Tổng quan luận án

Theo số liệu từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2020), ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc mới không ngừng gia tăng. Trong hơn nửa thế kỷ qua, các sản phẩm tự nhiên với sự đa dạng về thành phần và cấu trúc hóa học đã được nghiên cứu rộng rãi nhằm tìm kiếm các hoạt chất kháng ung thư tiềm năng. Ước tính từ năm 1981 đến năm 2019, khoảng 25% các loại thuốc kháng ung thư mới được phê duyệt có nguồn gốc từ tự nhiên. Trong số các nguồn dược liệu tự nhiên, chi Cordyceps và Isaria thuộc họ Clavicipitaceae và Cordycipitaceae chứa hơn 200 hợp chất có hoạt tính sinh học đã được cô lập và định danh, bao gồm nucleosid, sterol, peptid mạch vòng, flavonoid, dihydrobenzofuran, polyketid, polysaccharid, alkaloid, ergosterol và polyphenol.

Mặc dù chi Cordyceps có hơn 750 loài với phổ ký chủ rộng trên côn trùng và động vật chân khớp, phần lớn các nghiên cứu và ứng dụng thương mại trước đây chỉ tập trung vào một số ít loài như Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris. Hơn nữa, hầu hết các công trình tại Việt Nam sử dụng các chủng giống nhập nội hoặc chỉ dừng lại ở việc khảo sát hoạt tính sinh học trên các mẫu cao chiết thô. Các nghiên cứu chuyên sâu về nuôi cấy nhân tạo các chủng bản địa, chiết phân đoạn, cô lập hoạt chất tinh khiết và đánh giá cơ chế kháng phân bào ở mức độ tế bào đối với các chủng nấm thu thập tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Để giải quyết khoảng trống này, luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (Mã số: 9420201) của nghiên cứu sinh Nguyễn Chí Dũng với đề tài "Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004" được thực hiện với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể:

  1. Thiết lập quy trình nuôi trồng nhân tạo để thu nhận sinh khối và quả thể của hai chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004.
  2. Tạo các phân đoạn cao chiết từ sinh khối hệ sợi và quả thể của hai chủng nấm bằng hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
  3. Sàng lọc và đánh giá độc tính tế bào in vitro của các phân đoạn cao chiết trên hai dòng tế bào ung thư người: ung thư vú MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) và ung thư bạch cầu dòng tế bào T Jurkat T.
  4. Xác nhận đặc tính kháng phân bào và cơ chế cảm ứng apoptosis của các cao chiết tiềm năng thông qua khảo sát hình thái tế bào, phân tích chu kỳ tế bào và đo dòng chảy tế bào (flow cytometry).
  5. Cô lập, tinh sạch, giải mã cấu trúc hóa học của hợp chất có hoạt tính từ phân đoạn cao chiết tiềm năng và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào cũng như cơ chế cảm ứng apoptosis của hợp chất sạch thu được.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài gồm:

  • Chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004: thu nhận từ vùng núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam (phân lập, định danh phân tử và cung cấp bởi TS. Trương Bình Nguyên, Trường Đại học Đà Lạt).
  • Chủng nấm Isaria cicadae F0004: thu nhận tại thị trấn EaKnop, huyện Ea Kar, tỉnh Đắk Lắk, Việt Nam (cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Ứng dụng sinh học).
  • Dòng tế bào thử nghiệm: Tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư bạch cầu Jurkat T.

Phạm vi nghiên cứu: Nuôi cấy nhân tạo sinh khối và quả thể tại phòng thí nghiệm Sinh hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; phân tích hóa học, đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM; đánh giá hoạt tính sinh học in vitro tại TP. Hồ Chí Minh, hoàn thành năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Về hệ thống phân loại học, theo Holiday (2008) và Kobayasi (1982), chi Cordyceps thuộc ngành Ascomycota, phân ngành Pezizomycotina, lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae. Đến năm 2007 và 2010, các phân tích phát sinh loài dựa trên vùng ribosome DNA của Sung và cộng sự đã sắp xếp lại nhóm nấm này thành ba họ chính: họ Clavicipitaceae (gồm các chi Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella, Torrubiella), họ Cordycipitaceae (gồm chi Cordyceps, Isaria, Beauveria) và họ Ophiocordycipitaceae (gồm chi Ophiocordyceps, Elaphocordyceps). Chi Isaria được xác định là giai đoạn sinh sản vô tính (thể anamorph) của chi Cordyceps.

Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Cordyceps:

  • Nhóm polysaccharid: Chiếm 10–20% trọng lượng khô ở mẫu tự nhiên và lên tới 50% ở mẫu nuôi cấy nhân tạo. Polysaccharid của C. sinensis và C. militaris tồn tại chủ yếu ở cấu trúc xoắn ba (triple right-handed helix), cấu tạo từ mannose, galactose, glucose cùng một lượng nhỏ arabinose, rhamnose và xylose với khối lượng phân tử dao động từ 7 đến 2260 kDa. Polysaccharid ngoại bào (EPS) và phân đoạn EPSF đã được chứng minh có khả năng kích thích hệ miễn dịch, tăng thực bào của đại thực bào, gia tăng biểu hiện cytokine TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$, IL-1, IL-2 và ức chế các oncogene như c-Myc, c-Fos.
  • Nhóm nucleosid: Tiêu biểu là cordycepin (3'-deoxyadenosine) và các dẫn xuất như adenosine, hydroxyethyl adenosine, cordycepin triphosphate, forodesin. Cordycepin ức chế quá trình tổng hợp RNA do làm gián đoạn chuỗi kéo dài của RNA polymerase, ức chế enzyme ribonucleoside triphosphate (rNTP), can thiệp vào con đường tín hiệu Wnt, ức chế phosphoryl hóa Akt và p38, kích hoạt caspase-3, 7, 9 và gây dừng chu kỳ tế bào ở pha G1, G2/M hoặc làm tăng pha sub-G1 dẫn đến apoptosis.
  • Nhóm sterol: Bao gồm ergosterol (tiền chất vitamin D2), $\beta$-sitosterol, daucosterol, campesterol, ergosterol peroxide và hợp chất H1-A. Các sterol này thể hiện khả năng ức chế chọn lọc sự tăng sinh tế bào ung thư và điều hòa miễn dịch.
  • Nhóm peptid và các hợp chất khác: Dipeptid vòng (cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro]), cordycedipeptide A, cordymin, myriocin (chất ức chế miễn dịch mạnh), D-mannitol (acid cordycepic chiếm 10–14%), oosporein, hercynine, ergothioneine và fumimycin.

Đối với hai loài được chọn trong luận án:

  • Isaria cicadae (Cordyceps cicadae): Đã có hơn 110 hợp chất được phân lập trên thế giới, bao gồm inositol, gamma-aminobutyric acid (GABA), ornithine, threonine, adenosine, ergosterol peroxide, beauvericin, oosporein và myriocin. Các nghiên cứu của Zhu và cộng sự (2020) cùng Ren và cộng sự (2014) chỉ ra rằng polysaccharid từ I. cicadae có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, gia tăng biểu hiện enzyme catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD1), glutathione peroxidase (GSH-Px) và kéo dài tuổi thọ sinh vật mô hình. Cao chiết ethanol của I. cicadae kích hoạt apoptosis qua con đường ty thể và lưới nội chất, làm tăng Ca$^{2+}$ nội bào và bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha S.
  • Cordyceps neovolkiana (giai đoạn vô tính là Hirsutella neovolkiana): Loài này được phát hiện tại vùng núi Langbiang (Lâm Đồng) ở độ cao 1.500 m. Nghiên cứu của Sangeetha (2017) ghi nhận phổ $^1$H-NMR của dịch chiết có tín hiệu carbon anomeric ở 3,4 ppm tương đồng với cordycepin chuẩn. Tuy nhiên, các nghiên cứu chuyên sâu về phân lập hợp chất và khảo sát hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư của loài này trước thời điểm luận án thực hiện còn rất hạn chế.

Về tình hình nuôi cấy trong nước: Các tác giả Lê Tấn Hưng và cộng sự (2010), Phạm Quang Thu (2009), Trương Bình Nguyên và Đinh Minh Hiệp (2015) đã thực hiện các nghiên cứu nuôi cấy nhân tạo sinh khối C. militaris, C. sinensis và C. takaomontana DL0038A.

Vị trí của luận án: Luận án là công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên tại Việt Nam kết hợp đồng thời quy trình nuôi cấy nhân tạo (sinh khối và quả thể), chiết tách phân đoạn, sàng lọc độc tính tế bào trên hai dòng tế bào ung thư (MCF-7 và Jurkat T), định danh hợp chất tinh sạch bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và làm sáng tỏ cơ chế cảm ứng chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao chiết cũng như hợp chất cô lập từ hai chủng bản địa C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

1. Quy trình nuôi cấy nhân tạo sinh khối và quả thể

Quy trình nhân giống và nuôi trồng được thực hiện qua các cấp:

  • Giống cấp 1: Nuôi cấy trên môi trường thạch PGA trong đĩa petri, khử trùng 121°C trong 15 phút, ủ ở 20 ± 2°C trong 15 ngày cho đến khi hệ sợi lan đều.
  • Giống cấp 2: Nuôi cấy trong môi trường lỏng PG chứa trong chai thủy tinh 250 mL, khử trùng 121°C trong 20 phút, ủ ở 20 ± 2°C trong 7 ngày.
  • Môi trường nuôi sinh khối hệ sợi (môi trường lỏng): Thành phần gồm dịch nấu khoai tây (200 g/L), saccharose (50 g/L), peptone (6 g/L), cao nấm men (4 g/L), KH$_2$PO$_4$ (0,5 g/L), MgSO$_4$ (0,2 g/L), nước cất định mức 1 lít. Khử trùng môi trường, cấy giống cấp 2 và thu hoạch sinh khối sau 40 ngày nuôi cấy.
  • Môi trường nuôi quả thể (môi trường bán rắn): Thành phần gồm gạo (28,5 g/hộp), kê (9,5 g/hộp), nhộng tằm (2 g/hộp), glucose (40 g/L), peptone (5 g/L), KH$_2$PO$_4$ (1,5 g/L), MgSO$_4$ (1,5 g/L). Sau khi cấy 5–7 mL giống cấp 2, ủ tối trong 15 ngày để phát triển hệ sợi, sau đó chuyển ra điều kiện chiếu sáng để kích thích hình thành quả thể và thu hoạch sau 45 ngày.

2. Phương pháp chiết xuất và phân đoạn cao chiết

Quy trình chiết xuất dựa trên phương pháp của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007):

  • Chiết ngấm kiệt thu cao tổng: Nguyên liệu khô xay nhỏ được ngâm chiết ngấm kiệt với ethanol 96% theo tỷ lệ 1:10 (g/mL) trong 24 giờ và 48 giờ. Dịch chiết được thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ dưới 50°C để thu cao tổng ethanol (Et).
  • Thu nhận cao polysaccharid:
    • Cao polysaccharid nội bào (Poly): Bã sau chiết ethanol được ngâm dầm với nước cất ở 60–70°C (tỷ lệ 1:1) trong 2 giờ, cô đặc dịch chiết còn 1/10 thể tích rồi tủa với ethanol 96% lạnh (tỷ lệ 1 dịch : 4 ethanol) trong 24 giờ ở 4°C, ly tâm và sấy khô.
    • Cao polysaccharid ngoại bào (EPS): Dịch nuôi cấy sinh khối được lọc bỏ cặn, cô quay ở 60°C còn 1/10 thể tích, tủa bằng ethanol 96% lạnh (tỷ lệ 1:4) ở 4°C trong 24 giờ, ly tâm thu tủa và sấy ở 50°C.
  • Chiết phân đoạn lỏng – lỏng: Cao tổng ethanol được hòa tan trong nước cất (tỷ lệ 1:1) và tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm Petroleum ether (PE), Ethyl acetate (EA), n-Butanol (Bu) và phân đoạn nước còn lại (W).

Công thức tính hiệu suất chiết cao tổng ($H$): $$H = \frac{M_{\text{cao}} \times \text{độ ẩm cao}}{M_{\text{nguyên liệu}} \times \text{độ ẩm nguyên liệu}} \times 100%$$

Công thức tính hiệu suất chiết cao phân đoạn ($H_{\text{pđ}}$): $$H_{\text{pđ}} = \frac{M_{\text{cao phân đoạn}} \times D}{M_{\text{nguyên liệu}} \times d} \times \frac{\text{khối lượng cao tổng}}{\text{khối lượng cao tổng chiết phân đoạn}} \times 100%$$ (Trong đó: $D$ là độ ẩm cao chiết %, $d$ là độ ẩm nguyên liệu %)

3. Phương pháp cô lập và xác định cấu trúc hóa học

  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn pha tĩnh silica gel Kieselgel Merck 60 F$_{254}$ (độ dày 175–225 $\mu$m). Phát hiện vết chất dưới đèn UV bước sóng 254 nm và phun thuốc thử vanillin/H$_2$SO$_4$, sấy nhiệt độ 105°C.
  • Sắc ký cột hấp phụ (CC): Sử dụng pha tĩnh silica gel 230–400 mesh (37–63 $\mu$m) với tỷ lệ chất hấp phụ gấp 25–50 lần (hoặc 100–200 lần đối với chất khó tách) so với khối lượng mẫu; tỷ lệ chiều cao chất hấp phụ : đường kính cột là 10:1. Hệ dung môi giải ly được tối ưu hóa dựa trên chỉ số $R_f$ từ TLC ($R_f$ mục tiêu từ 0,3–0,6).
  • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Đo phổ $^1$H-NMR (500 MHz) và $^{13}$C-NMR (125 MHz) trên thiết bị Bruker Avance tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM. Mẫu được hòa tan trong dung môi deuterated (độ tinh khiết 99,5%). Dữ liệu phổ được xử lý và phân tích cấu trúc bằng phần mềm MestReNova 11.0.

4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

  • Môi trường nuôi cấy tế bào: Tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T được duy trì trong môi trường E'MEM bổ sung L-glutamin (2 mM), NaHCO$_3$ (0,225%), HEPES (20 mM), amphotericin-B (0,025 $\mu$g/mL), penicillin G (100 UI/mL), streptomycin (100 $\mu$g/mL), phenol red (8 mg/L) và 10% huyết thanh thai bò (FBS).
  • Thử nghiệm độc tính tế bào: Đánh giá tỷ lệ ức chế sinh trưởng và xác định giá trị IC$_{50}$ ($\mu$g/mL) trên máy đọc ELISA reader Biotek.
  • Khảo sát apoptosis bằng nhuộm huỳnh quang kép AO/EB: Nhuộm tế bào bằng Acridine Orange (AO) và Ethidium Bromide (EB) để quan sát sự biến đổi hình thái nhân và màng tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.
  • Phân tích chu kỳ tế bào và định lượng apoptosis: Sử dụng phương pháp đo dòng chảy tế bào trên hệ thống BD Accuri C6 Plus flow cytometer kết hợp bộ kit nhuộm Annexin V-FITC/PI (BD Pharmingen™, mã số 556570) và nhuộm Propidium Iodide (PI) để xác định tỷ lệ tế bào ở các pha G0/G1, S, G2/M, sub-G1 cũng như tỷ lệ tế bào chết theo apoptosis giai đoạn sớm và muộn.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học về vị trí phân loại học, đặc điểm sinh thái, giá trị kinh tế và thành phần hóa thực vật của chi Cordyceps và Isaria. Nội dung tập trung phân tích sâu các nhóm hoạt chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị sinh học cao (cordycepin, adenosine, heteropolysaccharide cấu trúc xoắn ba, dipeptide vòng, sterol tự do và dẫn xuất). Chương này cũng tổng kết các bằng chứng thực nghiệm về cơ chế kháng phân bào của chi nấm này thông qua các con đường: hoạt hóa miễn dịch (kích thích đại thực bào, gia tăng giải phóng TNF-$\alpha$, IFN-$\gamma$), kích hoạt chuỗi caspase (caspase-3, 8, 9), điều hòa biểu hiện các protein kiểm soát apoptosis (Bcl-2, Bax, p53, p21) và ức chế các enzyme liên quan đến khối u (telomerase hTERT, Akt, MMP2). Đồng thời, chương 1 điểm lại các thành tựu nuôi cấy nấm Cordyceps trên thế giới và tại Việt Nam, qua đó xác lập tính cấp thiết của việc nghiên cứu hai chủng bản địa C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004.

Chương 2: Vật liệu và Phương pháp

Chương 2 trình bày chi tiết về nguồn gốc mẫu nấm, quy trình nuôi cấy bán rắn và nuôi cấy lỏng để thu nhận quả thể và sinh khối hệ sợi. Chương này mô tả toàn bộ quy trình công nghệ chiết xuất phân đoạn lỏng – lỏng (PE, EA, Bu, W), quy trình tách chiết polysaccharide nội bào (Poly) và ngoại bào (EPS). Đồng thời, chương 2 thiết lập các thông số kỹ thuật cho hệ thống sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng, các phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân $^1$H-NMR (500 MHz) và $^{13}$C-NMR (125 MHz). Toàn bộ quy trình thử nghiệm độc tính tế bào in vitro, phương pháp nhuộm huỳnh quang AO/EB, quy trình phân tích chu kỳ tế bào và đo dòng chảy tế bào Annexin V/PI trên máy BD Accuri C6 Plus cũng được quy chuẩn hóa chi tiết.

Chương 3: Kết quả và Thảo luận

Chương 3 tập hợp toàn bộ các số liệu thực nghiệm thu được từ quá trình chiết tách, sàng lọc sinh học, tinh sạch và định danh hoạt chất:

1. Hiệu suất thu nhận các phân đoạn cao chiết

Quá trình chiết xuất phân đoạn từ sinh khối (SK) và quả thể (QT) của C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 thu được các phân đoạn cao chiết với hiệu suất trung bình được ghi nhận tại Bảng 3.1 của luận án.

Bảng 3.1. Hiệu suất chiết cao trung bình từ sinh khối và quả thể nấm C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 (Đơn vị: %)

Loại cao chiết / Phân đoạn Sinh khối C. neovolkiana DL0004 Quả thể C. neovolkiana DL0004 Sinh khối I. cicadae F0004 Quả thể I. cicadae F0004
Cao tổng Ethanol (Et) Có Có Có Có
Cao Petroleum ether (PE) Có Có Có Có
Cao Ethyl acetate (EA) Có Có Có Có
Cao n-Butanol (Bu) Có Có Có Có
Cao Nước (W) Có Có Có Có
Cao Polysaccharide (Poly) Có Có Có Có
Cao Polysaccharide ngoại bào (EPS) Có - Có -

2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn cao chiết

Khảo sát sàng lọc độc tính tế bào tại nồng độ 100 $\mu$g/mL và xác định giá trị IC$_{50}$ trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T (Bảng 3.2):

  • Đối với C. neovolkiana DL0004: Phân đoạn cao PE chiết xuất từ sinh khối hệ sợi thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng mạnh nhất trên cả hai dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T.
  • Đối với I. cicadae F0004: Phân đoạn cao EA thu nhận từ quả thể thể hiện hoạt tính gây độc tế bào vượt trội so với các phân đoạn khác trên cả hai dòng tế bào thử nghiệm.

Bảng 3.2. Giá trị IC$_{50}$ ($\mu$g/mL) của các cao chiết từ sinh khối và quả thể nấm C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 gây độc tế bào MCF-7 và Jurkat T

Mẫu cao chiết Tế bào ung thư vú MCF-7 Tế bào ung thư bạch cầu Jurkat T
Cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004 Xác định giá trị IC$_{50}$ tiềm năng Xác định giá trị IC$_{50}$ tiềm năng
Cao EA quả thể I. cicadae F0004 Xác định giá trị IC$_{50}$ tiềm năng Xác định giá trị IC$_{50}$ tiềm năng
Các phân đoạn cao chiết khác (Et, Bu, W, Poly, EPS) Hoạt tính ức chế thấp hơn Hoạt tính ức chế thấp hơn

3. Cơ chế cảm ứng Apoptosis của các cao chiết tiềm năng

  • Nhuộm huỳnh quang kép AO/EB: Tế bào MCF-7 và Jurkat T sau khi xử lý với cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004 hoặc cao EA quả thể I. cicadae F0004 xuất hiện các biến đổi hình thái đặc trưng của apoptosis như màng tế bào co cụm, chất nhiễm sắc cô đặc, nhân phân mảnh và phát huỳnh quang màu cam/đỏ của EB thâm nhập.
  • Phân tích chu kỳ tế bào (Flow Cytometry): Các cao chiết tiềm năng làm thay đổi rõ rệt phân bố tế bào ở các pha, làm tăng tỷ lệ tế bào tích tụ tại pha sub-G1 (đại diện cho các mảnh vỡ DNA của tế bào chết theo apoptosis) và làm dừng chu kỳ tế bào ở các pha kiểm soát.
  • Định lượng Apoptosis bằng Annexin V/PI: Nhuộm kép Annexin V-FITC/PI chứng minh tỷ lệ tế bào chuyển dịch rõ rệt từ trạng thái sống sang apoptosis giai đoạn sớm (Annexin V$^+$/PI$^-$) và apoptosis giai đoạn muộn (Annexin V$^+$/PI$^+$).

4. Phân chất, định danh hợp chất và thử nghiệm hoạt tính

  • Từ phân đoạn cao PE của sinh khối C. neovolkiana DL0004, tiến hành sắc ký cột hấp phụ nhiều lần kết hợp kiểm tra TLC và sàng lọc độc tính tế bào đã cô lập và định danh được hợp chất steroid tinh khiết là ergone (ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one) dựa trên phân tích dữ liệu phổ $^1$H-NMR (500 MHz) và $^{13}$C-NMR (125 MHz) bằng phần mềm MestReNova 11.0.
  • Tương tự, phân chất cao EA của quả thể I. cicadae F0004 đã thu nhận được các phân đoạn hợp chất sạch.
  • Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập (Bảng 3.3): Hợp chất ergone ở nồng độ 100 $\mu$g/mL thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng mạnh trên cả hai dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T.
  • Khảo sát cơ chế của ergone: Kết quả nhuộm AO/EB, phân tích chu kỳ tế bào và đo dòng chảy Annexin V/PI khẳng định ergone gây độc tế bào thông qua cơ chế kích hoạt con đường chết rụng tế bào apoptosis và gây tích lũy tế bào tại pha sub-G1.

Bảng 3.3. Kết quả gây độc tế bào của một số hợp chất cô lập được từ C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 nhân tạo tại nồng độ 100 $\mu$g/mL

Hợp chất cô lập Nguồn gốc phân lập Độc tính trên tế bào MCF-7 Độc tính trên tế bào Jurkat T
Ergone Cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004 Ức chế mạnh sinh trưởng tế bào Ức chế mạnh sinh trưởng tế bào
Các hợp chất khác Phân đoạn cao chiết tiềm năng Ghi nhận hoạt tính theo thử nghiệm Ghi nhận hoạt tính theo thử nghiệm

Kết quả và những đóng góp mới

1. Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

  • Cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chủng nấm ký sinh côn trùng bản địa Cordyceps neovolkiana DL0004 phân lập tại núi Langbiang (Lâm Đồng) và Isaria cicadae F0004 phân lập tại Ea Kar (Đắk Lắk).
  • Chứng minh sinh khối hệ sợi và quả thể nhân nuôi của hai chủng nấm này chứa các hợp chất có khả năng kháng phân bào và làm sáng tỏ cơ chế tác động lên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và ung thư bạch cầu Jurkat T là thông qua con đường cảm ứng apoptosis và biến đổi chu kỳ tế bào.
  • Lần đầu tiên cô lập, xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ergone từ cao PE sinh khối hệ sợi Cordyceps neovolkiana DL0004 và xác nhận hoạt tính gây độc tế bào cũng như cơ chế cảm ứng apoptosis trực tiếp của hợp chất này trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn

  • Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nuôi cấy nhân tạo hai giai đoạn (trên môi trường lỏng để thu nhận sinh khối hệ sợi và môi trường bán rắn để thu nhận quả thể) cho hai chủng nấm bản địa có giá trị dược liệu.
  • Thiết lập quy trình chiết xuất phân đoạn có định hướng hoạt tính sinh học (bioassay-guided fractionation), xác định rõ cao PE từ sinh khối C. neovolkiana DL0004 và cao EA từ quả thể I. cicadae F0004 là các phân đoạn giàu hoạt tính kháng ung thư nhất.
  • Tạo tiền đề khoa học cho việc chủ động sản xuất nguồn nguyên liệu sinh học trong nước phục vụ nghiên cứu và phát triển các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị ung thư từ nguồn nấm dược liệu Việt Nam.

3. Kiến nghị đề xuất

  • Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa quy trình nuôi cấy ở quy mô pilot nhằm nâng cao sinh khối và hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học (đặc biệt là ergone và các hợp chất sterol, nucleoside).
  • Tiếp tục phân lập và giải mã cấu trúc của các hợp chất khác hiện diện trong phân đoạn cao EA từ quả thể Isaria cicadae F0004.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên phạm vi và nội dung thực nghiệm được trình bày trong văn bản:

  • Phạm vi đánh giá hoạt tính sinh học trong luận án mới dừng lại ở mức độ thử nghiệm in vitro trên hai dòng tế bào ung thư (MCF-7 và Jurkat T), chưa tiến hành khảo sát trên các mô hình động vật in vivo.
  • Luận án tập trung phân chất sâu và làm sáng tỏ cơ chế cảm ứng apoptosis đối với hợp chất chính là ergone tách từ phân đoạn cao PE sinh khối C. neovolkiana DL0004; các hợp chất thứ cấp khác trong phân đoạn cao EA của quả thể I. cicadae F0004 cần được mở rộng tinh sạch và kiểm tra hoạt tính độc lập.
  • Hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất bao gồm:
    1. Mở rộng đánh giá độc tính và hiệu quả ức chế khối u của cao chiết tiềm năng và hợp chất ergone trên mô hình chuột mang khối u thực nghiệm in vivo.
    2. Đi sâu phân tích các con đường truyền tín hiệu nội bào và sự biến đổi của các protein liên quan (như caspase-3/8/9, Bax, Bcl-2, PARP) bằng kỹ thuật Western Blot hoặc Real-time PCR để chi tiết hóa cơ chế phân tử.
    3. Khảo sát độc tính bán trường diễn và độc tính cấp của các chế phẩm cao chiết trên động vật thực nghiệm nhằm xác định liều lượng an toàn cho ứng dụng dược dụng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo có giá trị chuyên môn cao đối với các đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các ngành Công nghệ sinh học, Hóa hợp chất thiên nhiên, Dược học và Sinh học thực nghiệm: Tham khảo quy trình phân lập, nuôi cấy nấm dược liệu ký sinh côn trùng, phương pháp chiết xuất phân đoạn lỏng – lỏng, kỹ thuật sắc ký cột silica gel và phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân ($^1$H-NMR, $^{13}$C-NMR).
  • Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các trường đại học, viện nghiên cứu: Sử dụng làm tài liệu tham khảo trong giảng dạy các chuyên đề về sàng lọc hoạt tính sinh học in vitro, đánh giá cơ chế chết tế bào apoptosis bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang AO/EB và phân tích dòng chảy tế bào (Flow Cytometry).
  • Các đơn vị sản xuất và doanh nghiệp dược liệu: Ứng dụng quy trình công nghệ nuôi cấy sinh khối và quả thể hai chủng nấm C. neovolkiana DL0004 và I. cicadae F0004 vào thực tiễn sản xuất nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu trên những chủng nấm và dòng tế bào ung thư cụ thể nào?

Luận án thực hiện nghiên cứu trên hai chủng nấm ký sinh côn trùng thu thập tại Việt Nam là Cordyceps neovolkiana DL0004 (nguồn gốc núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng) và Isaria cicadae F0004 (nguồn gốc huyện Ea Kar, tỉnh Đắk Lắk). Hai dòng tế bào ung thư người được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng phân bào là tế bào ung thư vú MCF-7 (Michigan Cancer Foundation-7) và tế bào ung thư bạch cầu Jurkat T.

2. Các phân đoạn cao chiết nào thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao nhất trong nghiên cứu?

Kết quả sàng lọc độc tính tế bào cho thấy:

  • Phân đoạn cao Petroleum ether (PE) chiết xuất từ sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 thể hiện độc tính tế bào và ức chế sinh trưởng mạnh nhất trên cả hai dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T.
  • Phân đoạn cao Ethyl acetate (EA) thu nhận từ quả thể nấm Isaria cicadae F0004 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao nhất trong số các phân đoạn của chủng I. cicadae.

3. Hợp chất tinh khiết nào đã được cô lập và xác định cấu trúc từ cao chiết tiềm năng?

Từ phân đoạn cao PE của sinh khối hệ sợi Cordyceps neovolkiana DL0004, luận án đã cô lập được hợp chất steroid sạch là ergone (ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one). Cấu trúc của ergone được xác định thông qua phổ $^1$H-NMR (500 MHz) và $^{13}$C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker Avance và xử lý bằng phần mềm MestReNova 11.0.

4. Bằng chứng nào chứng minh cao chiết và hoạt chất ergone tiêu diệt tế bào ung thư thông qua cơ chế apoptosis?

Cơ chế cảm ứng apoptosis được xác nhận qua ba nhóm bằng chứng thực nghiệm:

  • Hình thái tế bào nhuộm huỳnh quang AO/EB: Xuất hiện hiện tượng co cụm tế bào, chất nhiễm sắc cô đặc, nhân phân mảnh và phát huỳnh quang màu cam/đỏ.
  • Phân tích chu kỳ tế bào bằng Flow Cytometry: Ghi nhận sự tích lũy đáng kể của quần thể tế bào ở pha sub-G1 (đặc trưng cho sự đứt gãy phân mảnh DNA trong apoptosis).
  • Định lượng tế bào chết bằng nhuộm Annexin V-FITC/PI: Ghi nhận sự gia tăng tỷ lệ phần trăm tế bào ở các góc phần tư tương ứng với apoptosis giai đoạn sớm (Annexin V$^+$/PI$^-$) và apoptosis giai đoạn muộn (Annexin V$^+$/PI$^+$).

5. Thành phần môi trường nuôi cấy sinh khối và quả thể của hai chủng nấm gồm những gì?

  • Môi trường nuôi sinh khối lỏng: Dịch nấu khoai tây (200 g/L), saccharose (50 g/L), peptone (6 g/L), cao nấm men (4 g/L), KH$_2$PO$_4$ (0,5 g/L), MgSO$_4$ (0,2 g/L), nuôi trong 40 ngày.
  • Môi trường nuôi quả thể bán rắn: Gạo (28,5 g/hộp), kê (9,5 g/hộp), nhộng tằm (2 g/hộp), glucose (40 g/L), peptone (5 g/L), KH$_2$PO$_4$ (1,5 g/L), MgSO$_4$ (1,5 g/L), ủ tối 15 ngày rồi chiếu sáng kích thích phát triển quả thể và thu hoạch sau 45 ngày.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của nghiên cứu sinh Nguyễn Chí Dũng đã xây dựng thành công quy trình nuôi cấy nhân tạo thu nhận sinh khối và quả thể của hai chủng nấm dược liệu bản địa Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004. Nghiên cứu đã xác định được phân đoạn cao PE sinh khối C. neovolkiana và cao EA quả thể I. cicadae có hoạt tính kháng phân bào vượt trội trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Đồng thời, công trình đã cô lập, giải mã cấu trúc hợp chất ergone từ sinh khối C. neovolkiana và chứng minh cơ chế gây độc tế bào của cao chiết cũng như hợp chất sạch thông qua con đường cảm ứng apoptosis và bắt giữ chu kỳ tế bào. Kết quả luận án cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc bảo tồn, khai thác và phát triển các chế phẩm dược liệu từ nấm ký sinh côn trùng tại Việt Nam.