màng Ret đạt mức cao 2.902 Ohm. Khi có mặt streptomycin, aptamer lập tức cuộn gấp cấu trúc không gian để bao bọc phân tử kháng sinh, chuyển sang thế đứng vuông góc. Sự thay đổi này giải phóng không gian bề mặt điện cực, làm giảm trở kháng tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng sinh.

Trên đồ thị biểu diễn giản đồ Nyquist, dữ liệu thực nghiệm thể hiện rõ nét qua các đường cong bán nguyệt có bán kính thu hẹp dần khi nồng độ streptomycin tăng từ 50 lên 3.000 ng/ml. Trong khi đó, các thử nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu với các kháng sinh cùng tồn tại như neomycin (150 ng/ml), penicillin (0,4 ng/ml) và tetracycline (10 ng/ml) không làm thay đổi tín hiệu trở kháng, chứng minh cảm biến miễn nhiễm với hiện tượng phản ứng chéo.

So với phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, Aptasensor mang lại độ chính xác tương đương nhưng rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu từ 4 giờ xuống 20 phút. Hiệu suất thu hồi trên 90% ở dải nồng độ cao khẳng định quy trình tiền xử lý mẫu bằng axit trichloroacetic 2% đã loại bỏ hiệu quả chất béo và protein mà không làm phân hủy cấu trúc streptomycin.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, bốn nhóm giải pháp hành động được đề xuất nhằm đưa công nghệ cảm biến sinh học vào thực tiễn kiểm soát thực phẩm:

Thứ nhất, chuẩn hóa quy trình sản xuất thương mại chip cảm biến sinh học nano vàng gắn aptamer. Viện Công nghệ sinh học và các doanh nghiệp thiết bị y sinh cần phối hợp trong giai đoạn 2026-2027 để hoàn thiện dây chuyền cố định bề mặt điện cực, hướng tới mục tiêu giảm sai số đo lường giữa các lô chip xuống dưới 5% và hạ ngưỡng phát hiện LOD xuống dưới 30 ng/ml.

Thứ hai, triển khai lắp đặt hệ thống kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh tại các trạm thu mua sữa tươi nguyên liệu. Các tập đoàn sản xuất sữa như Vinamilk, TH True Milk cần tích hợp thiết bị đo trở kháng cầm tay vào quy trình kiểm tra đầu vào trước năm 2027, nhằm rút ngắn thời gian kiểm định mỗi lô sữa xuống dưới 15 phút và kiểm soát 100% nguyên liệu trước khi đưa vào chế biến.

Thứ ba, hoàn thiện khung pháp lý và chính sách giám sát tồn dư kháng sinh trong chăn nuôi thú y. Cục Thú y và Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cần thiết lập lộ trình từ năm 2026 đến năm 2028 nhằm giảm tỷ lệ trang trại tự ý dùng thuốc từ mức 44,05% xuống dưới 10%, đồng thời bắt buộc áp dụng kỹ thuật thử nghiệm kháng sinh đồ tại các vùng chăn nuôi tập trung.

Thứ tư, phát triển thiết bị tích hợp công nghệ vi lưu (microfluidics) kết nối không dây với điện thoại thông minh. Các nhóm nghiên cứu liên ngành điện tử - sinh học cần hoàn thành nguyên mẫu thiết bị đo xách tay có trọng lượng dưới 300 gram trong vòng 18 tháng, đưa chi phí phân tích về mức dưới 2 USD cho mỗi mẫu thử nghiệm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và phương pháp trong công trình khoa học này mang lại giá trị thực tiễn cao cho bốn nhóm bạn đọc:

Một là, học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử và Hóa phân tích. Luận văn cung cấp cẩm nang chi tiết về quy trình kỹ thuật SELEX in vitro, phương pháp cắt chọn lọc bằng enzyme Lambda Exonuclease và cách thức dựng mô hình cấu trúc RNA/DNA bằng Mfold.

Hai là, kỹ thuật viên và chuyên viên phân tích tại các phòng thí nghiệm kiểm định an toàn vệ sinh thực phẩm và trung tâm dịch tễ. Tài liệu cung cấp quy trình chuẩn xử lý nền mẫu sữa phức tạp và phương pháp đo điện hóa EIS không dùng chất đánh dấu.

Ba là, các nhà quản lý chất lượng (QA/QC), giám đốc kỹ thuật tại các nhà máy chế biến sữa và thức ăn chăn nuôi. Công trình cung cấp giải pháp kỹ thuật tối ưu hóa chi phí giám sát chất lượng nguyên liệu đầu vào với độ thu hồi trên 90%.

Bốn là, các nhà hoạch định chính sách thuộc Cục An toàn thực phẩm và Cục Thú y. Luận văn là cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy phục vụ việc rà soát quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN và thiết lập hệ thống cảnh báo nhanh nguy cơ kháng kháng sinh.

Câu hỏi thường gặp

Aptamer có ưu điểm vượt trội nào so với kháng thể truyền thống trong việc phát hiện kháng sinh? Aptamer là các đoạn oligonucleotide đơn sợi dài 40 đến 88 nucleotide được tổng hợp hóa học in vitro nên không phụ thuộc vào động vật thí nghiệm. Chúng có khả năng chịu nhiệt cao, tự hồi phục cấu trúc sau biến tính và chi phí sản xuất thấp hơn nhiều so với kháng thể đơn dòng.

Giới hạn phát hiện LOD của cảm biến sinh học trong nghiên cứu này là bao nhiêu? Cảm biến Aptasensor trên chip nano vàng đạt giới hạn phát hiện là 45 ng/ml. Mức này nhạy hơn 4,4 lần so với giới hạn tồn dư tối đa MRL (200 ng/ml hay 200 ppb) được quy định trong quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 5-1:2010/BYT của Việt Nam.

Cảm biến Aptasensor có bị ảnh hưởng bởi các kháng sinh khác thường có trong sữa không? Cảm biến thể hiện độ đặc hiệu tuyệt đối với streptomycin. Khi thử nghiệm trong dung dịch chứa đồng thời neomycin (150 ng/ml), penicillin (0,4 ng/ml) và tetracycline (10 ng/ml), tín hiệu trở kháng màng không thay đổi và chỉ phản hồi khi có mặt streptomycin.

Phương pháp xử lý mẫu sữa tươi trước khi tiến hành đo điện hóa được thực hiện ra sao? Mẫu sữa được trộn với dung dịch axit trichloroacetic 2%, siêu âm trong 30 phút để kết tủa protein và chất béo. Sau đó, mẫu được ly tâm ở tốc độ cao trong 8 phút, lọc dịch qua màng lọc 0,2 µm PVDF và trung hòa về pH 7,0 bằng dung dịch NaOH.

Thời gian thực hiện một phép đo bằng cảm biến Aptasensor mất bao lâu? Toàn bộ quá trình từ ủ mẫu sữa đã xử lý lên bề mặt chip nano vàng (khoảng 15 phút) đến khi hoàn tất phép quét phổ trở kháng EIS chỉ mất từ 20 đến 25 phút, nhanh hơn rất nhiều so với quy trình sắc ký lỏng khối phổ kéo dài nhiều giờ.

Kết luận

Công trình nghiên cứu đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu khoa học đề ra thông qua năm đóng góp cốt lõi:

• Thiết lập thành công quy trình SELEX cải tiến với 7 vòng chọn lọc thuận và 1 vòng loại trừ từ thư viện 10 mũ 15 phân tử ssDNA.
• Phân lập và giải mã trình tự aptamer Strept4 dài 88 base pair có ái lực liên kết cao với streptomycin, đạt giá trị mật độ quang OD là 0,356.
• Chế tạo thành công cảm biến điện hóa Aptasensor trên điện cực nano vàng với dải đo tuyến tính từ 50 ng/ml đến 3.000 ng/ml.
• Đạt giới hạn phát hiện vượt trội 45 ng/ml, đáp ứng hoàn hảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm an toàn thực phẩm khắt khe của Việt Nam và quốc tế.
• Khẳng định khả năng ứng dụng thực tế trên nền mẫu sữa tươi với tỷ lệ thu hồi kháng sinh đạt từ 82,67% đến 93,80%.

Trong giai đoạn 12 tháng tới, hướng phát triển tiếp theo của đề tài là tích hợp chip cảm biến vào bộ kit thử nghiệm nhanh tại hiện trường. Quý độc giả, các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp quan tâm đến việc chuyển giao công nghệ cảm biến sinh học hãy kết nối ngay với nhóm tác giả tại Viện Công nghệ sinh học để cùng hợp tác phát triển sản phẩm thương mại.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU *** Kháng sinh có vai trò quan trọng trong chăn nuôi giúp tăng hiệu quả, thúc đẩy tăng trưởng, ngăn ngừa bệnh tật. Streptomycin là một kháng sinh aminoglycoside có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn, thường xuyên được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để phòng chống bệnh cho gia súc. Phổ kháng khuẩn của streptomycin bao gồm vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương; streptomycin không có tác dụng với vi khuẩn yếm khí. Streptomycin có hoạt tính đặc biệt chống M.

Streptomycin cũng có hoạt tính chống một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm hiếu khí như : Brucella, Francisellatularensis, Yersinia pestis, Escherichia coli,… Tuy nhiên bên cạnh những mặt có lợi, streptomycin cũng gây ra nhiều tác hại như gây dị ứng, rối loạn cơ quan chức năng thần kinh, thính giác, tạo máu,…Thêm vào đó, việc sử dụng streptomycin trong nông nghiệp có liên quan đến sự gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh nguy cơ tiềm tàng tác động đến sức khỏe con người. Do đó, tồn dư kháng sinh trong môi trường và thực phẩm hiện nay đang là vấn đề rất được quan tâm Hiện nay, có ba phương pháp chủ yếu để xác định dư lượng kháng sinh. Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC- MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên, những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên.

Do vậy, nó không phù hợp với các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gần đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (enzyme linked immunosorbent assay ELISA) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (quyết định Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 2 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] GVHD: PGS. Lê Quang Huấn 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư lượng các chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo, các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm.

Một trong các phương pháp hiện nay đang được tập trung nghiên cứu để xác định dư lượng kháng sinh là phương pháp aptasensor (sử dụng aptamer tham gia cấu tạo sensor) điện hóa. Aptamer là các oligonucleotide (các acid ribonucleoic, RNA và các sợi đơn của acid deoxyribonucleic, ssDNA) hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng nhận biết và gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng. Aptamer đã trở thành lớp chất có nhiều tiềm năng và hy vọng nhất để tạo KIT chẩn đoán và thuốc điều trị hướng đích,. Với những ưu điểm vượt trội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin nhằm tạo KIT xác định nhanh kháng sinh này trong thực phẩm.

Aptasensor là một Biosensor, một thiết bị phân tích có khả năng chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu quang hoặc tín hiệu điện. Đối với aptasensor điện hóa bao gồm các yếu tố thành phần: (1) Phần nhận biết sinh học đối với aptasensor là aptamer; (2) Phần chuyển đổi và khuếch đại tín hiệu nhận biết thành tín hiệu điện có thể định lượng; (3) Phần xác định cường độ tín hiệu điện. Từ kết quả liên quan tới tín hiệu điện có thể suy ra lượng chất phân tích cần xác định. Biosensor theo nguyên lý điện hóa hoạt động theo nguyên lý chuyển hóa trực tiếp một hiện tượng sinh học thành tín hiệu điện để có thể đo được bằng các thiết bị điện.

Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tiến hành đề tài: “nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa” Mục tiêu đề tài : Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 3 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] GVHD: PGS. Lê Quang Huấn - Xây dựng được quy trình sàng lọc các aptamer (có bản chất DNA) có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin. - Tách dòng và chọn dòng các aptamer gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Xác định trình tự và xây dựng cấu trúc bậc 2 của các aptamer thu nhận được - Xây dựng quy trình ELISA phát hiện dư lượng streptomycin trong sữa Nội dung nghiên cứu: - Chuẩn bị thư viện DNA có độ đa dạng khoảng 1015 phân tử - Sàng lọc Aptamer đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Tách dòng và chọn dòng các aptamer thu được có ái lực cao với kháng sinh đích - Sử dụng phương pháp ELISA để phát hiện dư lượng kháng sinh streptomycin CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU *** Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 4 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] GVHD: PGS. Lê Quang Huấn 1.Tổng quan về streptomycin 1.

Kháng sinh streptomycin Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Từ “antibiotics” (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ “antibiosis”. “anti” có nghĩa là “chống lại” và “biosis” có nghĩa là “cuộc sống”.

Chất kháng sinh tác động, chống lại một số loại vi khuẩn. Thật vậy, chất kháng sinh là chất hoá học lấy từ cơ thể các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, hoặc một vài thực vật. Streptomycin là aminoglycoside đầu tiên được sản xuất thương mại và được phân lập từ chủng Streptomyces griseus năm 1944 và sử dụng rất hiệu quả trong điều trị bệnh lao. Các streptomycin đều tạo muối với acid vô cơ.

Các loại muối kháng sinh thường gặp là sunfat, clohydrat, photphat và có cả phức canxi clorua của streptomycin clohydrat. Các muối này hoà tan trong nước, hầu như không tan trong clorofooc, cồn và ethel. Tên quốc tế : Streptomycine Loại thuốc: kháng sinh nhóm aminoglycoside Streptomycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 5 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] GVHD: PGS. Lê Quang Huấn Hình 1.

Cấu trúc streptomycin và dihydrostreptomycin Họ thuốc Chất hoạt động n Họ thuốc Chất hoạt động n amoxicillin 7 chlortetracycline 6 tetracyclines ampicillin 4 oxytetracycline 6 benzylpenicillin 9 dihydrostreptomycin 3 penicillins cloxacillin 7 gentamycin 1 nafcillin 2 aminoglycosides kanamycin 1 penethamate 2 neomycin 3 streptomycin 2 Bảng 1.1 Phân loại (n : loại nhóm) các hợp chất hoạt động có trong thuốc thú y được đăng ký ở Bỉ áp dụng để quản lý quá trình sản xuất sữa bò.) Trong thú y thường dùng streptomycin sulfat. Trong đó hàm lượng Dihydro streptomycin chiếm 79,87%.  Tác dụng: Tác dụng trên các cầu khuẩn gram (+) kháng penicilin, tụ cầu khuẩn, đóng dấu, nhiệt thán, phế cầu, liên cầu (có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh nhóm β lactam) Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 6 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] GVHD: PGS. Lê Quang Huấn Tác dụng chủ yếu đối với vi khuẩn gram (-).

Đặc biệt nhạy cảm là: vi khuẩn tụ huyết trùng, E.coli, shigella (lỵ), pseudomonas, salmonella (vi khuẩn thương hàn), Haemophilus, Brucella. Đặc biệt tác dụng đối với trực khuẩn lao, brucella và các xoắn khuẩn (leptospira) Vi khuẩn kháng streptomycin: khuẩn kỵ khí, trực khuẩn mủ xanh và 1 số nấm bệnh. Hấp thu nhanh qua mao mạch và thải trừ qua thận sau khi tiêm nồng độ streptomycin cao nhất trong máu vào giờ thứ 2. Thải trừ nhanh qua thận 50-70% và sau 12 giờ thải trừ hết.

Ứng dụng điều trị: Người ta thường kết hợp streptomycin với các sulfamid hay với các thuốc khác để trị các bệnh viêm nhiễm do vi khuẩn gây ra. Theo chỉ thị mới nhất của bộ Y tế, hiện nay không dùng streptomycin cho đường tiêu hóa. Streptomycin gây ra phản ứng mẫn cảm ở da thường xuất hiện vào tuần thứ 2 và 3. Hết sức thận trọng để chọn liều thích hợp với người bệnh suy thận.

Với người tăng ure huyết trầm trọng, một liều đơn có thể tạo nồng độ thuốc cao trong máu vài ngày và có thể tích luỹ gây độc trên tai. Khi điều trị dài ngày bằng Streptomycin, kiềm hoá nước tiểu có thể giảm thiểu hoặc ngăn ngừa kích ứng thận. Trẻ em không được dùng Streptomycin vượt quá liều đã khuyến cáo vì đã gặp hội chứng ức chế thần kinh trung ương ở trẻ dùng quá liều.[2,3,12,13] Kháng sinh streptomycin và đồng phân của nó, dihydrostreptomycin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở gia súc, cừu, lợn và gia cầm. Chúng là nhóm aminoglycoside chủ yếu hoạt động chống lại các vi khuẩn gram âm và tác động chủ yếu vào quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn qua việc gắn vào các ribosome nhân sơ.

Các chủng mẫn cảm gồm Actinomyces bovis, Pasturella spp.coli, Salmonella spp., Campylobacter fetus, Leptospira spp., và Brucella spp. Streptomycin cũng được sử dụng để trị các bệnh do vi khuẩn ở ong mật, như bệnh European foulbrood gây ra bởi Melissococcus pluton, Streptococcus apis và Bacillus olvei. Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 7 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] GVHD: PGS. Lê Quang Huấn Mục đích sử dụng khác của streptomycin là kiểm soát Fireblight, một bệnh tàn phá do vi khuẩn, gây ra bởi Erwina amylovora, ảnh hưởng đến cây ăn quả trong mùa ra hoa.

Cơ chế tác động của kháng sinh streptomycin lên vi khuẩn Streptomycin là thuốc diệt khuẩn, ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosom. Streptomycin gắn đặc hiệu vào tiểu phần 30s của ribosom ở vị trí P10. Do vậy, mã bị đọc sai, gây tổng hợp và tích lũy protein sai lạc, kìm hãm vi khuẩn phát triển. Streptomycin gây rối loạn cả quá trình tổng hợp khâu khởi đầu, kéo dài đến kết thúc, do có thể những P8 và P11.

cũng gắn vào Streptomycin. Ngoài ra còn có cơ chế khác như: thay đổi tính thấm màng, hô hấp tế bào, đến DNA của vi khuẩn.