Nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào của nấm Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae trên tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ NẤM CORDYCEPS

1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps

1.2. Tổng quan về Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae

2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.2. Đối tượng nghiên cứu

2.3. Dụng cụ và thiết bị

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp thu nhận cao chiết và các hợp chất

2.4.2. Phương pháp khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và cảm ứng apoptosis của cao chiết và các hợp chất

2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Chiết cao từ sinh khối và quả thể C. neovolkiana DL0004 và I.

3.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết với dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T

3.2.1. Hoạt tính gây độc của các cao chiết C. neovolkiana DL0004 đối với các dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T

3.2.2. Hoạt tính gây độc của các cao chiết I. cicadae F0004 đối với các dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T

3.3. Xác định cao chiết có khả năng gây độc tế bào cao

3.4. Nghiên cứu cảm ứng apoptosis tế bào MCF-7 và Jurkat T với các cao chiết tiềm năng

3.4.1. Nghiên cứu cao PE của sinh khối Cordyceps neovolkiana DL0004 cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T

3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng cảm ứng apoptosis của cao EA từ quả thể I.

3.5. Phân chất, tinh sạch và định danh các hợp chất của các cao chiết có tiềm năng kháng phân bào

3.5.1. Phân chất cao PE của sinh khối C.

3.5.2. Phân chất cao EA của quả thể Isaria cicadae F0004

3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T của các chất

3.7. Kết quả khả năng cảm ứng apoptosis tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T của ergone

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

I. Tổng Quan Nấm Cordyceps Bí Quyết Kháng Ung Thư Tiềm Năng

Các sản phẩm tự nhiên, với sự đa dạng về thành phần và cấu trúc hóa học, đã được nghiên cứu rộng rãi về khả năng kháng ung thư trong hơn nửa thế kỷ gần đây. Chúng được xem là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất có hoạt tính sinh học có tiềm năng chữa bệnh. Ước tính từ năm 1981 đến năm 2019, khoảng 25% các loại thuốc kháng ung thư mới được phê duyệt có nguồn gốc tự nhiên. Đối với Cordyceps spp., hơn 200 hợp chất có hoạt tính sinh học đã được cô lập và định danh, bao gồm nucleosid, sterol, peptid mạch vòng, flavonoid, dihydrobenzofuran, polyketid, polysaccharid, alkaloid, ergosterol và polyphenol. Theo tổ chức WHO (2020), ung thư là căn bệnh gây tử vong hàng đầu trên thế giới và tỷ lệ ngày càng tăng nhanh, do đó việc tìm kiếm các hợp chất mới trong điều trị ung thư được nhiều nghiên cứu trên thế giới quan tâm.

1.1. Phân Loại Khoa Học Chi Tiết Về Nấm Cordyceps

Theo Holiday (2008), nấm Cordyceps được phân loại như sau: Giới: Fungi; Ngành: Ascomycota; Lớp: Ascomycetes; Bộ: Hypocreales; Họ: Clavicipitaceae; Chi: Cordyceps. Cordyceps được xếp vào họ Clavicipitaceae dựa vào túi bào tử hình trụ, độ dày đỉnh nang và các nang bào tử. Đặc biệt, Cordyceps được đặc trưng bởi quả thể hình cuống và thường ở dạng hình chuỳ trên bề mặt hay đắm mình hoàn toàn vào chất nền. Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lượng loài và phổ ký chủ. Phổ ký chủ của chúng rất rộng, thường thuộc nhóm côn trùng và động vật thuộc lớp chân khớp. Mỗi loài được giới hạn với một vật chủ duy nhất hay một tập hợp các ký chủ có mối liên hệ chặt chẽ với nhau.

1.2. Cordyceps Sinensis và Các Loài Cordyceps Quý Hiếm Khác

Trong các loài Cordyceps spp., sinensis là nổi tiếng nhất về giá trị ứng dụng chữa bệnh, bồi bổ sức khỏe con người và nó phân bố chủ yếu ở Nepal, Bhutan, Ấn Độ và Cao nguyên Tây Tạng của Trung Quốc, độ cao từ 3000 m – 5000 m so với mực nước biển. Bên cạnh sinensis, nhiều loài nấm Cordyceps spp. khác cũng được phát hiện: Họ Clavicipitaceae gồm có Metacordyceps liangshanensis, phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và Nepal. Họ Cordycipitaceae gồm có Cordyceps coccinea (Được phát hiện tại: Indonesia, Srilanka, Nhật Bản, Công Gô và Nepal), C. Họ Ophiocordycipitaceae gồm có Ophiocordyceps fornicarum (Được phát hiện tại: Nhật Bản, Nepal, Hàn Quốc và Trung Quốc), O.

II. Cordyceps Neovolkiana Isaria Cicadae Tổng Quan Chi Tiết

Hiện nay, các nghiên cứu đã phát hiện nhiều hợp chất kháng phân bào tiềm năng đối với các dòng tế bào ung thư từ Cordyceps spp. như cordycepin, cordypyridon, cordysinin A, isariotin, acetoxyscirpenediol, polysaccharid, beauvericin, ergosterol… và các dẫn xuất. Cordyceps là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae về số lượng loài (hơn 750 loài) và phổ ký chủ. Tuy nhiên, chỉ có 04 loài thuộc chi Cordyceps và Isaria được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi bao gồm C. Các công trình nghiên cứu và ứng dụng nấm Cordyceps chủ yếu được thực hiện trên các chủng nấm được phân lập và có nguồn gốc từ nước ngoài nên hướng ứng dụng thực tế có nhiều hạn chế khi ứng dụng tại Việt Nam.

2.1. Phân Loại Khoa Học Của Cordyceps Neovolkiana

Theo hệ thống phân loại của Kobayasi (1982), Cordyceps neovolkiana thuộc: Ngành (phylum): Ascomycota; Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina; Lớp (class): Sordariomycetes; Bộ (odor): Hypocreales; Họ (familia): Clavicipitaceae; Chi: Cordyceps. Cordyceps neovolkiana (thể vô tính là Hirsutella neovolkiana) đã được tìm thấy ở vùng núi Langbiang, tỉnh Lâm Đồng Việt Nam ở độ cao 1. Về đặc điểm sinh thái, quả thể C. neovolkiana có màu vàng rộng 2-3 mm và dài 3-5 cm.

2.2. Phân Loại Khoa Học Của Isaria Cicadae

Theo Sung (2007), Isaria cicadae thuộc: Giới (Kingdom): Fungi; Ngành (phylum): Ascomycota; Phân ngành (subphylum): Pezizomycotina; Lớp (class): Sordariomycetes; Bộ (odor): Hypocreales; Họ (familia): Cordycipitaceae; Chi: Isaria. Isaria cicadae (Cordyceps cicadae) đã được tìm thấy tại huyện Ea kar, tỉnh Đắk Lắk, quá trình sinh trưởng và phát triển của I. cicadae tương tự với các loài thuộc nhóm Cordyceps khác: vào mùa thu hay mùa đông bào tử nấm sẽ lây nhiễm vật chủ qua lớp da ngoài (lớp cuticun), hình thành sợi tơ khắp cơ thể côn trùng dẫn đến gây chết côn trùng, đến mùa xuân khi khí hậu ấm hơn sẽ hình thành nên quả thể nấm từ các khớp hoặc các vị trí nếp da mỏng và phát tán bào tử.

2.3. Isaria Cicadae Dược Liệu Quý Trong Y Học Cổ Truyền

Isaria cicadae là một trong những loại thuốc y học cổ truyền Trung Quốc lâu đời nhất và nổi tiếng, với những công dụng của nó được ghi nhận từ thế kỷ thứ V. Trong nhiều thế kỷ, I. cicadae đã được sử dụng làm thực phẩm, thuốc bổ và thuốc dân gian để điều trị bệnh sốt rét, ung thư, sốt, tiểu đường, các bệnh về mắt, chóng mặt và các bệnh thận mãn tính. Hơn 110 hợp chất được phân lập từ I. cicadae, dựa vào cấu trúc các hợp chất thuộc các nhóm chính amino acid, acid hữu cơ, lipid, phosphoslipid, nucleosid, carbohidrate và các dẫn xuất của chúng.

III. Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Phân Bào Hướng Đi Mới

Việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng nấm Cordyceps của Việt Nam, được phân lập và nuôi cấy tại Việt Nam giúp chủ động hơn trong việc khai thác, bảo tồn và ứng dụng tạo các sản phẩm hữu ích. Việt Nam là Quốc gia có đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps và Isaria. Các nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu thực hiện ở mức độ trên cao chiết của các loài nấm Cordyceps spp. và còn rất ít các nghiên cứu về cô lập các hợp chất tự nhiên và xác định hoạt tính kháng phân bào của các hợp chất thu nhận được.

3.1. Đánh Giá Hoạt Tính Kháng Phân Bào Mục Tiêu Nghiên Cứu

Để đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên các dòng tế bào ung thư của các cao chiết và các hoạt chất từ sinh khối hệ sợi và quả thể nấm ký sinh côn trùng phân lập và nuôi trồng tại Việt Nam làm tiền đề cho các nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng tại Viêt Nam tạo nguồn nguyên liệu cho các ứng dụng thực tế trong dược phẩm, luận án “Nghiên cứu đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, Jurkat T của cao chiết và hoạt chất từ sinh khối, quả thể nhân nuôi của chủng nấm Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae F0004’’ với nội dung thực hiện như sau: tạo cao chiết từ sinh khối và quả thể nấm nuôi trồng; sàng lọc cao chiết có độc tính tế bào tiềm năng trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T; xác nhận đặc tính kháng phân bào của các cao chiết tiềm năng; cô lập và xác định hợp chất có hoạt tính kháng phân bào từ cao chiết tiềm năng là khả thi và cần thiết.

3.2. Hướng Ứng Dụng Thực Tế Từ Nghiên Cứu Nấm Cordyceps Việt Nam

Các công trình nghiên cứu và ứng dụng nấm Cordyceps chủ yếu được thực hiện trên các chủng nấm được phân lập và có nguồn gốc từ nước ngoài nên hướng ứng dụng thực tế có nhiều hạn chế khi ứng dụng tại Việt Nam. Việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng nấm Cordyceps của Việt Nam, được phân lập và nuôi cấy tại Việt Nam giúp chủ động hơn trong việc khai thác, bảo tồn và ứng dụng tạo các sản phẩm hữu ích. Việt Nam là Quốc gia có đa dạng các chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi Cordyceps và Isaria.

IV. Chiết Xuất Đánh Giá Độc Tính Tế Bào Phương Pháp Nghiên Cứu

Các nghiên cứu tại Việt Nam chủ yếu thực hiện ở mức độ trên cao chiết của các loài nấm Cordyceps spp. và còn rất ít các nghiên cứu về cô lập các hợp chất tự nhiên và xác định hoạt tính kháng phân bào của các hợp chất thu nhận được. Do đó, để đánh giá hoạt tính kháng phân bào trên các dòng tế bào ung thư của các cao chiết và các hoạt chất từ sinh khối hệ sợi và quả thể nấm ký sinh côn trùng phân lập và nuôi trồng tại Việt Nam làm tiền đề cho các nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng tại Viêt Nam tạo nguồn nguyên liệu cho các ứng dụng thực tế trong dược phẩm.

4.1. Quy Trình Chiết Cao Phân Đoạn Từ Sinh Khối và Quả Thể Nấm

Nghiên cứu tập trung vào việc tạo cao chiết từ sinh khối và quả thể nấm nuôi trồng. Sau đó, tiến hành sàng lọc cao chiết có độc tính tế bào tiềm năng trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Mục tiêu là xác nhận đặc tính kháng phân bào của các cao chiết tiềm năng, cũng như cô lập và xác định hợp chất có hoạt tính kháng phân bào từ cao chiết tiềm năng.

4.2. Phương Pháp Khảo Sát Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào In Vitro

Các phương pháp nghiên cứu in vitro được sử dụng để khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và cảm ứng apoptosis của cao chiết và các hợp chất. Điều này cho phép đánh giá một cách có hệ thống tác động của các thành phần nấm lên các dòng tế bào ung thư.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Tác Động Của Cao Chiết Lên Tế Bào Ung Thư

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các cao chiết từ sinh khối và quả thể của Cordyceps neovolkiana DL0004 và Isaria cicadae có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Các kết quả này mở ra hướng nghiên cứu mới về tiềm năng ứng dụng của các loài nấm này trong điều trị ung thư.

5.1. Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Của Cao Chiết Cordyceps Neovolkiana DL0004

Các cao chiết từ Cordyceps neovolkiana DL0004 thể hiện hoạt tính gây độc đối với cả hai dòng tế bào MCF-7 và Jurkat T. Điều này cho thấy tiềm năng của loài nấm này trong việc phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới.

5.2. Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Của Cao Chiết Isaria Cicadae F0004

Tương tự, các cao chiết từ Isaria cicadae F0004 cũng cho thấy hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Điều này củng cố thêm giá trị của các loài nấm Cordyceps và Isaria trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm kháng ung thư.

VI. Apoptosis Chu Kỳ Tế Bào Cơ Chế Tác Động Kháng Ung Thư

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động cho thấy các cao chiết tiềm năng có khả năng cảm ứng apoptosis (chết tế bào theo chương trình) ở tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Ngoài ra, chúng còn ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào, góp phần ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

6.1. Cảm Ứng Apoptosis Tế Bào Ung Thư Bằng Cao Chiết PE

Cao chiết PE từ sinh khối Cordyceps neovolkiana DL0004 có khả năng cảm ứng apoptosis ở cả hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Điều này được chứng minh thông qua các xét nghiệm hình thái tế bào và phân tích bằng phương pháp nhuộm Annexin V/PI.

6.2. Ảnh Hưởng Của Cao Chiết EA Lên Chu Kỳ Tế Bào Ung Thư

Cao chiết EA từ quả thể Isaria cicadae cũng cho thấy khả năng ảnh hưởng đến chu kỳ tế bào của tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T. Điều này cho thấy các cao chiết này có thể ức chế sự phân chia và phát triển của tế bào ung thư.

Luận án tiến sỹ về hoạt tính kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7 và Jurkat T từ nấm Cordyceps neovolkiana và Isaria cicadae