Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lc ms ms xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm luận văn ths hóa học 6732673

Chuyên khảo hóa học phân tích Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lc ms ms xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng

• Tác giả: Vũ Thị Trang
• Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Xuân Trung
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Phương Pháp LC-MS/MS Xác Định Kháng Sinh Sulfonamid Trong Thịt Gia Súc
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs)
• 1.1.1. Lịch sử phát hiện
• 1.1.2. Phân loại SAs
• 1.1.3. Cấu tạo của SAs
• 1.1.4. Tác dụng của SAs
• 1.1.5. Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid
• 1.1.6. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép của SAs trong thực phẩm
• 1.1.7. Các phương pháp xác định SAs
• 2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng
• 2.2.2. Detector khối phổ
• 2.2.3. Phân tích định tính và định lượng bằng LC/MS
• 2.2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu
• 2.2.4.1. Thiết bị và dụng cụ
• 2.2.4.2. Hóa chất, chất chuẩn
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Tối ưu điều kiện tách và xác định Sulfonamid trên thiết bị LC/MS/MS
• 3.1.1. Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS)
• 3.1.2. Lựa chọn cột tách
• 3.1.3. Khảo sát chương trình gradient
• 3.1.4. Khảo sát tốc độ pha động
• 3.1.5. Khảo sát thành phần acid formic trong pha động
• 3.2. Tối ưu quá trình xử lý mẫu phân tích các SAs
• 3.2.1. Khảo sát qui trình chiết
• 3.2.2. Khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết
• 3.2.3. Khảo sát thành phần MeOH trong dung môi chiết
• 3.2.4. Khảo sát khối lượng pha rắn PSA
• 3.3. Đánh giá phương pháp phân tích
• 3.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn
• 3.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp
• 3.3.3. Đánh giá độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi)
• 3.4. Phân tích mẫu thực
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Sắc đồ khảo sát nồng độ acid formic trong pha động
• Phụ lục 2: Kết quả khảo sát qui trình chiết mẫu
• Phụ lục 3: Kết quả khảo sát nồng độ acid acetic trong dung môi chiết
• Phụ lục 4: Kết quả khảo sát nồng độ MeOH trong dung môi chiết và khối lượng PSA
• Phụ lục 5: Sắc đồ thẩm định phương pháp (độ lặp lại, độ thu hồi)
• Phụ lục 6: Một số sắc đồ phân tích mẫu thực tế

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Phương Pháp LC MS MS Xác Định Kháng Sinh Sulfonamid

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc xác định dư lượng kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn đảm bảo độ chính xác cao trong việc phân tích các hợp chất hóa học phức tạp. Việc áp dụng LC-MS/MS trong nghiên cứu này nhằm mục đích bảo vệ sức khỏe cộng đồng và đảm bảo an toàn thực phẩm.

1.1. Kháng Sinh Sulfonamid Là Gì

Kháng sinh sulfonamid (SAs) là nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp, có tác dụng kìm khuẩn mạnh mẽ. Chúng được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để phòng và điều trị bệnh cho gia súc gia cầm, đồng thời kích thích tăng trưởng. Tuy nhiên, việc sử dụng không đúng cách có thể dẫn đến tồn dư trong thực phẩm.

1.2. Tại Sao Cần Phân Tích Dư Lượng Kháng Sinh

Việc phân tích dư lượng kháng sinh trong thịt gia súc là cần thiết để đảm bảo an toàn thực phẩm. Tồn dư kháng sinh có thể gây ra các vấn đề sức khỏe nghiêm trọng cho người tiêu dùng, bao gồm kháng thuốc và các phản ứng dị ứng.

II. Thách Thức Trong Việc Xác Định Kháng Sinh Sulfonamid

Mặc dù phương pháp LC-MS/MS mang lại nhiều lợi ích, nhưng vẫn tồn tại một số thách thức trong việc xác định kháng sinh sulfonamid. Các yếu tố như độ nhạy của thiết bị, quy trình xử lý mẫu và sự phức tạp của mẫu thực phẩm có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích.

2.1. Độ Nhạy Của Phương Pháp LC MS MS

Độ nhạy của LC-MS/MS là yếu tố quyết định trong việc phát hiện các nồng độ thấp của kháng sinh sulfonamid. Việc tối ưu hóa các điều kiện phân tích là cần thiết để đạt được độ nhạy cao nhất.

2.2. Quy Trình Xử Lý Mẫu

Quy trình xử lý mẫu phức tạp có thể dẫn đến sự mất mát hoặc biến đổi của kháng sinh trong mẫu. Do đó, việc phát triển quy trình chiết xuất hiệu quả là rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác của kết quả.

III. Phương Pháp LC MS MS Trong Phân Tích Kháng Sinh

Phương pháp LC-MS/MS được sử dụng để phân tích kháng sinh sulfonamid nhờ vào khả năng tách biệt và xác định các hợp chất hóa học phức tạp. Phương pháp này cho phép phát hiện nhanh chóng và chính xác các dư lượng kháng sinh trong thịt gia súc.

3.1. Nguyên Tắc Hoạt Động Của LC MS MS

LC-MS/MS kết hợp giữa sắc ký lỏng và khối phổ, cho phép tách biệt các hợp chất và xác định chúng dựa trên khối lượng. Nguyên tắc này giúp phát hiện các kháng sinh sulfonamid với độ chính xác cao.

3.2. Tối Ưu Hóa Điều Kiện Phân Tích

Tối ưu hóa các điều kiện phân tích như tốc độ dòng, thành phần pha động và nhiệt độ là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất trong việc xác định kháng sinh sulfonamid.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Phương Pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS không chỉ được áp dụng trong nghiên cứu mà còn trong thực tiễn kiểm tra an toàn thực phẩm. Việc sử dụng phương pháp này giúp các cơ quan chức năng phát hiện nhanh chóng và chính xác dư lượng kháng sinh trong thịt gia súc.

4.1. Kết Quả Nghiên Cứu Thực Tế

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng phương pháp LC-MS/MS có thể phát hiện dư lượng kháng sinh sulfonamid trong các mẫu thịt gia súc với độ chính xác cao. Kết quả này góp phần nâng cao chất lượng kiểm tra an toàn thực phẩm.

4.2. Tác Động Đến Chính Sách An Toàn Thực Phẩm

Việc áp dụng LC-MS/MS trong kiểm tra an toàn thực phẩm có thể giúp cải thiện chính sách quản lý chất lượng thực phẩm, đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng và nâng cao uy tín của ngành chăn nuôi.

V. Kết Luận Về Phương Pháp LC MS MS

Phương pháp LC-MS/MS là một công cụ mạnh mẽ trong việc xác định kháng sinh sulfonamid trong thịt gia súc. Việc áp dụng phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về phương pháp LC-MS/MS sẽ tiếp tục được mở rộng để cải thiện độ nhạy và độ chính xác, đồng thời phát triển các quy trình xử lý mẫu hiệu quả hơn.

5.2. Đề Xuất Chính Sách

Cần có các chính sách rõ ràng và nghiêm ngặt hơn về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng và đảm bảo an toàn thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thực trạng lạm dụng thuốc thú y và chất kích thích tăng trọng trong chăn nuôi đang tạo ra những thách thức nghiêm trọng đối với an toàn vệ sinh thực phẩm toàn cầu. Theo các báo cáo giám sát an toàn thực phẩm, tình trạng tồn dư hóa chất trong thịt thương phẩm không chỉ dẫn đến nguy cơ ngộ độc cấp tính mà còn gây ra các tổn thương mãn tính khó lường cho sức khỏe người tiêu dùng. Trong số các hợp chất điều trị, nhóm kháng sinh Sulfonamid (SAs) được sử dụng phổ biến nhất để phòng ngừa các bệnh đường ruột, hô hấp và kích thích tăng trưởng ở gia súc, gia cầm. Việc sử dụng tùy tiện, không tuân thủ thời gian ngừng thuốc trước khi xuất bán khiến dư lượng Sulfonamid tích tụ trong mô thịt vượt ngưỡng quy định từ 2 đến 10 lần. Dư lượng này đi vào cơ thể người qua chuỗi thức ăn, làm gia tăng nguy cơ kháng kháng sinh của vi khuẩn, gây suy giảm miễn dịch, rối loạn tạo máu, sỏi thận do lắng đọng tinh thể, dị ứng nặng và làm tăng nguy cơ ung thư tuyến giáp.

Trước các nguy cơ trên, nhiều quốc gia đã ban hành quy định nghiêm ngặt về giới hạn tồn dư tối đa (MRL) đối với Sulfonamid trong thực phẩm. Tại Liên minh Châu Âu, Hoa Kỳ và Việt Nam, mức MRL chung cho tổng các Sulfonamid trong thịt và phủ tạng là 100 µg/kg. Tại các thị trường khắt khe hơn như Nhật Bản và Hàn Quốc, ngưỡng giới hạn này bị siết chặt ở mức 10 đến 20 µg/kg. Các cuộc kiểm tra định kỳ tại Hoa Kỳ trên 17.241 mẫu thịt từng ghi nhận tỷ lệ vi phạm của nhóm Sulfonamid lên tới 0,24% với hàm lượng cá biệt đạt 2,51 ppm. Tại Việt Nam, nhiều đợt kiểm tra mẫu thủy hải sản và thịt cũng phát hiện tồn dư Sulfadimidine và Sulfadiazine ở mức từ 4,16 ppb đến 123,26 ppb.

Đề tài luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Hóa phân tích thực hiện mục tiêu phát triển và thẩm định phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS) kết hợp kỹ thuật chiết phân tán pha rắn QuEChERS nhằm định tính và định lượng đồng thời 10 kháng sinh nhóm Sulfonamid trong các nền mẫu thịt gia súc, gia cầm tại địa bàn Hà Nội. Nghiên cứu mang ý nghĩa thực tiễn to lớn khi thiết lập quy trình kiểm nghiệm có độ nhạy cao với giới hạn phát hiện 0,025 ppb, rút ngắn thời gian phân tích xuống còn 18 phút cho mỗi lần chạy mẫu, đáp ứng hoàn hảo các yêu cầu kiểm soát chất lượng thực phẩm xuất nhập khẩu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên cơ sở hóa học phân tích hiện đại, tập trung vào cơ chế tác dụng sinh hóa của Sulfonamid và các nguyên lý phân tích đa cấu tử:

• Cơ chế kháng khuẩn và đặc tính hóa lý của Sulfonamid: Sulfonamid là nhóm hợp chất hữu cơ mang nhóm chức sulfonamid gắn trực tiếp vào nhân thơm. Chúng hoạt động theo cơ chế ức chế cạnh tranh với acid p-aminobenzoic (PABA), ngăn cản enzyme dihydropteroate synthase tổng hợp acid folic cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Về mặt hóa lý, 10 hợp chất Sulfonamid khảo sát có khối lượng phân tử phân bố từ 249,29 g/mol đến 310,33 g/mol với giá trị pKa biến thiên trong khoảng 4,83 đến 8,54.
• Nguyên lý sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC): Quá trình tách 10 kháng sinh được thực hiện trên cột sắc ký C18 với pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực. Nhờ sự khác biệt về độ phân cực và ái lực liên kết giữa các chất phân tích với pha tĩnh, các Sulfonamid được rửa giải chọn lọc theo chương trình gradient nồng độ dung môi.
• Kỹ thuật khối phổ hai lần (Tandem Mass Spectrometry - MS/MS): Sử dụng nguồn ion hóa phun điện tử ở chế độ ion dương (ESI+). Tại buồng va chạm, các ion mẹ dạng [M+H]+ bị phân mảnh bởi khí trơ argon để sinh ra các ion con đặc trưng. Kỹ thuật quan trắc đa phản ứng (MRM) cho phép chọn lọc 2 mảnh ion con cho mỗi hợp chất: 1 mảnh có cường độ mạnh nhất dùng để định lượng (m/z 156 đặc trưng cho nhân aminobenzenesulfonyl) và 1 mảnh thứ cấp dùng để khẳng định định tính.
• Kỹ thuật chiết QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe): Kỹ thuật xử lý mẫu cải tiến ứng dụng cơ chế chiết lỏng - lỏng bằng acetonitril bị acid hóa kết hợp chiết phân tán pha rắn (d-SPE). Chất hấp phụ Primary Secondary Amine (PSA) được sử dụng để loại bỏ triệt để các acid béo, đường và hợp chất hữu cơ phân cực trong nền mẫu thịt mà không làm mất chất phân tích.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn chất chuẩn phân tích độ tinh khiết cao từ 99,4% đến 99,9% cung cấp bởi hãng Sigma-Aldrich, bao gồm: Sulfisomidine (SIM), Sulfadiazine (SD), Sulfathiazole (STZ), Sulfapyridine (SP), Sulfamerazine (SM), Sulfamonomethoxine (SMM), Sulfachloropyridazine (SCP), Sulfamethoxazole (SMX), Sulfisoxazole (SSA), Sulfadimethoxine (SDM), cùng chất nội chuẩn đồng vị Sulfadimethoxine-d4 (SDM-d4, m/z 315/124).

Mẫu nghiên cứu gồm 120 mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò và phủ tạng (gan, thận) được thu thập ngẫu nhiên tại các chợ bán lẻ và cơ sở giết mổ trên địa bàn thành phố Hà Nội trong năm 2012. Khối lượng mẫu lấy từ 100 g đến 500 g mỗi mẫu, được bảo quản lạnh ở nhiệt độ từ 0 đến 2°C và tiến hành đồng nhất xử lý trong vòng 24 giờ (mẫu lưu trữ bảo quản dài hạn ở -20°C).

Phương pháp phân tích được vận hành trên hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng Shimadzu HPLC 20 AXL ghép nối đầu dò khối phổ 3 tứ cực ABI 5500 QQQ. Cột phân tích sử dụng là Agilent C18 kích thước 150 mm × 2,1 mm với cỡ hạt 3,5 µm. Lý do lựa chọn hệ thiết bị này là nhằm tận dụng khả năng phân tách vượt trội của hạt sắc ký kích thước nhỏ kết hợp độ chọn lọc ion tuyệt đối của đầu dò khối phổ tứ cực chập ba, giúp loại trừ triệt để hiện tượng dương tính giả thường gặp trong các kỹ thuật ELISA hoặc HPLC-UV truyền thống.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình thực nghiệm đã thiết lập các thông số tối ưu toàn diện từ khâu chạy máy sắc ký đến quy trình tinh chế mẫu, thu được các kết quả nổi bật:

• Tối ưu hóa điều kiện sắc ký và ion hóa khối phổ: Xác định được nguồn ESI+ hoạt động ổn định nhất ở điện thế phun 4,5 kV, nhiệt độ đầu phun 500°C, nhiệt độ mao quản 350°C và áp suất khí màn 35 psi. Pha động tối ưu bao gồm kênh A (nước chứa 0,1% acid formic) và kênh B (acetonitril). Tốc độ dòng được ấn định ở 0,4 mL/min với thể tích tiêm mẫu 10 µL. Toàn bộ 10 hợp chất Sulfonamid được phân tách hoàn toàn trong 18 phút mà không xuất hiện hiện tượng chồng lấp pic.
• Hiệu quả xử lý mẫu bằng kỹ thuật QuEChERS: Dung môi chiết tối ưu là hỗn hợp acetonitril chứa 1% acid acetic kết hợp methanol (tỷ lệ 75:25), phối hợp cùng 200 mg chất hấp phụ PSA cho 2 mL dịch chiết. Hiệu suất thu hồi của phương pháp đạt từ 71,1% đến 118,3%, đáp ứng hoàn hảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Liên minh Châu Âu (Quyết định 2002/657/EC).
• Độ nhạy và khoảng tuyến tính của phương pháp: Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu thực có khoảng tuyến tính rất rộng từ 0,5 ng/mL đến 500 ng/mL với hệ số tương quan R² dao động từ 0,9991 đến 1,0000. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp đạt mức cực thấp từ 0,025 ppb đến 0,05 ppb, và giới hạn định lượng (LOQ) nằm trong khoảng 0,05 ppb đến 0,1 ppb. Độ lặp lại của phương pháp thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) đều nhỏ hơn 12% tại các mức nồng độ thêm chuẩn 5 ppb, 10 ppb và 20 ppb.
• Khảo sát mẫu thực tế: Phân tích các mẫu thịt và phủ tạng thu thập trên thị trường Hà Nội phát hiện nhiều mẫu nhiễm Sulfadimethoxine (SDM) và Sulfadiazine (SD) trong gan lợn và phủ tạng gà với nồng độ dao động từ 2,5 ppb đến 45,8 ppb.

Thảo luận kết quả

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid formic trong pha động cho thấy nồng độ 0,1% đem lại diện tích pic và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tối ưu nhất cho đại đa số các chất. Khi nồng độ acid formic tăng lên 0,2%, sự cạnh tranh ion hóa trong buồng phun ESI làm suy giảm diện tích pic của Sulfamonomethoxine từ 4,54 × 10⁵ xuống 2,76 × 10⁵ đơn vị diện tích. Ngược lại, nếu không có acid formic (0%), diện tích pic của Sulfisoxazole giảm mạnh tới 79,8% do khả năng proton hóa [M+H]+ bị ức chế.

So sánh với các nghiên cứu tiền nhiệm sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng truyền thống tiêu tốn hàng trăm mililít dung môi độc hại (như diclometan, n-hexan), kỹ thuật QuEChERS cải tiến trong luận văn giúp tiết kiệm hơn 80% lượng dung môi hữu cơ và rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu tới 60%. Dữ liệu thực nghiệm của nghiên cứu được hệ thống hóa trực quan thông qua các đồ thị khảo sát gradient rửa giải, phổ phân mảnh MS/MS và bảng đánh giá độ chụm tại 3 mức nồng độ theo tiêu chuẩn quốc tế. Phương pháp này hoàn toàn vượt trội so với kỹ thuật HPLC-DAD (LOD khoảng 1 ppb) và phương pháp miễn dịch enzyme ELISA vốn thường xuyên xảy ra phản ứng chéo gây sai số dương tính giả.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu khoa học và thực tiễn kiểm soát an toàn thực phẩm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp cụ thể:

• Chuẩn hóa và ban hành quy trình phân tích quốc gia: Đề xuất Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và Thủy sản phối hợp cùng Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia ban hành quy trình LC-MS/MS kết hợp QuEChERS thành Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN) để kiểm tra đa dư lượng Sulfonamid trong thịt tươi và sản phẩm chế biến, hoàn thành lộ trình trong vòng 12 tháng tới.
• Nâng cao tần suất giám sát tại các lò mổ và chợ đầu mối: Các Chi cục Thú y địa phương cần áp dụng phương pháp này vào chương trình kiểm soát tồn dư độc chất quốc gia hàng năm, nâng quy mô kiểm tra lên tối thiểu 1.500 mẫu/năm tại các đô thị loại I, xử lý nghiêm các lô hàng có dư lượng vượt ngưỡng MRL 100 µg/kg.
• Kiểm soát chuỗi cung ứng và hướng dẫn sử dụng kháng sinh: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cần siết chặt việc kê đơn thuốc thú y, bắt buộc người chăn nuôi tuân thủ thời gian ngừng dùng thuốc Sulfonamid tối thiểu từ 7 đến 14 ngày trước khi xuất chuồng, giảm tỷ lệ phát hiện dư lượng trong thịt xuống dưới 0,05% vào năm 2028.
• Ứng dụng công nghệ truy xuất nguồn gốc số: Thiết lập hệ thống cơ sở dữ liệu số hóa kết nối kết quả kiểm nghiệm từ các phòng xét nghiệm đạt chuẩn ISO/IEC 17025 với hệ thống tem truy xuất nguồn gốc QR code trên từng lô sản phẩm thịt gia súc, gia cầm bán ra thị trường.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Tài liệu luận văn là nguồn tư liệu chuyên sâu có giá trị ứng dụng cao cho nhiều đối tượng:

• Kiểm nghiệm viên và chuyên viên phân tích hóa học: Các kỹ thuật viên tại các trung tâm kiểm nghiệm dược phẩm, thực phẩm, môi trường có thể áp dụng trực tiếp các thông số tối ưu (bước quét thế DP, năng lượng va chạm CE, chương trình gradient 18 phút) để thẩm định và vận hành máy LC-MS/MS trong phân tích thường quy.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và thú y: Cán bộ phụ trách xây dựng chính sách, thanh tra chuyên ngành có thêm căn cứ khoa học chuẩn xác để đánh giá mức độ rủi ro của Sulfonamid và thiết lập các hàng rào kỹ thuật kiểm soát thịt nhập khẩu.
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh và giảng viên đại học: Là tài liệu tham khảo mẫu mực về phương pháp nghiên cứu Hóa phân tích, cách thức tối ưu hóa đầu dò khối phổ hai lần, kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh QuEChERS và quy trình thẩm định phương pháp theo tiêu chuẩn quốc tế ISO/IEC 17025 và Quyết định 2002/657/EC.
• Doanh nghiệp chăn nuôi và chế biến thực phẩm xuất khẩu: Giúp các chuyên gia kiểm soát chất lượng (QA/QC) tại các nhà máy chế biến thịt nắm vững ngưỡng MRL tại thị trường EU, Nhật Bản, Mỹ để kiểm soát nghiêm ngặt dư lượng kháng sinh từ khâu nguyên liệu đầu vào.

Câu hỏi thường gặp

Kháng sinh nhóm Sulfonamid gây ra những nguy cơ sức khỏe cụ thể nào cho người sử dụng thực phẩm nhiễm dư lượng? Việc tiêu thụ thịt tồn dư Sulfonamid kéo dài khiến cơ thể tích tụ độc chất, gây đột biến và hình thành vi khuẩn kháng kháng sinh. Ngoài ra, thuốc có thể acetyl hóa tại gan tạo hợp chất khó tan làm tắc ống thận, gây viêm thận, tiểu ra máu, kích thích dị ứng cấp tính và gây hội chứng hoại tử biểu bì Lyell.

Tại sao phương pháp LC-MS/MS lại vượt trội hơn hẳn so với HPLC-UV và ELISA? Phương pháp LC-MS/MS sử dụng chế độ lọc 2 lần tứ cực (MRM) theo tỷ số khối trên điện tích chính xác của ion mẹ và 2 ion con đặc trưng, giúp loại trừ hoàn toàn ảnh hưởng nền mẫu phức tạp của thịt. Trong khi đó, HPLC-UV dễ bị nhiễu pic tạp chất và ELISA thường xuyên cho kết quả dương tính giả do phản ứng chéo.

Kỹ thuật QuEChERS trong luận văn mang lại những cải tiến kỹ thuật gì? QuEChERS giúp đơn giản hóa quá trình tinh chế bằng cách sử dụng lượng nhỏ dung môi acetonitril acid hóa và chất hấp phụ PSA dạng hạt phân tán. Kỹ thuật này loại sạch chất béo và protein trong mẫu thịt chỉ qua vài bước lắc, ly tâm trong 15 phút, tiết kiệm 80% chi phí hóa chất so với chiết cột SPE truyền thống.

Giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp này có đáp ứng được các tiêu chuẩn xuất khẩu khắt khe không? Phương pháp đạt giới hạn định lượng từ 0,05 ppb đến 0,1 ppb (tương đương 0,05 - 0,1 µg/kg), thấp hơn từ 100 đến 1.000 lần so với ngưỡng MRL cho phép của Việt Nam, Hoa Kỳ, EU (100 ppb) và Nhật Bản (20 ppb), đảm bảo đáp ứng tuyệt đối mọi quy chuẩn kiểm nghiệm khắt khe nhất thế giới.

Vai trò của chất nội chuẩn Sulfadimethoxine-d4 trong phân tích khối phổ là gì? Sulfadimethoxine-d4 là chất đồng vị có tính chất hóa lý tương đồng hoàn toàn với chất phân tích nhưng có khối lượng phân tử khác biệt (m/z 315). Việc bổ sung chất nội chuẩn giúp hiệu chỉnh chính xác các sai số phát sinh do suy giảm tín hiệu ion hóa (matrix effect) và bù trừ sự thất thoát trong toàn bộ quá trình xử lý mẫu.

Kết luận

• Xây dựng thành công quy trình phân tích đồng thời 10 kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc, gia cầm trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ABI 5500 QQQ với thời gian phân tách tối ưu trong 18 phút.
• Ứng dụng hiệu quả kỹ thuật chuẩn bị mẫu xanh QuEChERS sử dụng chất hấp phụ PSA, đạt hiệu suất thu hồi cao từ 71,1% đến 118,3% và giảm thiểu lượng dung môi độc hại thải ra môi trường.
• Phương pháp có độ nhạy vượt bậc với LOD đạt 0,025 ppb, LOQ đạt 0,05 ppb, độ tuyến tính R² > 0,999 và độ lặp lại RSD < 12%, đáp ứng đầy đủ các tiêu chí thẩm định theo Quyết định 2002/657/EC của Liên minh Châu Âu.
• Phát hiện thực trạng nhiễm dư lượng Sulfonamid trên các mẫu thịt và nội tạng động vật bán lẻ tại Hà Nội, cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ công tác giám sát an toàn thực phẩm.
• Khuyến nghị các viện kiểm nghiệm và cơ quan quản lý chuyển giao kỹ thuật này vào kiểm nghiệm thường quy ngay trong giai đoạn 2026-2028 nhằm nâng cao năng lực kiểm soát chuỗi cung ứng thực phẩm an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU An toàn thực phẩm đang là mối quan tâm hàng đầu của toàn xã hội. An toàn thực phẩm trong sản phẩm chăn nuôi không chỉ đơn thuần là sản phẩm (thịt, trứng, sữa) không nhiễm bẩn, ôi thiu, nhiễm khuẩn (yếu tố gây ngộ độc cấp tính), mà còn ở chỗ sản phẩm chứa các chất gây ra ngộ độc tích luỹ, mãn tính hay trƣờng diễn (hocmon, kháng sinh, độc chất). Trong vô số các nguyên nhân dẫn đế n viê ̣c mấ t an toàn vê ̣ sinh thƣ̣c phẩ m , thì vấn đề về dƣ lƣợng thuốc kháng sinh và tồn dƣ chất kích thí ch tăng tro ̣ng trong thịt gia súc gia cầm cũng là thực trạng nan giải và đáng báo động. Với mô ̣t lƣơ ̣ng thƣ̣c phẩ m khổ ng lồ tƣ̀ đô ̣ng vâ ̣t đang đƣơ ̣c tiêu thu ̣ trên thi ̣trƣờng , ít ai nghĩ đến viê ̣c mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đa ng phải dần tić h lũy dƣ lƣơ ̣ng chấ t kić h thić h tăng tro ̣ng và thuố c kháng sinh.

Nguyên nhân do ngƣời dân sƣ̉ du ̣ng rấ t tùy tiê ̣n các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa , trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chó ng lớn. Hâ ̣u quả là dƣ lƣơ ̣ng chấ t kích thích và thuố c kháng sinh trong thiṭ gia súc, gia cầ m vƣơ ̣t ngƣỡng cho phép gấ p nhiề u lầ n , tuy không gây ngô ̣ đô ̣c cấ p tiń h tƣ́c thời, nhƣng sẽ gây nguy ha ̣i về lâu dài cho sƣ́c khỏe của ngƣờ i tiêu dùng. Sulfonamid (SAs) là một nhóm thuốc kháng sinh tổng hợp đóng một vai trò quan trọng và hiệu quả trong việc hạn chế sự nhiễm trùng do vi khuẩn và vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa của vật nuôi. Vì vậy, chúng đƣợc sử dụng trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trƣởng, ngăn chặn và điều trị một loạt các bệnh ở gia súc gia cầm nhƣ các bệnh về tiêu hóa hay hô hấp.

Song hệ quả không thể tránh khỏi khi sử dụng nhóm các chất kháng sinh này là tồn dƣ của chúng trên thịt gia súc gia cầm, gây nguy cơ kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật, làm giảm sức đề kháng của vật nuôi, và gây hại cho sức khỏe con ngƣời nhƣ: ung thƣ tuyến giáp, sốc phản vệ và kháng thuốc [1]. Ngộ độc thực phẩm thƣờng xảy ra do thiếu sót trong công tác kiểm tra, thanh tra từ nguyên liệu dùng để chế biến thực phẩm, do sơ xuất trong nấu nƣớng, vệ sinh. 10 Việc nghiên cứu xác định dƣ lƣợng SAs trong thịt gia súc gia cầm đã đƣợc nhiều tác giả trên thế giới quan tâm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu sâu.

Việc nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp xác định nhanh, chính xác SAs giúp cho công tác thanh tra kiểm tra đƣợc chặt chẽ, đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ là phƣơng pháp hiện đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh và chính xác. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ(LC-MS/MS) xác đinh dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamid trong thịt gia súc gia cầm ”. Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: - Tối ƣu các điều kiện chạy máy LC-MS/MS để tách và xác định các SAs - Tối ƣu quá trình xử lý mẫu.

- Ứng dụng phân tích trên một số mẫu thực tế. 11 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm sulfonamid (SAs) 1.1 Lịch sử phát hiện [6] Năm 1935 ngƣời ta thấy chất màu prontosil đƣợc chuyển hóa invitro thành hoạt chất sulfanilamide, một dẫn xuất ngăn ngừa đƣợc nhiễm liên cầu ở chuột. Sau đó các sulfonamid khác đƣợc tổng hợp, là những chất chuyển hóa của sulfanilamide với các vị trí thế N1 và N4.

Trong đó sulfanilamide và sulfadiazine đƣợc cấp phép vào năm 1939 và 1941. Theo các nhà Dƣợc học phân loại thì Sulfonamid là một nhóm thuốc có tác động tĩnh khuẩn miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong việc loại bỏ tận gốc sự nhiễm trùng. Do đó, các sulfonamid trở thành những tác nhân hóa trị liệu đầu tiên đƣợc dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiễm khuẩn toàn thân ở ngƣời. Từ đó tới nay, một loạt sulfonamid khác đƣợc cấp phép, mặc dù hiện nay, hiếm khi chúng đƣợc dùng đơn độc mà thƣờng hay kết hợp với một vài chất khác.

Phân loại SAs Các SAs đƣợc phân loại theo khả năng hấp thu và thời gian bài thải chúng ra khỏi cơ thể, đa số bài thải qua đƣờng thận bằng cách khuếch tán thụ động. Tuy nhiên, có một số bị tái hấp thụ ở ống thận làm cho chúng duy trì lâu hơn trong cơ thể [8]. Dựa vào thời gian tác dụng có thể chia SAs thành 4 nhóm nhƣ sau: - SAs tác động toàn thân, bao gồm: + SAs tác động nhanh (3-6 giờ), bài thải nhanh: sulfamerazin, sulfadimidin, sulfathiazole. + SAs nửa chậm (6-10 giờ): sulfapyridin, sulfamethoxazol, sulfadiazine.

12 +SAs bài thải chậm (10-12 giờ): sulfamethoxypyridazin, sulfadimethoxin, sulfadoxin. - SAs kháng khuẩn đƣờng ruột: sulfaguanidin,phtalylsulfathiazon. - SAs tác động tại chỗ (thuốc nhỏ mắt): sulfacetamid,sulfadiazine bạc. - SAs trị cầu trùng (thƣờng kết hợp với nhóm diaminopyrimidin): sulfadimidin, solfaquinoxalin, sulfadimethoxin,sulfadoxin.3 Cấu tạo của SAs Thay thế các gốc R1, R2, R3 khác nhau, sẽ cho các SAs khác nhau Bảng 1.1: Cấu trúc hoá học của một số SAs đƣợc xác định trong đề tài Khối SAs Công thức lƣợng STT pKa Công thức cấu tạo phân tử phân tử (g/mol) Sulfisomidine (SIM) 1 C12H14N4O2S 278,331 7,35 4-amino-N-(2,6- dimethylpyrimidin-4-yl) benzenesulfonamid Sulfadiazine (SD) 2 C10H10N4O2S 250,278 6,5 4-amino-N-pyrimidin- 2-yl-benzenesulfonamid Sulfathiazole 3 C9H9N3O2S2 255,319 7,24 (STZ) 13 4-amino-N-(1,3-thiazol- 2-yl)benzenesulfonamid Sulfapyridine (SP) 4 C11H11N3O2S 249,29 8,54 (4-amino-N-pyridin-2- ylbenzenesulfonamid) Sulfamerazine (SM) 5 C11H12N4O2S 264,305 6,98 4-amino-N-(4- methylpyrimidin-2-yl) benzenesulfonamid Sulfamonomethoxine (SMM) 4-Amino-N-(6- 6 C11H12N4O3S 280,30 6,05 methoxy-4- pyrimidinyl)benzenesulf onamid Sulfachloropyridazine (SCP) 7 C10H9ClN4O2S 284,72 5,90 N’-(6-Chloro-3- pyridazinyl)sulfanilamid e Sulfamethoxazole (SMX) 8 C10H11N3O3S 253,279 5,81 4-amino-N-(5- methylisoxazol-3-yl)- benzenesulfonamid 14 Sulfisoxazole (SSA) 9 C11H13N3O3S 267,30 4,83 4-amino-N-(3,4- dimethyl-1,2-oxazol-5- yl)benzenesulfonamid Sulfadimethoxine (SDM) 4-amino-N-(2,6- 10 dimethoxypyrimidin-4- C12H14N4O4S 310,33 6,21 yl) benzenesulfonamid đồng vị của SDM: trong phân tử có Sulfadimethoxine-d4 C12H10D4N4O4 bốn nguyên tử hidro 1H bị thay thế 11 314 6,21 (IS) S bởi bốn nguyên tử deuteri 2H, đƣợc dùng làm nội chuẩn 1.4 Tác dụng của SAs  Cơ chế tác động: SAs là một hợp chất hữu cơ có chứa các gốc SO2NH2 (amid của acid sulfonic).

Cấu trúc phân tử của nó tƣơng tự nhƣ p-aminobenzoic acid (PABA) là cần thiết trong các vi khuẩn sinh vật, nhƣ một chất nền của enzym dihydropteroat cho sự tổng hợp của acid tetrahydrofolic (THF). Cơ chế tác dụng kìm khuẩn của SAs là do nó cạnh tranh với acid PABA trong tế bào vi khuẩn, làm cho việc tổng hợp và vận chuyển acid folic (động vật có vú dùng acid folic có trong thực phẩm còn vi khuẩn phải tổng hợp folic) thành nucleoprotein cần cho mọi tế bào sống của vi khuẩn bị ngƣng trệ, gây rối loạn sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. PABA kết hợp với pteroic acid hoặc glutamic để tạo pteroylglutamic acid (PGA), chất này nhƣ một coenzyme trong sự tổng hợp purin và timin. PGA cũng là một phần của phân tử B12 có liên quan tới sự biến dƣỡng acid amin và purin.

Do đó khi thiếu 15 PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Điều này cũng giải thích tại sao các vi khuẩn tự tổng hợp đƣợc PABA thì đề kháng với SAs và tại sao thymin, purin, methionin, và một số amin khác lại đối kháng hiệu quả với SAs. Do đó vi khuẩn bị tiêu diệt trƣớc sức đề kháng của cơ thể hoặc nhờ tác dụng của thuốc. Chúng đƣợc sử dụng trong phòng và điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn, đái tháo đƣờng, phù, tăng huyết áp, và bệnh gút… Các sulfonamid có tác dụng kháng khuẩn cho hệ miễn dịch giữ vai trò chủ yếu trong loại trừ tận gốc sự nhiễm trùng.

Sulfonamid có hiệu quả cao trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng cấp tính vì giai đoạn này vi khuẩn có mức biến dƣỡng cao, dễ kết hợp với Sulfonamid, thêm vào đó khả năng thực bào còn mạnh và sự khuếch tán của thuốc chƣa bị cản trở bởi quá trình xơ hóa trong viêm mãn tính. Chúng có khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, Protozoa [9].  Tác dụng phụ của SAs: Các loại SAs đƣợc các nhà sản xuất đƣa vào trong thức ăn gia súc, gia cầm, các thuốc chống mốc, thuốc chống oxy hóa giúp sinh vật tăng sức đề kháng, phòng trị nhiễm khuẩn đồng thời giống nhƣ một chất kích thích tăng trƣởng đem lại lợi ích cho ngƣời chăn nuôi. Tuy nhiên những năm gần đây xảy ra hiện tƣợng kháng kháng sinh và tồn dƣ kháng sinh trong thịt, cá, tôm…do ngƣời nông dân sử dụng không đúng cách và quá nhiều thuốc kháng sinh và không đảm bảo thời gian ngƣng sử dụng trƣớc khi thu hoạch, làm cho kháng sinh tích tụ trong thịt.

Khi ngƣời tiêu dùng sử dụng thực phẩm có chứa dƣ lƣợng kháng sinh SAs trong thịt, tôm, cá, trứng, sữa.sau một thời gian dài sử dụng chúng sẽ tích lũy trong cơ thể, có thể gây hiện tƣợng kháng kháng sinh ở ngƣời, làm mất đi cả vi khuẩn có lợi, ngoài ra SAs dễ bị acetyl hóa ở gan thành N4- acetyl sulfonamid khó tan trong nƣớc, đồng thời từ quản cầu thận tới ống dẫn tiểu, SA đƣợc làm đậm đặc 50 lần, sự bài tiết H+ vào ống thận làm nƣớc tiểu càng acid hơn, giảm tính tan của sulfonamid từ đó trở thành tinh thể trong ống thận, gây hiện tƣợng kết tinh ở đƣờng tiết niệu gây viêm thận và sỏi thận, tiểu ra máu. Sulfonamid có khả năng gây ra một loạt các phản ứng bất lợi, bao gồm cả rối loạn đƣờng tiết niệu, rối loạn tạo máu , rối loạn chuyển hóa porphyrin, và 16 phản ứng quá mẫn cảm. Khi sử dụng với liều lƣợng lớn, chúng có thể gây ra phản ứng dị ứng mạnh mẽ. Hai hội chứng nghiêm trọng nhất là hội chứng Stevens- Johnson và hoại tử biểu bì độc hại (cũng đƣợc gọi là hội chứng Lyell).

SAs hấp thu tốt qua đƣờng tiêu hóa, ngoại trừ các SAs có tác động tại chỗ.5 Tình hình sử dụng kháng sinh Sulfonamid SAs là một trong những nhóm chất lâu đời nhất của các hợp chất kháng khuẩn. Chúng đƣợc sử dụng lâm sàng trong 50 năm và lần đầu tiên đƣợc đăng ký tại Úc năm 1940. Tại nhiều quốc gia, việc sử dụng SAs trong chăn nuôi đƣợc xem xét trên nhiều khía cạnh nhƣ dƣ lƣợng còn lại trong thịt sau giết mổ, mức độ ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời…trở thành vấn đề khá nhạy cảm trong thƣơng mại quốc tế.