LỜI MỞ ĐẦU Trong các nghiên cứu y dược hiện đại các hợp chất thiên nhiên từ các cây thuốc bao gồm các flavonoit, tecpenoit và ancoloit tiếp tục là nguồn cung cấp các hợp chất có tiềm năng cho các thử nghiệm hoạt tính sinh học. (Asteraceae) là cây thuốc dùng phổ biến trong Y học cổ truyền Việt Nam và một số nước trên thế giới. Các nghiên cứu hóa học các loài Eclipta prostrata của Trung Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ đã xác định được các nhóm hợp chất tritecpen (oleanan và taraxastan) glycozit, các flavonoit, các coumarin, các ancaloit-steroit và các thiophen polyacetylen trong các bộ phận của cây Eclipta prostrata. Dựa trên các kiến thức dược lý học dân tộc và các hoạt tính sinh học của các phần chiết nhiều hoạt chất có tác dụng chống ung thư, kháng viêm và chống HIV của các chất được phân lập từ Eclipta prostrata đã được phát hiện.
Sự đa dạng về các nhóm cấu trúc lý thú của Eclipta prostrata, sự tương quan của các cấu trúc này với nhiều hoạt tính sinh học quan trọng và ý nghĩa khoa học và thực tiễn của việc đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) của Việt Nam đã thúc đẩy chúng tôi tiếp tục nghiên cứu một cách hệ thống về hóa thực vật của cây Cỏ mực. Luận văn này đặt mục tiêu nghiên cứu phân lập sắc ký và xác định cấu trúc các thành phần hóa học đặc biệt là các hợp chất phân cực từ phần trên mặt đất của cây Cỏ mực của Việt Nam. Các kết quả nghiên cứu theo hướng này sẽ là các bước đầu tiên trong các chương trình hiện đại hóa Y học cổ truyền Việt Nam. Các hợp chất phân cực chưa được xác định trong một số nghiên cứu trước đã được phân lập trong nghiên cứu này sử dụng các phương pháp sắc ký hiện đại.
9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1. Khái quát về Eclipta prostrata L. Đặc điểm thực vật [1] Họ Cúc (danh pháp khoa học: Asteraceae hay Compositae), còn gọi là họ Hướng dương, họ Cúc tây, là một họ thực vật có hoa hai lá mầm. Họ Asteraceae phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới.
Các chi trong họ này được chia thành 13 tông. Chỉ có một trong số 13 tông này là Lactuceae, có thể là có đủ khác biệt để có thể coi là một phân họ (phân họ Cichorioideae), các tông còn lại, phần lớn là chồng ghép lẫn nhau, được đưa vào phân họ Asteroideae. Các loài thuộc về họ Cúc có các đặc trưng sau: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính, tức là với các nhị hoa kết hợp lại với nhau tại các gờ của chúng bởi các bao phấn, tạo thành ống, bầu nhụy với sự phân bổ cơ bản của các noãn hoa, các noãn hoa trên một bầu nhụy, mào lông (chùm lông trên quả), quả là loại quả bế (tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khi chín).), họ Cúc (Asteraceae), có tên thông dụng ở Việt Nam là Cỏ mực, Cỏ nhọ nồi, Nhọ nồi, hạn liên thảo, mặc hạn liên, kim lăng thảo. Hình 1: Cây Cỏ mực (Eclipta prostrata L., Asteraceae) 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cỏ mực thuộc loại cây thân thảo hằng niên, cao từ 10-60 cm, mọc bò hoặc có khi gần như thẳng đứng, có lông trắng, cứng, thưa.
Thân màu lục hay màu nâu nhạt hay hơi đỏ tía. Lá mọc đối, phiến lá dài và hẹp cỡ 2,5 1,2 cm. Mép lá nguyên hay có răng cưa cạn, hai mặt đều có lông. Hoa trắng tập hợp thành đầu ở nách lá hay đầu cành, các hoa cái hình lưỡi ở ngoài, các hoa lưỡng tính hình ống ở giữa.
Qủa bế dẹt có 3 cạnh, có cánh dài 3 mm. Vùng phân bố của cây Cỏ mực trên thế giới khá rộng vì nó là loài cây nhiệt đới, mọc hoang ở chỗ ẩm mát. Ứng dụng trong Y học cổ truyền Việt Nam [1] Cỏ mực được dùng để điều trị các bệnh như: nôn ra máu từ dạ dày, chảy máu cam, đái ra máu, xuất huyết tử cung, viêm gan mãn tính, viêm ruột, lỵ, trẻ em suy dinh dưỡng, ù tai, rụng tóc do đẻ non, suy nhược thần kinh, nấm da, ezecma, vết loét, bị thương, chảy máu, viêm da. Ngoài ra Cỏ mực còn được dùng làm thuốc sát trùng trong bệnh ho lao, viêm cổ họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấm ngoài da gây rụng tóc.
Cách dùng: dùng tươi hay giã lấy nước uống, hoặc sao cháy đen với liều 15- 30 g sắc uống. Dùng riêng hoặc phối hợp với ngó sen, lá trắc bá. Trong trường hợp sát trùng cũng dùng sắc uống hoặc giã tươi lấy nước uống, bã đắp. Có thể dùng tươi xoa tay chữa rát do vôi, chữa nấm ngoài da và nhuộm tóc có màu tím đen.
Viện chống lao Trung ương và Bệnh viện lao K71 đã pha chế thành thuốc tiêm cầm máu, tiêm bắp thịt, mỗi ngày 1-3 ống (2 ml). Có nơi đã sản xuất thành công dạng cao nén thành viên dùng cầm máu. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Eclipta prostrata Năm 1966: F. Bolhman và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã phân lập từ lá khô Eclipta alba 2 dẫn xuất thiophen 1 và 2 và polyacetylen 3 [5].
H3C-C C (C C)2 CH=CH2 S 1 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com C C-CH=CH2 CH3- (C C)5-CH=CH2 S S 2 3 Sau đó năm 1966, N. Krishnaswamy và cộng sự (Đại học Delhi, Ấn Độ) đã xác định được cấu trúc của một polythienyl, α-terthienyl methanol (4) từ Eclipta alba [5]. Sing và cộng sự (Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin, Đức) đã phân lập được một thành phần dithienyl acetylen (5) từ rễ và phần trên mặt đất cây Eclipta erecta (một tên gọi khác của Eclipta prostrata) [10]. ValH2C C CCH2CH2OVal S S 5 Phân tách sắc kí cột phần trên mặt đất và rễ cây Eclipta erecta cho một hợp chất dithienyl acetylen, 5-isovalennyloxymetylen-2-(4-isovalennyloxy-but-3-inyl) dithiophen (6) và 5-angeloyloxy-methylen-2-(but-3-en-1-ynyl)-dithiophen (7); stigmasterol (8) và sitosterol (9) là các thành phần từ phần trên mặt đất [8].
Premila đã phân lập từ Eclipta alba wedelolacton (10), norwedelolacton (11) và axit norwedelic (axit 5,6-dihydroxy- 2(2,4,6-trihydroxyphenyl)-benzofuran-3-carboxylic) (12) [4]. O HO COOH R2O OH O HO O R2O O HO OH R1 O OR2 10 R1=Me, R2=H 12 11 R1=R2=H 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. O O O-CH2 C C-CH-CH2-O S S 13 Năm 1997: S. Yahara và cộng sự (Đại học Kumamoto, Nhật Bản) đã phân lập từ cây khô Eclipta alba ở Trung Quốc bốn taraxastan triterpen glycozit, các eclalbasaponin VII-IX (14-17) cùng với các eclalbasaponin I-VI.
Cấu trúc của các eclalbasaponin đã xác định được là 3β,20β,16β- và 3β,20β,28-trihydroxytaraxastan glycozit và các saponin sulfat của chúng [15]. OH OH H H OH H H OH HO HO O O O O OH OH OH OH OR OR 14 R=H 15 R=H 16 R=SO3H 17 R=SO3 Năm 1998: M. Kader và cộng sự (Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần chiết metanol Eclipta alba tám hoạt chất ancaloit có khung steroit 18-25. Ancaloid chính được phân lập là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22(N)- dien-3β-ol (verazin, 20); và các hợp chất khác là 20-epi-3-dehydro-4,5- dehydroverazin (18), 20-epi-verazin (19), ecliptabin (21), 20-epi-4β-hydroxyverazin (22), 4β-hydroxylverazin (23), 20-epi-25β-hydroxyverazin (24) và 25β- hydroxyverazin (25) [3].
13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com HO N N HO 18 21 R2 R2 N N HO HO R1 R1 19 R1=R2=H 20 R1=R2=H 22 R1=OH, R2=H 23 R1=OH, R2=H 24 R1=H, R2=OH 25 R1=H, R2=OH Năm 2008: M. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã phân lập được một flavonoit, diosmetin (26) và hai isoflavonoit, 3- hydroxybiochanin (27) và 3-O-methylorobol (28) từ phần chiết metanol Eclipta prostrata [7] OH OH HO O HO O R1 OH O R2 OH O 26 27 R1=OH, R2=OCH3 28 R1=OCH3, R2=OH 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Lee và cộng sự (Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã phân lập từ dịch chiết metanol phần trên mặt đất của Eclipta prostrata năm oleanan tritecpenoit, axit echinocystic (29) và các dẫn xuất glycozit của 29, eclalbasaponin I (30), eclalbasaponin II (31), eclalbasaponin III (32) và eclalbasaponin V (33) [6]. H3C CH3 H3C CH3 COOR2 CH3 CH3 CH3 CH3 COOH OH CH3 OH CH3 O HO CH3 HO H3C H3C CH3 O HO HO R1O 29 30 R1=H, R2=GlC 31 R1=H, R2=H 32 R1=GlC, R2=GlC 33 R1=SO3, R2=H Năm 2011: Sáu hợp chất đã được S.
Tewtrakul và cộng sự (Đại học Prince of Songkla, Thái Lan) phân lập từ Eclipta prostrata là 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)- terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl angelat (35), 5- hydroxymethyl-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và wedelolacton (39) [13]. O O CH3 S S S S S S O CH3 O CH3 CH3 34 35 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com O S S S S S S CHO O CH3 36 37 O HO HO O O OH HO O OH O HO OCH3 OH 38 39 1.3 Hoạt tính sinh học của Eclipta prostrata và các hợp chất thành phần 1.1 Hoạt tính ức chế HIV-1 của các terthienyl, orobol và wedelolacton Sáu hợp chất đã được phân lập từ phần chiết toàn cây Eclipta prostrata trong một nghiên cứu phân lập theo định hướng hoạt tính sinh học trong thử nghiệm ức chế enzym HIV-1 integrase (IN) [12]. Các hợp chất này đã được xác định là 5- hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl tiglat (34), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)- terthyenyl angelat (35), 5-hydroxymethy-(2,2:5,2)-terthyenyl acetat (36), ecliptat (37), orobol (38) và wedelolacton (39). Wedelolacton (39) đã được xác định là có hoạt tính mạnh nhất đối với HIV-1 IN với IC50 là 4,0 ± 0,2 µm, tiếp đó là hợp chất 38 (IC50 = 8,1 ± 0,5 µm), các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính với IC50 > 100 µm.
Đối với hoạt tính ức chế HIV-1 protease (PR) hợp chất 34 thể hiện hoạt tính chống lại HIV-1 PR với IC50 = 58,3 ± 0.8 µm, hợp chất 37 (IC50 = 83,3 ± 1.6 µm) và hợp chất 36 (IC50 = 93,7 ± 0,8 µm) trong khi các hợp chất 33, 38 và 39 không thể hiện hoạt tính (IC50 > 100 µm). Các tác dụng ức chế HIV-1 IN của wedelolacton, một dẫn xuất coumarin và orobol, một dẫn xuất isoflavon là các hoạt tính đáng chú ý của nghiên cứu này. 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.2 Hoạt tính kháng viêm của các terthienyl, orobol và wedelolacton Phần chiết toàn cây Eclipta prostrata và các hợp chất terthienyl, 5- hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl tiglat (34), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)- terthienyl angelat (35), 5-hydroxymethyl-(2,2´:5´,2´´)-terthienyl acetat (36), ecliptal (37) cùng với falvonoit orobol (38) và coumestan wedelolacton (39) được phân lập từ cây này đã được thử nghiệm hoạt tính kháng viêm trong nghiên cứu ức chế sự sản sinh nitơ oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) và TNF-α trong các tế bào RAW264.7 gây bởi lipopolisaccarit (LPS) [13]. Orobol (38) đã được phát hiện là có hoạt tính mạnh nhất với NO ở IC50 = 4,6 µm, các hợp chất 34, 35 và 37 cho các giá trị IC50 lần lượt là 12,7, 14,9 và 19,1 µm.