Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm

Luận án tiến sĩ nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm, góp phần vào y học cổ truyền và hiện đại.

• Tác giả: Nguyễn Việt Phương
• Người hướng dẫn: GS. Đái Duy Ban
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Hóa sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH
• 1.1.1. Suy giảm miễn dịch bẩm sinh
• 1.1.2. Suy giảm miễn dịch mắc phải
• 1.2. HỆ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT
• 1.2.1. Các cơ quan lympho tham gia đáp ứng miễn dịch
• 1.2.2. Đáp ứng miễn dịch ở gia cầm
• 1.2.3. Giới thiệu bệnh do virus Gumboro
• 1.2.4. Giới thiệu Hội chứng rồi loạn sinh sản và hô hấp do virus ở lợn
• 1.3. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
• 1.4. MỘT SỐ HỢP CHẤT THỰC VẬT THỨ SINH HỖ TRỢ MIỄN DỊCH ĐƢỢC BIẾT ĐẾN
• 1.4.1. Các hợp chất Phenol và Tanin
• 1.4.2. Adenosine và cordycepin
• 1.5. Các cây thuốc đƣợc nghiên cứu
• 1.5.1. Trinh nữ hoàng cung
• 1.5.2. Diệp hạ châu
• 1.5.3. Đông trùng hạ thảo
• 1.6. TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC MỚI TỪ NHIỀU CÂY THUỐC VIỆT NAM CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ MIỄN DỊCH Ở ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
• 2.1.1. Động vật thực nghiệm
• 2.1.2. Tiêu chuẩn chọn thỏ làm thí nghiệm
• 2.1.3. Tiêu chuẩn chọn chuột làm thí nghiệm
• 2.1.4. Virus cƣờng độc Gumboro
• 2.2. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
• 2.2.1. Các cây thuốc đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
• 2.2.2. Phân loại mẫu
• 2.3. THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
• 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.4.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu cây thuốc
• 2.4.2. Phƣơng pháp xác định một số hoạt chất trong 7 cây thuốc
• 2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng carbohydrate
• 2.4.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng phenolic tổng
• 2.4.5. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polisaccharide
• 2.4.6. Phƣơng pháp định lƣợng saponin toàn phần
• 2.4.7. Phƣơng pháp xác định adenosin tổng số
• 2.4.8. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng cordycepin
• 2.4.9. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng flavonoid
• 2.4.10. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng Rg1 và Rg2 toàn phần
• 2.4.11. Phƣơng pháp định tính nhóm hợp chất phytosterol
• 2.4.12. Phƣơng pháp thử hoạt tính DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)
• 2.4.13. Phƣơng pháp xác định kim loại nặng (Pb)
• 2.4.14. Thiết kế nghiên cứu
• 2.4.15. Phƣơng pháp xử lý và phân tích số liệu
• 2.4.16. Phƣơng pháp kiểm soát kết quả các xét nghiệm
• 2.4.17. Đạo đức trong nghiên cứu
• 2.4.18. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. LỰA CHỌN 7 CÂY THUỐC THÔNG QUA ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC
• 3.1.1. Đánh giá về hàm lƣợng adenosin và cordycepin của đông trùng hạ thảo Isaria cerambycidae Lưu et
• 3.1.2. Hàm lƣợng phenolic tổng của trinh nữ hoàng cung
• 3.1.3. Đánh giá về hàm lƣợng cacbohydrate tổng số có trong linh chi
• 3.1.4. Đánh giá hàm lƣợng Phenolic tổng số có trong diệp hạ châu
• 3.1.5. Hàm lƣợng -spinasterol 3-O--D-glycopylannosid và polisaccharid tổng có trong đẳng sâm
• 3.1.6. Đánh giá về hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Rg2 toàn phần của tam thất
• 3.1.7. Đánh giá về hàm lƣợng lycopen và β-Caoroten của Gấc
• 3.2. BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG CÓ TỶ LỆ PHÙ HỢP TỪ 7 CÂY THUỐC VIỆT NAM
• 3.2.1. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đẳng sâm (ĐS) có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.2.2. Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ diệp hạ châu có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.2.3. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ linh chi có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.2.4. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ gấc có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.2.5. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ trinh nữ hoàng cung có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.2.6. Đánh giá, chọn lọc tỷ lệ của tam thất có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.2.7. Đánh giá, lựa chọn tỷ lệ đông trùng hạ thảo có trong Viên tăng sức đề kháng
• 3.3. QUY TRÌNH BÀO CHẾ VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG TỪ 7 CÂY THUỐC ĐƢỢC CHỌN
• 3.3.1. Phƣơng pháp bào chế 1
• 3.3.2. Phƣơng pháp bào chế 2
• 3.3.3. Kết quả phân tích và kiểm nghiệm Viên tăng đề kháng đƣợc chế tạo
• 3.4. NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ BÁN TRƢỜNG DIỄN CỦA VIÊN TĂNG SỨC ĐỀ KHÁNG
• 3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp
• 3.4.2. Nghiên cứu độc tính bán trƣờng diễn
• 3.5. Nghiên cứu mô hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở gà Lƣơng Phƣợng bằng virus Gumboro và thử tác dụng của Viên tăng sức đề kháng
• 3.5.1. Các triệu chứng lâm sàng ở gà khi ăn Viên tăng sức đề kháng
• 3.5.2. Nghiên cứu tổn thƣơng đại thể ở gà
• 3.5.3. Xét nghiệm giải phẫu bệnh lý vi thể tuyến Fabricius các lô gà
• 3.5.4. Đo hiệu giá kháng thể Gumboro qua phản ứng trung hoà huyết thanh và theo dõi biểu hiện ở các lô gà
• 3.5.5. Nghiên cứu tác động của Viên tăng sức đề kháng lên gà bị gây suy giảm miễn dịch bằng virus Gumboro thông qua những chỉ số hóa sinh, huyết học
• 3.6. Đánh giá biểu hiện của virus PRRS (gây bệnh tai xanh ở lợn) ở cấp độ tế bào khi thử nghiệm với Viên tăng sức đề kháng
• 3.7. Đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng đối với chức năng, hình thái gan và thận trên thỏ thực nghiệm
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về 7 cây thuốc Việt Nam hỗ trợ miễn dịch cho động vật

Việt Nam nổi tiếng với hệ thực vật phong phú, trong đó có nhiều loại cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch cho động vật. Nghiên cứu này tập trung vào 7 cây thuốc tiêu biểu, được sử dụng trong y học cổ truyền và hiện đại. Những cây thuốc này không chỉ có giá trị dinh dưỡng mà còn chứa các hợp chất sinh học có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giúp động vật chống lại bệnh tật.

1.1. Giới thiệu về các cây thuốc hỗ trợ miễn dịch

Các cây thuốc như linh chi, đông trùng hạ thảo, và gấc đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng tích cực trong việc hỗ trợ miễn dịch cho động vật. Những cây thuốc này chứa nhiều hoạt chất sinh học, giúp tăng cường sức đề kháng và cải thiện sức khỏe tổng thể.

1.2. Lịch sử sử dụng cây thuốc trong y học cổ truyền

Từ xa xưa, người dân Việt Nam đã biết sử dụng cây thuốc để chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe. Các nghiên cứu hiện đại đã chỉ ra rằng nhiều loại cây thuốc truyền thống có thể hỗ trợ miễn dịch hiệu quả, mở ra hướng đi mới cho y học hiện đại.

II. Vấn đề suy giảm miễn dịch ở động vật và thách thức hiện tại

Suy giảm miễn dịch là một vấn đề nghiêm trọng trong chăn nuôi và thú y. Các bệnh như Gumboro ở gà và hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Việc tìm kiếm các giải pháp tự nhiên từ cây thuốc để hỗ trợ miễn dịch là cần thiết.

2.1. Nguyên nhân gây suy giảm miễn dịch ở động vật

Nhiều yếu tố như virus, vi khuẩn, và điều kiện sống không đảm bảo có thể dẫn đến suy giảm miễn dịch ở động vật. Điều này làm cho chúng dễ bị nhiễm bệnh và giảm năng suất.

2.2. Tác động của suy giảm miễn dịch đến sức khỏe động vật

Suy giảm miễn dịch không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe của động vật mà còn gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi. Việc tìm kiếm các biện pháp hỗ trợ miễn dịch là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe động vật.

III. Phương pháp nghiên cứu cây thuốc hỗ trợ miễn dịch cho động vật

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân tích hoạt chất trong 7 cây thuốc. Các phương pháp này bao gồm phân tích hóa sinh, huyết học và mô học để đánh giá tác động của các cây thuốc đến hệ miễn dịch của động vật.

3.1. Phương pháp thu thập và phân tích mẫu cây thuốc

Mẫu cây thuốc được thu thập từ các vùng chuyên canh và được phân tích để xác định hàm lượng các hoạt chất sinh học. Các phương pháp như sắc ký lỏng và sắc ký khí được sử dụng để phân tích.

3.2. Thiết kế thí nghiệm trên động vật thực nghiệm

Thí nghiệm được thiết kế để đánh giá tác động của các chế phẩm từ cây thuốc lên động vật thực nghiệm. Các chỉ số như sức đề kháng, phản ứng miễn dịch và các chỉ số sinh hóa được theo dõi.

IV. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn của cây thuốc

Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây thuốc như trinh nữ hoàng cung và tam thất có tác dụng tích cực trong việc hỗ trợ miễn dịch cho động vật. Các chế phẩm từ những cây thuốc này có thể được ứng dụng trong chăn nuôi để nâng cao sức khỏe động vật.

4.1. Tác động của các cây thuốc đến sức đề kháng

Các nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng chế phẩm từ cây thuốc có thể làm tăng sức đề kháng của động vật, giúp chúng chống lại các bệnh truyền nhiễm hiệu quả hơn.

4.2. Ứng dụng trong chăn nuôi và thú y

Các chế phẩm từ cây thuốc có thể được sử dụng như một giải pháp tự nhiên trong chăn nuôi, giúp giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và tăng cường sức khỏe cho động vật.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu cây thuốc

Nghiên cứu về các cây thuốc hỗ trợ miễn dịch cho động vật mở ra nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm tự nhiên an toàn và hiệu quả. Việc tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng các cây thuốc này sẽ góp phần nâng cao sức khỏe động vật và bảo vệ môi trường.

5.1. Tương lai của nghiên cứu cây thuốc tại Việt Nam

Việt Nam có tiềm năng lớn trong việc nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ cây thuốc. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình bào chế và đánh giá hiệu quả lâm sàng.

5.2. Khuyến nghị cho ngành chăn nuôi

Ngành chăn nuôi cần áp dụng các sản phẩm từ cây thuốc như một phần trong chiến lược quản lý sức khỏe động vật, nhằm giảm thiểu bệnh tật và nâng cao năng suất.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học chuyên ngành Hóa sinh học (mã số 62420116) của nghiên cứu sinh Nguyễn Việt Phương, thực hiện tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2019 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Quang Huy, mang tiêu đề: "Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm".

Về tính cấp thiết, tác giả luận án chỉ ra rằng Việt Nam sở hữu hệ thực vật nhiệt đới phong phú với nhiều loài cây thuốc chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao và có truyền thống lâu đời trong việc sử dụng thảo dược để chăm sóc sức khỏe. Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu trong nước nhằm bào chế một chế phẩm phối hợp đa thành phần từ thảo dược có tác dụng tăng cường đề kháng, hỗ trợ miễn dịch được kiểm chứng đồng bộ qua các chỉ số hóa sinh, huyết học, miễn dịch, tế bào và mô bệnh học trên động vật thực nghiệm còn rất ít và tản mạn. Cùng với đó, các bệnh truyền nhiễm gây suy giảm miễn dịch nghiêm trọng trên động vật nuôi như bệnh Gumboro ở gia cầm (làm hoại tử túi Fabricius, xuất huyết cơ, tỷ lệ mắc lên tới 100%, tỷ lệ chết 20 - 50%), hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - bệnh tai xanh do virus làm tổn thương đại thực bào phế nang) và hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) do virus HIV gây ra ở người đang gây thiệt hại lớn nhưng thiếu các chế phẩm nguồn gốc thảo dược hỗ trợ kiểm soát hiệu quả với chi phí phù hợp.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm 2 mục tiêu cụ thể:

1. Bào chế được Viên tăng sức đề kháng cơ thể từ 7 cây thuốc Việt Nam.
2. Mô tả tác động của Viên tăng sức đề kháng trên động vật thực nghiệm.

Nội dung nghiên cứu của luận án gồm 4 nội dung:

1. Khảo sát, chọn lọc thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu ở Việt Nam tại những vùng chuyên canh cây thuốc.
2. Lựa chọn tỷ lệ phối trộn phù hợp từ 7 cây thuốc Việt Nam để bào chế Viên tăng sức đề kháng có hoạt chất sinh học, an toàn trong sử dụng.
3. Đánh giá mức độ an toàn của Viên tăng sức đề kháng là thực phẩm chức năng được Bộ Y tế cấp phép.
4. Nghiên cứu, đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng trên các đối tượng động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của luận án:

• Đối tượng nghiên cứu: Bảy loài thảo dược gồm Đẳng sâm Việt Nam (Codonopsis javanica), Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus / Phyllanthus urinaria), Linh chi (Ganoderma lucidum), Gấc (Momordica cochinchinensis), Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium), Tam thất (Panax pseudoginseng), Đông trùng hạ thảo (Isaria cerambycidae Lưu et al., 2009). Động vật thực nghiệm bao gồm gà Lương Phượng 25 ngày tuổi, thỏ nuôi 2,2 - 2,4 kg, chuột nhắt trắng dòng Swiss thuần chủng 20 - 22 g. Mầm bệnh thực nghiệm gồm virus cường độc Gumboro và virus gây hội chứng PRRS ở lợn.
• Phạm vi không gian và thời gian: Mẫu thực vật được thu thập tại 21 xã thuộc 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam (Lào Cai, Bắc Giang, Hòa Bình, Thanh Hóa, Hưng Yên). Các thực nghiệm được triển khai tại Bộ môn Hóa sinh và Sinh học Phân tử - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN), Viện Dược liệu Trung ương, Viện Thú y Trung ương, Viện Hóa sinh Biển, Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Viện Công nghệ Sinh học, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương và Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - Hà Nội; luận án hoàn thành năm 2019.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Trong Chương 1, tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong nước và quốc tế liên quan đến cơ chế miễn dịch, bệnh lý suy giảm miễn dịch, đặc điểm các mầm bệnh thực nghiệm và cơ sở dược lý của 7 cây thuốc.

Về hệ thống miễn dịch, luận án phân tích cấu trúc đáp ứng miễn dịch tự nhiên và thu được. Ở động vật và người, các tế bào miễn dịch trung gian bao gồm tế bào diệt tự nhiên (NK cell) có khả năng tiết perforin làm thủng màng tế bào đích, tế bào LAK kích hoạt bởi interleukin (IL-2), đại thực bào tiết yếu tố hoại tử u (TNF-α) và enzyme lysosome, cùng bạch cầu toan tính kích hoạt bởi IL-5. Ở gia cầm, các cơ quan lympho trung ương được chỉ rõ gồm tủy xương, tuyến ức và túi Fabricius (bursa of Fabricius). Túi Fabricius là nơi biệt hóa lympho B và tiết bursin (tripeptide hoạt hóa lympho B); cơ quan lympho ngoại vi gồm lách, hạch hạnh nhân manh tràng, tuyến Harder và các mô bạch huyết.

Về các mô hình suy giảm miễn dịch:

• Bệnh Gumboro (Infectious Bursal Disease - IBDV) do virus ARN sợi đôi gây ra, tấn công trực tiếp vào tế bào lympho tại túi Fabricius, làm viêm, teo túi, gây xuất huyết cơ ngực, cơ đùi và hủy hoại đáp ứng miễn dịch của gia cầm trước các loại vắc xin.
• Bệnh tai xanh ở lợn (PRRS) do virus ARN thuộc họ Arteriviridae gây ra, tấn công đại thực bào phế nang (PAMs), gây tổn thương cơ chế bảo vệ của phổi và rối loạn sinh sản. Tác giả dẫn chứng báo cáo của Paolo Martelli (2013) tại Hội nghị APVS về tính đa dạng di truyền của PRRS do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp.
• Tình hình nhiễm HIV: Luận án dẫn số liệu UNAIDS đến cuối năm 2015 thế giới có 35 triệu người nhiễm HIV, 1,5 triệu người tử vong; tại Việt Nam tính đến hết năm 2015 có 227.154 người nhiễm còn sống và khoảng 254.000 người nhiễm trong cộng đồng.

Về các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học:

• Tác giả tổng quan cấu trúc và hoạt tính của nhóm alkaloids, flavonoids (khung 15 carbon chia thành flavone, flavanone, flavonol, isoflavonoid, anthocyanidin, chalcones), glycoside, saponins (theo Qiu Y. và cộng sự, 2014), tannins (gallotannins, ellagitannins, tannins phức hợp, tannins ngưng tụ).
• Đặc tính của adenosine và cordycepin (9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl)adenin) trong nấm đông trùng hạ thảo: tác dụng điều biến miễn dịch hai chiều, điều hòa thụ thể adenosine A2A, ức chế phân bào của tế bào bất thường.
• Dược tính cổ truyền và hiện đại của 7 cây thuốc: Gấc chứa lycopene, β-carotene, vitamin E; Tam thất chứa ginsenosid Rg1 và Rg2; Đẳng sâm chứa polysaccharide và α-spinasterol; Trinh nữ hoàng cung chứa alkaloid, phenolic, crinafolin, crinafolidin; Linh chi chứa polysaccharide (β-D-glucan), triterpene (axit ganoderic); Diệp hạ châu đắng chứa lignan (phyllanthin, hypophyllanthin), flavonoid; Đông trùng hạ thảo loài Isaria cerambycidae Lưu et Đái (2009) phân lập từ ấu trùng xén tóc Batocera davidis có hàm lượng hoạt chất tương đương với Cordyceps sinensis nhưng giá thành thấp hơn.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án xác định: Mặc dù từng cây thuốc riêng lẻ đã có một số công trình khảo sát (như các sản phẩm CADEF, DAISVAN từ diệp hạ châu của Đái Duy Ban và cộng sự), nhưng chưa có nghiên cứu nào kết hợp đồng thời 7 vị dược liệu này thành một chế phẩm hoàn chỉnh, vừa xác lập quy trình bào chế chuẩn hóa, vừa kiểm chứng đầy đủ độc tính và tác dụng hỗ trợ miễn dịch trên nhiều mô hình động vật thực nghiệm (gà nhiễm Gumboro, tế bào nhiễm PRRS, chuột và thỏ thực nghiệm).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên cơ sở lý thuyết về miễn dịch học thực nghiệm (đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào) kết hợp với hóa sinh học các hợp chất thiên nhiên (phân tích định tính, định lượng các hợp chất chuyển hóa thứ sinh bằng phương pháp quang phổ và sắc ký).

Nguồn nguyên liệu 7 cây thuốc được thu thập theo Dược điển Việt Nam IV tại các địa phương:

STT	Tên cây thuốc	Tên khoa học	Bộ phận sử dụng	Khối lượng thu nhận (kg)	Địa điểm thu mẫu (xã, huyện, tỉnh)
1	Đẳng sâm	Codonopsis javanica	Củ	3,0	Lùng Phình, Na Hối, Nậm Mòn (Bắc Hà, Lào Cai)
2	Diệp hạ châu	Phyllanthus amarus	Toàn phần	3,0	Thạch Lâm, Thạch Yên, Thành Mỹ (Thạch Thành, Thanh Hóa)
3	Linh chi	Ganoderma lucidum	Toàn phần	1,5	Hào Lý, Tu Lý (Đà Bắc, Hòa Bình); Sủ Ngòi (TP. Hòa Bình)
4	Gấc	Momordica cochinchinensis	Màng áo hạt	1,5	Đồng Kỳ, Hồng Kỳ, An Thượng (Yên Thế, Bắc Giang)
5	Trinh nữ hoàng cung	Crinum latifolium	Thân, lá	1,5	Trưng Trắc, Tân Quang, Việt Hưng (Văn Lâm, Hưng Yên)
6	Tam thất	Panax pseudoginseng	Củ	1,5	Quan Thần Sán, Sán Chải, Si Ma Cai (Si Ma Cai, Lào Cai)
7	Đông trùng hạ thảo	Isaria cerambycidae	Toàn phần	0,15	Phú Lai, Yên Trị, Ngọc Lương (Yên Thủy, Hòa Bình)

Hệ thống thiết bị nghiên cứu chính bao gồm: Máy LC-MS Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems, máy đo mật độ quang học Bionate (Anh), máy đo pH Horiba (Nhật Bản), máy ly tâm Sigma 3K30 (Sartorius, Đức), kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản), tủ sấy và tủ ấm Memmert (Đức), box cấy vi sinh vật Aura vertical (Ý), cân phân tích Presica (Ý) và cân Kern (Đức).

Các phương pháp phân tích hóa sinh và hóa lý:

• Xác định carbohydrate tổng số: Thủy phân mẫu bằng axit sunfuric ($H_2SO_4$) đậm đặc, tạo phức màu với dung dịch phenol 5%, ủ ở 90°C trong 5 phút, đo độ hấp thụ quang học tại bước sóng 490 nm. Đường chuẩn glucose được xây dựng theo phương trình $Y = 0,006x + 0,085$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,993$.
• Xác định phenolic tổng số: Sử dụng thuốc thử Folin - Ciocalteu 10% và dung dịch natri cacbonat ($Na_2CO_3$) 6% theo phương pháp của Milan S. và cộng sự (2011), đo mật độ quang ở 490 nm, tính kết quả theo đương lượng axit gallic (mg GAE/g mẫu) với đường chuẩn đạt $R^2 = 0,999$.
• Xác định polysaccharide và α-spinasterol-3-O-β-D-glucopyranoside: Thực hiện theo phương pháp của Mythili Tummalapalli (2015).
• Định lượng saponin toàn phần: Chiết hồi lưu mẫu bột dược liệu khô bằng ethanol 70% trong 1 giờ cách thủy (lặp lại 2 lần), cô cắn, hòa vào nước rồi chiết phân đoạn với n-butanol bão hòa nước theo Qiu Y. và cộng sự (2014); làm bay hơi n-butanol và sấy cắn ở 105°C đến khối lượng không đổi.
• Xác định hàm lượng adenosine tổng số: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Lei Huang (2009), sử dụng hệ dung môi methanol/nước ($MeOH/H_2O$) gradient từ 8% đến 100% MeOH trong 30 phút, tốc độ dòng 0,5 mL/phút, bước sóng phát hiện UV 260 nm, thời gian lưu $R_t$ từ 13,8 đến 14,1 phút; xử lý tín hiệu bằng phần mềm ChemStation.
• Xác định hàm lượng cordycepin: Phương pháp sắc ký khối phổ LC-MS theo Liu X. và cộng sự, pha động gradient $MeOH/H_2O$ (8% A đến 100% A trong 30 phút), tốc độ 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 5 μL, bước sóng 260 nm, thời gian lưu $R_t$ từ 14,5 đến 14,8 phút.
• Xác định flavonoid: Phương pháp so màu sử dụng chất chuẩn catechin theo Saeed N. và cộng sự (2012).
• Thử nghiệm hoạt tính khử gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và kiểm tra hàm lượng kim loại nặng chì (Pb).

Thiết kế nghiên cứu trên động vật thực nghiệm:

• Thử nghiệm trên chuột nhắt trắng Swiss: Chuột có khối lượng 20 - 22 g do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp. Xác định độc tính cấp ($LD_{50}$) bằng cách chia 10 nhóm (mỗi nhóm 10 con), nhịn ăn 15 giờ; 1 nhóm chứng uống 0,4 mL dung dịch hồ tinh bột 2% (3 lần/ngày) và 9 nhóm thử uống bột Viên tăng sức đề kháng với các dải liều tăng dần: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 g/kg thể trọng; theo dõi lâm sàng và tỷ lệ chết trong 96 giờ.
• Thử nghiệm trên thỏ: Thỏ có khối lượng 2,2 - 2,4 kg (Trung tâm Chăn nuôi Thỏ Việt), chia thành 3 lô (mỗi lô 10 con). Lô A (đối chứng) uống nước muối sinh lý NaCl 0,9% liều 5 mL/kg/ngày; Lô B uống chế phẩm liều 0,12 g/kg/ngày (tương đương liều lâm sàng); Lô C uống chế phẩm liều 1,2 g/kg/ngày (gấp 10 lần liều lâm sàng). Thời gian thử nghiệm 4 tuần, đánh giá cân nặng, các chỉ số máu (AST, ALT, bilirubin, protein toàn phần, creatinin, hồng cầu, bạch cầu) và giải phẫu mô bệnh học gan, thận, lách.
• Thử nghiệm trên gà Lương Phượng: Gà 25 ngày tuổi khỏe mạnh, nuôi cách ly tại Đồng Mô (Ba Vì, Hà Nội). Sử dụng thức ăn chuẩn V5008 của Công ty Cổ phần Việt Pháp. Gây nhiễm virus cường độc Gumboro qua niêm mạc mắt, mũi, miệng (liều 0,3 mL dung dịch virus $\times$ 2 lần, cách nhau 3 giờ). Thử nghiệm tác dụng bảo vệ của thức ăn trộn Viên tăng sức đề kháng theo tỷ lệ 4:1 (40 kg thức ăn V5008 trộn 10 kg bột viên). Theo dõi triệu chứng 3 ngày, mổ khám tổn thương đại thể, xét nghiệm vi thể túi Fabricius, đo hiệu giá kháng thể trung hòa huyết thanh và phân tích các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu, protein huyết thanh).
• Thử nghiệm trên virus PRRS ở cấp độ tế bào: Đánh giá khả năng ức chế biểu hiện virus PRRS gây bệnh tai xanh ở lợn trên tế bào nuôi cấy tại các mốc thời gian 6 giờ, 28 giờ, 40 giờ và 56 giờ sau xử lý chế phẩm.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này cung cấp hệ thống lý luận về suy giảm miễn dịch bẩm sinh và mắc phải; mô tả cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào ở động vật có vú và gia cầm. Trọng tâm của chương phân tích vai trò cấu trúc của túi Fabricius trong việc sinh lympho B ở gia cầm và bệnh lý do virus Gumboro (IBDV) gây phá hủy cơ quan này. Đồng thời, chương trình bày chi tiết bệnh dịch tai xanh (PRRS) do virus tấn công đại thực bào phế nang lợn PAMs, tổng kết thực trạng đại dịch HIV/AIDS tại Việt Nam và trên thế giới. Phần cuối chương điểm luận các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ sinh (polyphenol, alkaloid, flavonoid, tanin, glycoside, saponin, adenosine, cordycepin) và tổng quan tri thức y học cổ truyền kết hợp nghiên cứu dược lý hiện đại của 7 cây thuốc: Gấc, Tam thất, Đẳng sâm, Trinh nữ hoàng cung, Linh chi, Diệp hạ châu và Đông trùng hạ thảo (Isaria cerambycidae).

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 trình bày chi tiết về nguồn gốc, địa điểm thu hái tại 21 xã thuộc 5 tỉnh miền Bắc và tiêu chuẩn phân loại kiểm nghiệm mẫu của 7 loại thảo dược theo Dược điển Việt Nam IV. Chương mô tả các tiêu chuẩn chọn lựa động vật thực nghiệm (gà giống Lương Phượng 25 ngày tuổi, thỏ 2,2 - 2,4 kg, chuột nhắt trắng dòng Swiss 20 - 22 g) và chủng virus cường độc Gumboro. Chương thiết lập quy trình định lượng hoạt chất sinh học bằng các kỹ thuật quang phổ hấp thụ phân tử, HPLC và LC-MS (bao gồm phương trình đường chuẩn glucose, đường chuẩn acid gallic, điều kiện rửa giải gradient cho adenosine và cordycepin). Toàn bộ sơ đồ thiết kế nghiên cứu thực nghiệm, phương pháp xử lý số liệu thống kê, quy trình kiểm soát kết quả xét nghiệm và các nguyên tắc đạo đức trong nghiên cứu động vật cũng được chuẩn hóa tại chương này.

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được của luận án:

1. Đánh giá hoạt chất sinh học và lựa chọn 7 cây thuốc: Kết quả phân tích định lượng xác định hàm lượng adenosine và cordycepin trong các mẫu đông trùng hạ thảo; phenolic tổng số trong trinh nữ hoàng cung; carbohydrate toàn phần trong linh chi; phenolic tổng số trong diệp hạ châu; α-spinasterol-3-O-β-D-glucopyranoside và polysaccharide trong đẳng sâm; ginsenosid Rg1 và Rg2 toàn phần trong tam thất; lycopene và β-carotene trong màng áo hạt gấc. Từ đó, tác giả lựa chọn được các mẫu nguyên liệu tối ưu tại các vùng sinh thái đạt tiêu chuẩn dược liệu.
2. Bào chế và chuẩn hóa Viên tăng sức đề kháng: Luận án tiến hành thử nghiệm tỷ lệ phối trộn từng cây thuốc thông qua đánh giá các chỉ số sinh học trên gà. Sau khi xác định tỷ lệ thích hợp cho từng thành phần (Đẳng sâm, Diệp hạ châu, Linh chi, Gấc, Trinh nữ hoàng cung, Tam thất, Đông trùng hạ thảo), tác giả xây dựng 2 quy trình bào chế (Phương pháp bào chế 1 và Phương pháp bào chế 2). Đánh giá kiểm nghiệm thành phẩm cho thấy chế phẩm có khả năng kháng vi sinh vật, có hoạt tính chống oxy hóa cao (thử nghiệm khử gốc tự do DPPH) và bảo toàn được các hoạt chất sinh học chính.
3. Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn:
   • Thử nghiệm độc tính cấp trên chuột nhắt trắng Swiss uống bột chế phẩm với các mức liều từ 2 đến 18 g/kg thể trọng cho thấy không xác định được liều gây chết 50% động vật ($LD_{50}$), chuột không có biểu hiện ngộ độc cấp tính, ăn uống và hoạt động bình thường trong 96 giờ theo dõi.
   • Thử nghiệm độc tính bán trường diễn cho thấy chế phẩm không làm ảnh hưởng xấu đến sự phát triển trọng lượng, các chỉ số huyết học (hồng cầu, bạch cầu) và chức năng gan thận (thể hiện qua các chỉ số hóa sinh và tiêu bản giải phẫu mô bệnh học thận chuột).
4. Tác dụng hỗ trợ miễn dịch trên mô hình gà Lương Phượng gây nhiễm virus Gumboro:
   • Các lô gà ăn thức ăn bổ sung Viên tăng sức đề kháng (tỷ lệ 4:1) có tỷ lệ biểu hiện triệu chứng lâm sàng giảm rõ rệt trong 3 ngày theo dõi so với lô đối chứng nhiễm bệnh không dùng thuốc.
   • Kết quả mổ khám đại thể và xét nghiệm vi thể cho thấy: Ở lô đối chứng bệnh, túi Fabricius sưng to, phù nề, xuất huyết cơ đùi và cơ lườn; ở các lô được ăn chế phẩm, túi Fabricius ít tổn thương, giữ được cấu trúc bình thường, mức độ hoại tử và xuất huyết giảm đáng kể.
   • Đo hiệu giá kháng thể qua phản ứng trung hòa huyết thanh cho thấy gà sử dụng chế phẩm duy trì được nồng độ kháng thể bảo hộ cao. Các chỉ số hồng cầu, bạch cầu và protein huyết thanh ở các lô thực nghiệm được phục hồi và duy trì ổn định hơn so với lô đối chứng bệnh.
5. Đánh giá trên virus PRRS ở cấp độ tế bào: Chế phẩm Viên tăng sức đề kháng thể hiện tác động ức chế rõ rệt đối với sự nhân lên và biểu hiện của virus PRRS (gây bệnh tai xanh ở lợn) trên tế bào nuôi cấy qua các thời điểm theo dõi 6 giờ, 28 giờ, 40 giờ và 56 giờ.
6. Đánh giá an toàn và tác động trên thỏ thực nghiệm: Thỏ uống chế phẩm ở liều lâm sàng (0,12 g/kg/ngày) và liều cao gấp 10 lần (1,2 g/kg/ngày) liên tục trong 4 tuần không có biến đổi bất thường về cân nặng. Các chỉ số hóa sinh chức năng gan (AST, ALT, bilirubin toàn phần), chức năng thận (ure, creatinin), protein huyết thanh và các chỉ số tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu) đều nằm trong giới hạn sinh lý bình thường, không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê so với lô đối chứng uống nước muối sinh lý NaCl 0,9%. Kết quả mô bệnh học khẳng định cấu trúc đại thể và vi thể của gan, thận, lách ở thỏ hoàn toàn bình thường.

Kết quả và những đóng góp mới

Các đóng góp mới về mặt khoa học của luận án:

• Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam xây dựng công thức và quy trình bào chế ra chế phẩm Viên tăng sức đề kháng phối hợp từ 7 cây thuốc: Linh chi, Đông trùng hạ thảo (Isaria cerambycidae), Đẳng sâm, Gấc, Trinh nữ hoàng cung, Tam thất và Diệp hạ châu, chuẩn hóa theo các tiêu chuẩn phân tích hoạt chất sinh học.
• Đây là công trình đầu tiên đánh giá một cách có hệ thống tác dụng hỗ trợ miễn dịch của chế phẩm phối hợp này trên nhiều mô hình động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải: mô hình gà Lương Phượng bị gây nhiễm virus cường độc Gumboro và thử nghiệm ức chế virus PRRS gây bệnh tai xanh ở cấp độ tế bào.
• Đã cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về độ an toàn sinh học (độc tính cấp, độc tính bán trường diễn, các chỉ số hóa sinh huyết học và mô bệnh học gan, thận, lách) trên chuột nhắt trắng Swiss và thỏ, làm cơ sở khoa học để chế phẩm được Bộ Y tế cấp phép dưới dạng thực phẩm chức năng.

Các kiến nghị và giải pháp đề xuất từ luận án:

• Ứng dụng Viên tăng sức đề kháng trong chăn nuôi thú y nhằm hỗ trợ phòng ngừa và giảm thiểu tổn thương do bệnh suy giảm miễn dịch Gumboro trên gia cầm và hội chứng tai xanh do virus PRRS trên lợn.
• Đề xuất ứng dụng chế phẩm trong hỗ trợ nâng cao thể trạng, cải thiện các chỉ số hóa sinh và miễn dịch cho bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS), cũng như hỗ trợ tăng cường sức khỏe cho người cao tuổi, người có thể trạng suy nhược.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi thu hái nguồn dược liệu mới tập trung tại một số vùng chuyên canh thuộc 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam, chưa tiến hành so sánh đối chiếu biến thiên hàm lượng hoạt chất sinh học của các loài cây thuốc này tại các vùng địa lý, thổ nhưỡng khác ở miền Trung và miền Nam.
• Khảo sát tác động ức chế virus PRRS mới được thực hiện ở quy mô in vitro trên mô hình tế bào nuôi cấy, chưa tiến hành thử nghiệm lâm sàng trực tiếp trên đàn lợn nhiễm bệnh trong điều kiện trang trại thực tế.
• Các khảo sát liên quan đến bệnh nhân HIV/AIDS mới dừng lại ở phạm vi số liệu dịch tễ học và định hướng ứng dụng lâm sàng ban đầu tại Trung tâm Y tế quận Tây Hồ, chưa công bố số liệu thử nghiệm can thiệp mù đôi có đối chứng trên người trong khuôn khổ văn bản luận án.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Triển khai thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu lực phòng ngừa và hỗ trợ điều trị của Viên tăng sức đề kháng trực tiếp trên đàn lợn thực nghiệm bị gây nhiễm hoặc phơi nhiễm tự nhiên với virus PRRS.
• Mở rộng nghiên cứu lâm sàng quy chuẩn trên các nhóm bệnh nhân suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS) và bệnh nhân sau điều trị hóa xạ trị ung thư để làm rõ cơ chế tác động điều biến miễn dịch ở người.
• Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất và sản xuất chế phẩm ở quy mô công nghiệp.

Giá trị tham khảo

Nghiên cứu có giá trị tham khảo cụ thể đối với các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Hóa sinh học, Sinh học thực nghiệm, Dược liệu học và Thú y học: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về phương pháp định lượng các hoạt chất thứ sinh phức tạp (adenosine, cordycepin, ginsenosid, α-spinasterol, polyphenol) bằng kỹ thuật HPLC, LC-MS và phương pháp đo quang.
• Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm về quy trình phối trộn, kiểm nghiệm an toàn độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và kiểm soát chất lượng thực phẩm bảo vệ sức khỏe từ thảo dược.
• Cán bộ thú y và người chăn nuôi gia cầm, gia súc: Cung cấp giải pháp kỹ thuật sử dụng thảo dược phối trộn thức ăn để giảm thiểu tổn thương túi Fabricius và hạn chế tác hại của bệnh Gumboro trên đàn gà nuôi.

Các phần đáng giá tham khảo nhất trong luận án gồm: Quy trình định lượng đồng thời adenosine và cordycepin trên hệ thống HPLC/LC-MS (Chương 2); Thiết kế mô hình gây nhiễm virus Gumboro cường độc trên gà Lương Phượng để đánh giá chức năng bảo vệ miễn dịch qua các chỉ số mô bệnh học và hiệu giá kháng thể (Chương 2 và Chương 3).

Câu hỏi thường gặp

1. Bảy loại thảo dược được sử dụng trong luận án gồm những cây nào và nguồn gốc thu mẫu ở đâu? Bảy loại thảo dược gồm: Đẳng sâm thu tại Bắc Hà (Lào Cai); Diệp hạ châu đắng thu tại Thạch Thành (Thanh Hóa); Linh chi thu tại Đà Bắc và TP. Hòa Bình (Hòa Bình); Gấc lấy màng áo hạt thu tại Yên Thế (Bắc Giang); Trinh nữ hoàng cung thu tại Văn Lâm (Hưng Yên); Tam thất thu tại Si Ma Cai (Lào Cai); và Đông trùng hạ thảo (Isaria cerambycidae) thu tại Yên Thủy (Hòa Bình).

2. Hoạt chất adenosine và cordycepin trong đông trùng hạ thảo được phân tích bằng kỹ thuật nào? Adenosine được định lượng bằng hệ thống HPLC với bước sóng phát hiện UV 260 nm, thời gian lưu $R_t$ từ 13,8 đến 14,1 phút. Cordycepin được phân tích trên hệ thống sắc ký khối phổ LC-MS Agilent 1260, pha động gradient methanol/nước từ 8% đến 100% MeOH trong 30 phút, bước sóng UV 260 nm, thời gian lưu $R_t$ từ 14,5 đến 14,8 phút.

3. Thử nghiệm độc tính cấp ($LD_{50}$) của Viên tăng sức đề kháng trên chuột nhắt trắng Swiss cho kết quả ra sao? Thử nghiệm trên 10 nhóm chuột (9 nhóm uống chế phẩm liều từ 2 g/kg đến 18 g/kg thể trọng và 1 nhóm đối chứng uống hồ tinh bột 2%) trong 96 giờ cho thấy không có chuột nào bị chết ở tất cả các mức liều. Do đó không xác định được giá trị $LD_{50}$, chứng minh chế phẩm có độ an toàn cao khi sử dụng đường uống.

4. Viên tăng sức đề kháng thể hiện tác dụng gì trên gà Lương Phượng bị gây nhiễm virus Gumboro? Gà được ăn thức ăn trộn chế phẩm theo tỷ lệ 4:1 (thức ăn V5008 : viên bột) có tỷ lệ biểu hiện triệu chứng bệnh thấp hơn, giảm tổn thương xuất huyết cơ đùi và cơ lườn, ngăn ngừa hiện tượng teo và hoại tử cấu trúc vi thể của túi Fabricius, đồng thời duy trì hiệu giá kháng thể trung hòa và ổn định các chỉ số hồng cầu, bạch cầu so với lô đối chứng nhiễm bệnh.

5. Thử nghiệm dùng Viên tăng sức đề kháng liên tục 4 tuần trên thỏ có gây hại cho gan và thận không? Kết quả theo dõi trên thỏ uống liều 0,12 g/kg/ngày (liều lâm sàng) và 1,2 g/kg/ngày (gấp 10 lần liều lâm sàng) trong 4 tuần cho thấy các chỉ số sinh hóa máu (AST, ALT, bilirubin, protein toàn phần, creatinin, ure) và huyết học đều nằm trong giới hạn sinh lý bình thường. Hình ảnh giải phẫu đại thể và vi thể mô bệnh học gan, thận và lách của thỏ hoàn toàn bình thường, không ghi nhận tổn thương thoái hóa hay hoại tử mô.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Việt Phương đã giải quyết đồng bộ từ việc khảo sát, định lượng hoạt chất sinh học của 7 cây thuốc Việt Nam đến thiết lập quy trình bào chế thành công chế phẩm Viên tăng sức đề kháng đạt tiêu chuẩn thực phẩm chức năng được Bộ Y tế cấp phép. Các thử nghiệm sinh học khẳng định chế phẩm có độ an toàn cao, không gây độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên chuột và thỏ thực nghiệm. Đặc biệt, nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả hỗ trợ miễn dịch rõ rệt của chế phẩm thông qua việc bảo vệ cấu trúc túi Fabricius, duy trì hiệu giá kháng thể ở gà Lương Phượng nhiễm virus Gumboro và ức chế sự biểu hiện của virus PRRS ở cấp độ tế bào. Công trình cung cấp cơ sở khoa học và thực tiễn vững chắc cho việc ứng dụng thảo dược Việt Nam trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng và nâng cao sức đề kháng trong chăn nuôi thú y.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Việt Nam là nƣớc nhiệt đới có đặc điểm thổ nhƣỡng, khí hậu địa lý với nhiều đặc trƣng khác nhau, có hệ thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng trong đó gồm rất nhiều loài cây thuốc chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao [10]. Từ ngàn xƣa, cộng đồng các dân tộc trên đất nƣớc ta cũng có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe. Trên thế giới, Việt Nam đƣợc đánh giá là nƣớc có nền y học cổ truyền, lâu đời và ngƣời dân biết cách áp dụng nhiều loại cây thuốc để bồi bổ, nâng cao thể trạng cơ thể, hỗ trợ và điều trị bệnh ở vật nuôi cũng nhƣ hỗ trợ sức khỏe ở ngƣời [3, 5].

Tại Việt Nam các công trình nghiên cứu về nhiều cây thuốc để bào chế ra một chế phẩm mới có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng, hỗ trợ miễn dịch, đƣợc kiểm chứng thông qua đánh giá một vài chỉ số hoá sinh, huyết học, miễn dịch, tế bào, giải phẫu bệnh và mô tả khả năng kích thích miễn dịch ở động vật thực nghiệm cũng nhƣ trên ngƣời còn rất ít, tản mạn bởi nhiều lý do khách quan cũng nhƣ chủ quan [11, 25, 33]. Có nhiều mô hình gây suy giảm miễn dịch mắc phải ở động vật thực nghiệm đƣợc sử dụng tại Việt Nam và các nƣớc trên thế giới. Tuy nhiên, thƣờng sử dụng gà bị gây nhiễm virus là mô hình phổ biến, trong đó virus Gumboro là virus gây bệnh mạnh nhất. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (bệnh lợn tai xanh) thƣờng đƣợc nhắc tới trong những nghiên cứu về suy giảm miễn dịch mắc phải ở lợn [32].

Gà nhiễm virus Gumboro (còn gọi bệnh Sida gà) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ yếu ở gà. Bệnh có đặc điểm là gây viêm túi Fabricius, xuất huyết cơ ngực, cơ đùi, làm hoại tử thận và đặc biệt làm suy giảm hệ thống miễn dịch hoặc mất khả năng đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin phòng các bệnh, gà bệnh dễ bị nhiễm các bệnh truyền nhiễm khác. Bệnh thƣờng xảy ra khi gà ở giai đoạn từ 3 - 6 tuần tuổi, tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên đến 100% và tỷ lệ chết từ 20 - 50%. Tại Việt Nam hiện nay chƣa có một sản phẩm nào đƣợc bào chế từ cây thuốc đƣợc thử nghiệm, ứng dụng phòng, điều trị Gumboro hiệu quả [6, 31].

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn PRRS (Porcine Reproductive & Respiratory Syndrome) còn gọi là bệnh Tai xanh là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây nên, bệnh có tính chất lây lan nhanh, tăng nguy cơ chết nhiều lợn, phát bệnh đồng thời với những bệnh khác. Đặc điểm của bệnh là gây sảy thai, thai chết lƣu ở lợn. Lợn ốm có triệu chứng điển hình sốt cao trên 40°C, viêm phổi nặng, đặc 1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] biệt là gặp nhiều ở lợn con cai sữa. Khi bệnh xảy ra thƣờng gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngƣời chăn nuôi [18, 28].

Các bệnh liên quan đến suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời đƣợc cả thế giới nghiên cứu, quan tâm hiện này là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời - AIDS, do virus HIV gây ra. Trên thế giới, theo báo cáo của chƣơng trình phối hợp liên hợp quốc về HIV/AIDS, đến cuối năm 2015 thế giới đã có 35 triệu ngƣời nhiễm HIV, 1,5 triệu ngƣời chết do AIDS và 119 quốc gia đã báo cáo kết quả có ngƣời nhiễm HIV, thực tế con số này có thể cao hơn [12, 20]. Tại Việt Nam, đến hết năm 2015 đã phát hiện 10.195 trƣờng hợp nhiễm mới HIV, số bệnh nhân chuyển sang AIDS là 6130, tử vong do AIDS 2130 trƣờng hợp. Tính đến cuối năm 2015 cả nƣớc hiện có 227.154 trƣờng hợp nhiễm HIV còn sống và ƣớc tính hiện có khoảng 254.000 ngƣời nhiễm HIV trong cộng đồng [9].

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn đã nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu 7 cây thuốc Việt Nam có tác dụng hỗ trợ miễn dịch ở động vật thực nghiệm”. MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN - Bào chế đƣợc Viên tăng sức đề kháng cơ thể từ 7 cây thuốc Việt Nam. - Mô tả tác động của Viên tăng sức đề kháng trên động vật thực nghiệm. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN - Khảo sát, chọn lọc thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu ở Việt Nam tại những vùng chuyên canh cây thuốc.

- Lựa chọn tỷ lệ phối trộn phù hợp từ 7 cây thuốc Việt Nam để bào chế Viên tăng sức đề kháng có hoạt chất sinh học, an toàn trong sử dụng. - Đánh giá mức độ an toàn của Viên tăng sức đề kháng là thực phẩm chức năng đƣợc Bộ Y tế cấp phép. - Nghiên cứu, đánh giá tác động của Viên tăng sức đề kháng trên các đối tƣợng động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam bào chế đƣợc chế phẩm mới là Viên tăng sức đề kháng từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu đạt tiêu chuẩn chất lƣợng thực phẩm chức năng, đƣợc cấp phép của Bộ Y tế.

2 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên đánh giá tác động hỗ trợ miễn dịch của Viên tăng sức đề kháng trên một số nhóm động vật thực nghiệm bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN Về khoa học Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo đƣợc Viên tăng sức đề kháng có nguồn gốc từ 7 cây thuốc gồm: Linh chi, đông trùng hạ thảo, đẳng sâm, gấc, trinh nữ hoàng cung, tam thất và diệp hạ châu từ những vùng cây thuốc của Việt Nam. Đánh giá đƣợc tác động hỗ trợ miễn dịch sau khi sử dụng chế phẩm trên gà bị gây suy giảm miễn dịch mắc phải bằng virus Gumboro, tác động ở cấp độ tế bào lên virus gây bệnh tai xanh ở lợn. Thử nghiệm an toàn trên chuột, thỏ đƣợc Bộ Y Tế cấp phép là thực phẩm chức năng.

Về ý nghĩa thực tiễn Ứng dụng Viên tăng sức đề kháng trong phòng, điều trị, hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm miễn dịch mắc phải ở gia cầm, lợn. Ứng dụng Viên tăng sức đề kháng hỗ trợ điều trị, tăng cƣờng sức khỏe cho bệnh nhân HIV/AIDS cũng nhƣ phòng, hỗ trợ sức khỏe cho ngƣời già, ngƣời cao tuổi không bị nhiễm HIV/AIDS, ngƣời có thể trạng yếu. LUẬN ÁN ĐƢỢC THỰC HIỆN TẠI Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trung tâm Công nghệ Hóa sinh Ứng dụng; Trung tâm Chăm sóc Ban ngày (nay là Khoa kiểm soát dịch bệnh, HIV/AIDS) - Trung tâm Y tế quận Tây Hồ - TP. Hà Nội; Viện Thú y Trung ƣơng; Viện Dƣợc liệu Trung ƣơng; Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam; Bệnh viện Nhiệt đới Trung ƣơng; Trung tâm Xét nghiệm - 35 Nguyễn Ngọc Vũ, phƣờng Trung Hòa, quận Cầu Giấy, TP.

3 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH MIỄN DỊCH Miễn dịch (hay miễn nhiễm) là tập hợp các cơ chế sinh học giúp cho một cơ thể đa bào giữ đƣợc sự liên kết giữa các tế bào và các mô, đảm bảo sự toàn vẹn của cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hƣ hỏng cũng nhƣ các chất và sinh vật xâm hại. Đáp ứng miễn dịch là một hiện tƣợng phức tạp nhƣng là một trong những cách giúp cơ thể ngƣời và động vật tránh các tác nhân gây bệnh trong và ngoài cơ thể.

Bệnh do suy giảm miễn dịch mắc phải gồm 2 loại: suy giảm miễn dịch bẩm sinh và suy giảm miễn dịch mắc phải [29, 51]. Suy giảm miễn dịch bẩm sinh Suy giảm miễn dịch bẩm sinh là do những bất thƣờng của vật chất di truyền. Dựa vào nguồn gốc và vị trí tổn thƣơng của các tế bào miễn dịch ngƣời ta phân loại suy giảm miễn dịch (hình 1. Sơ đồ biệt hóa và vị trí tổn thƣơng các tế bào miễn dịch [123] (1) Suy giảm miễn dịch ngay từ các tế bào gốc chung cho cả 2 dòng tế bào B và T nên đƣợc gọi là suy giảm miễn dịch nặng phối hợp.

(2) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng T gồm 2 loại: Tổn thƣơng tế bào T và rối loạn hoạt hóa của các tế bào T đã trƣởng thành. (3) Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng B gồm 2 loại: Tổn thƣơng tế bào B và rối loạn quá trình biệt hóa của tế bào B để sản xuất kháng thể dịch thể. 4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] - Suy giảm miễn dịch bẩm sinh dòng tế bào thực bào (liên quan đến cả sự trình diện kháng nguyên) và sản xuất bổ thể [29, 123]. Suy giảm miễn dịch mắc phải Dựa vào nguyên nhân gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch ngƣời ta chia ra một số nhóm chính sau: Suy giảm miễn dịch do suy dinh dƣỡng, do nhiễm vi sinh vật: Nhiễm vi khuẩn, nấm, kí sinh trùng, vi rút; Do bệnh lý: Gồm các bệnh mạn tính kéo dài, đặc biệt là bệnh ung thƣ.

Suy giảm miễn dịch do phóng xạ; Do thuốc hoặc hóa chất, cũng có thể do tuổi già, chấn thƣơng [37]. - Đặc biệt suy giảm miễn dịch do nhiễm virus HIV ở ngƣời [44], nhiễm virus Gumboro ở gà hay hội chứng dịch bệnh tai xanh (ở lợn) [58]. Đây cũng là mô hình suy giảm miễn dịch ở động vật và ngƣời thƣờng đƣợc nghiên cứu với các loại thuốc điều trị khác nhau. Để đáp ứng lại việc suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời và động vật có các cơ chế đáp ứng lại với sự tham gia của các tế bào khác nhau gồm: Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào là đáp ứng chống các kháng nguyên gắn trên bề mặt tế bào hoặc là thành phần của tế bào, đó là những tế bào nhiễm virus hoặc tế bào ung thƣ có 2 loại: Miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu.

Cả hai loại đáp ứng này đều cần có sự tham gia của nhiều loại tế bào khác nhau và các tế bào cũng hỗ trợ lẫn nhau trong việc đáp ứng lại các tác nhân gây bệnh [92, 95].