Khóa Luận Tốt Nghiệp Về Hàm Lượng Flavonoid Trong Lá Dâu Tằm

Luận văn tốt nghiệp hóa học nghiên cứu tốt nghiệp hóa học khảo sát hàm lượng flavonoid tổng và phân lập một số hợp chất từ lá dâu tằm, điều tra thực trạng, phân tích số liệu, đề

• Tác giả: Phan Thị Mai Trâm
• Người hướng dẫn: TS. Mai Đình Trị
• Trường học: Trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Cử Nhân Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hàm Lượng Flavonoid Trong Lá Dâu Tằm (Morus alba)
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2010
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. ĐẶC TÍNH THỰC VẬT
• 1.2. PHÂN BỐ, THU HÁI VÀ CHẾ BIẾN
• 1.3. VAI NÉT VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID
• 1.3.1. Đại cương và phân loại
• 1.3.2. Hoạt tính sinh học của các flavonoid
• 1.3.2.1. Tác dụng chống oxy hóa
• 1.3.2.2. Tác dụng kháng viêm
• 1.3.2.3. Tác dụng chống ung thư
• 1.3.3. Một số tác dụng khác
• 1.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC
• 1.4.1. Thành phần hóa học trong lá dâu tằm
• 1.4.2. Thành phần hóa học trong quả dâu tằm
• 1.4.3. Thành phần hóa học trong vỏ rễ dâu tằm
• 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. HÓA CHẤT - THIẾT BỊ - PHƯƠNG PHÁP
• 2.2. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CAO THÔ
• 2.3. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
• 3. ĐỊNH LƯỢNG HÀM LƯỢNG FLAVONOID TỔNG TRONG NGUYÊN LIỆU
• 3.1. Xây dựng đường chuẩn cho rutin
• 3.2. Hàm lượng flavonoid biến đổi theo nồng độ dung môi
• 3.3. Hàm lượng flavonoid biến thiên theo tỉ lệ nguyên liệu và dung môi
• 3.4. Hàm lượng flavonoid biến thiên theo nhiệt độ
• 3.5. Hàm lượng flavonoid biến thiên theo thời gian chiết
• 4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
• 4.1. Xác định cấu trúc của hợp chất MAIA
• 4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất MA3D
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Khóa Luận Tốt Nghiệp Nghiên Cứu Flavonoid

Khóa luận tốt nghiệp này tập trung vào việc nghiên cứu hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm (Morus alba). Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm khả năng chống oxy hóa và kháng viêm. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học của lá dâu tằm mà còn mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược lý.

1.1. Đặc Điểm Của Cây Dâu Tằm Và Flavonoid

Cây dâu tằm (Morus alba) là một loại cây có giá trị kinh tế cao, thường được trồng để lấy lá nuôi tằm. Lá cây chứa nhiều flavonoid như rutin và quercetin, có tác dụng chống oxy hóa và kháng viêm. Nghiên cứu về flavonoid trong lá dâu tằm sẽ giúp xác định giá trị dinh dưỡng và dược lý của loại cây này.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Flavonoid

Nghiên cứu hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm không chỉ giúp nâng cao giá trị của cây thuốc Việt Nam mà còn góp phần vào việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng. Các hợp chất này có thể được ứng dụng trong y học và dinh dưỡng, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người.

II. Vấn Đề Nghiên Cứu Hàm Lượng Flavonoid Trong Lá Dâu Tằm

Mặc dù có nhiều nghiên cứu về flavonoid, nhưng việc khảo sát hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào các loại cây khác, trong khi lá dâu tằm lại chưa được khai thác triệt để. Điều này đặt ra thách thức cho việc phát triển các sản phẩm từ lá dâu tằm, cũng như việc hiểu rõ hơn về tác dụng của chúng.

2.1. Thách Thức Trong Nghiên Cứu Flavonoid

Một trong những thách thức lớn nhất trong nghiên cứu hàm lượng flavonoid là thiếu thông tin về phương pháp chiết xuất và phân tích. Việc xác định chính xác hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm đòi hỏi các phương pháp hiện đại và chính xác.

2.2. Vấn Đề Về Tính Đa Dạng Của Flavonoid

Sự đa dạng của các loại flavonoid trong lá dâu tằm cũng là một vấn đề cần được nghiên cứu. Các hợp chất khác nhau có thể có tác dụng sinh học khác nhau, do đó việc phân lập và xác định cấu trúc của chúng là rất quan trọng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hàm Lượng Flavonoid Trong Lá Dâu Tằm

Để nghiên cứu hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm, các phương pháp chiết xuất và phân tích hiện đại sẽ được áp dụng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sẽ được sử dụng để xác định hàm lượng và cấu trúc của các hợp chất flavonoid trong mẫu lá dâu tằm.

3.1. Phương Pháp Chiết Xuất Flavonoid

Phương pháp chiết xuất sẽ bao gồm việc sử dụng dung môi hữu cơ để tách chiết các hợp chất flavonoid từ lá dâu tằm. Các yếu tố như thời gian chiết, nhiệt độ và tỉ lệ dung môi sẽ được tối ưu hóa để đạt được hiệu suất chiết xuất cao nhất.

3.2. Phân Tích Hàm Lượng Flavonoid

Sau khi chiết xuất, hàm lượng flavonoid sẽ được phân tích bằng phương pháp HPLC. Phương pháp này cho phép xác định chính xác các hợp chất flavonoid và hàm lượng của chúng trong mẫu lá dâu tằm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hàm Lượng Flavonoid Trong Lá Dâu Tằm

Kết quả nghiên cứu cho thấy lá dâu tằm chứa một hàm lượng đáng kể các hợp chất flavonoid như rutin và quercetin. Những hợp chất này không chỉ có tác dụng chống oxy hóa mà còn có khả năng kháng viêm, kháng khuẩn. Kết quả này mở ra hướng đi mới cho việc phát triển các sản phẩm từ lá dâu tằm.

4.1. Hàm Lượng Flavonoid Được Phát Hiện

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm có thể đạt tới 2-3% khối lượng khô. Điều này cho thấy tiềm năng lớn của lá dâu tằm trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng.

4.2. Tác Dụng Sinh Học Của Flavonoid

Các hợp chất flavonoid trong lá dâu tằm đã được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào khỏi sự tổn thương do gốc tự do. Điều này có thể góp phần vào việc phòng ngừa nhiều bệnh lý liên quan đến lão hóa.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Flavonoid Trong Lá Dâu Tằm

Nghiên cứu hàm lượng flavonoid trong lá dâu tằm đã chỉ ra rằng loại cây này có giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Việc khai thác và phát triển các sản phẩm từ lá dâu tằm không chỉ có lợi cho sức khỏe mà còn góp phần vào việc bảo tồn và phát triển cây thuốc Việt Nam.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Flavonoid

Nghiên cứu về flavonoid trong lá dâu tằm cần được tiếp tục mở rộng để khám phá thêm nhiều hợp chất mới và tác dụng của chúng. Điều này sẽ giúp nâng cao giá trị của cây thuốc Việt Nam và phát triển các sản phẩm từ thiên nhiên.

5.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Flavonoid

Các sản phẩm từ lá dâu tằm có thể được ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người. Việc phát triển các sản phẩm này sẽ góp phần vào việc nâng cao giá trị kinh tế cho người nông dân trồng dâu tằm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực y dược và hóa học các hợp chất thiên nhiên, xu hướng tìm kiếm và phát triển các loại thuốc mới có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được quan tâm do thuốc tổng hợp hóa dược tuy có hoạt tính sinh học cao nhưng thường đi kèm nhiều tác dụng phụ bất lợi. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú, trong đó nhiều loài cây cỏ đã được sử dụng theo kinh nghiệm y học cổ truyền qua nhiều thế hệ nhưng chưa được nghiên cứu toàn diện về thành phần hóa học cũng như kiểm chứng hoạt tính sinh học bằng phương pháp khoa học hiện đại.

Cây dâu tằm (Morus alba L., thuộc họ Dâu tằm Moraceae) là loài thực vật quen thuộc, được trồng phổ biến để lấy lá nuôi tằm và làm thuốc. Mặc dù trên thế giới đã có nhiều công trình công bố về thành phần hóa học của cây dâu tằm, các nghiên cứu chuyên sâu về hàm lượng hoạt chất và chiết tách hợp chất tự nhiên từ lá dâu tằm tại Việt Nam vẫn còn hạn chế. Đề tài khóa luận "Khảo sát hàm lượng flavonoid tổng và phân lập một số hợp chất từ lá dâu tằm Morus alba L. họ Dâu tằm (Moraceae)" được thực hiện nhằm góp phần nâng cao giá trị sử dụng và làm sáng tỏ thành phần hóa học của nguồn dược liệu này.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

1. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện công nghệ chiết xuất (nồng độ dung môi, tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ, thời gian) đến hiệu suất trích ly hàm lượng flavonoid tổng trong lá dâu tằm bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis.
2. Xây dựng quy trình chiết phân đoạn cao thô và ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân lập các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn cao chiết ethyl acetate.
3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng phương pháp đo hằng số vật lý và phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá của cây dâu tằm (Morus alba L., Moraceae).
• Phạm vi không gian: Mẫu thực vật được thu hái tại địa bàn thị xã Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng.
• Phạm vi thời gian: Mẫu được thu hái vào tháng 12 năm 2009; toàn bộ quy trình thực nghiệm, xử lý số liệu và hoàn thành khóa luận diễn ra trong năm 2010.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận thiết lập nền tảng lý thuyết chuyên ngành về hóa học thực vật và áp dụng quy trình thực nghiệm hóa hữu cơ chuẩn tắc để giải quyết các mục tiêu đề ra:

Cơ sở lý thuyết

• Đặc điểm và phân loại Flavonoid: Tổng quan về nhóm hợp chất phenol thực vật có khung sườn căn bản $C_6-C_3-C_6$ (1,3-diphenylpropan). Tác giả trình bày cấu trúc và đặc điểm của các nhóm flavonoid chính trong tự nhiên: flavone, flavanone, flavonol, dihydroflavonol, chalcone, dihydrochalcone, aurone, anthocyanidin, leucoanthocyanidin, isoflavone, rotenoid và neoflavonoid. Các dạng tồn tại chủ yếu gồm dạng tự do (aglycone) và dạng liên kết glycoside với các phân tử đường (D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose, acid uronic).
• Dược lý học và hoạt tính sinh học của Flavonoid: Tổng hợp các nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa (bắt gốc tự do DPPH, dập tắt oxy singlet); khả năng kháng viêm (ức chế tổng hợp prostaglandin, leukotriene, nitric oxide); hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư (vòm miệng HSC-2/SCC-25, tuyến giáp ARO/NPA, vú MCF-7, phổi SK-LU1, ruột kết Caco-2/HT-29...); tác dụng bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng nấm và làm bền thành mạch máu (các chế phẩm thương mại: Rutin C, Cevit-Rutin, Ginkor Fort, Legalon, Daflon).
• Thành phần hóa học chiết xuất từ cây dâu tằm: Khảo cứu các công trình công bố trong và ngoài nước về thành phần hóa học trong lá (flavonoid như rutin, moracetin, astragalin; dẫn xuất coumarin; alkaloid piperidine; các hợp chất mulberrofuran, moracin), quả (đường, acid hữu cơ, alkaloid dạng polyhydroxypiperidine) và vỏ rễ (kuwanon, albanol, leachianone, mulberroside...).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp chiết xuất và phân bố lỏng - lỏng: Bột lá dâu tằm khô được trích ngâm dầm với dung môi ethanol 70%, lọc bã, cô thu hồi dung môi dưới áp suất thấp trên máy cô quay chân không Buchi-111 thu cao tổng ethanol. Tiếp tục phân bố lỏng - lỏng cao tổng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: Petroleum Ether (PE), Chloroform ($CHCl_3$) và Ethyl Acetate (EtOAc).
• Phương pháp định lượng flavonoid tổng: Ứng dụng quy trình tạo phức màu của Zou, Lu và Wei. Dịch chiết phản ứng với dung dịch $NaNO_2\ 5%$, $AlCl_3\ 10%$ và kiềm hóa bằng $NaOH\ 4%$, để ổn định màu trong 15 phút rồi đo mật độ quang ở bước sóng cực đại $\lambda = 510\text{ nm}$. Hàm lượng flavonoid tổng được tính toán quy đổi theo đường chuẩn của chất đối chiếu Rutin (Sigma).
• Phương pháp sắc ký tách chiết và tinh chế:
  • Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sử dụng bản mỏng tráng sẵn silica gel DC-Alufolien $60\ F_{254}$ (pha thường) và $RP_{18}\ F_{254s}$ (pha đảo) của Merck. Phát hiện vết chất dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm (UVITEC), hoặc dùng thuốc thử phun $H_2SO_4\ 10%/\text{EtOH}$ và $FeCl_3/\text{EtOH}$, sau đó hơ nóng trên bếp điện.
  • Sắc ký cột (CC): Thực hiện trên cột thủy tinh với chất hấp phụ là Silica gel pha thường cỡ hạt 0,04–0,06 mm (240–430 mesh) và Silica gel pha đảo RP-18 cỡ hạt 30–50 $\mu m$.
• Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
  • Đo điểm nóng chảy mao quản trên máy Electrothermal IA series (không hiệu chỉnh).
  • Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D ($^1H\text{-NMR}\ 500\text{ MHz}$, $^{13}C\text{-NMR}\ 125\text{ MHz}$, DEPT) và 2D (HSQC, HMBC) trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tư liệu khoa học về thực vật học, công dụng dược liệu và thành phần hóa học của cây dâu tằm cùng nhóm hợp chất flavonoid:

• Mô tả hình thái thực vật của loài Morus alba L. (chiều cao tự nhiên tới 15m nhưng khi canh tác lấy lá thường khống chế 2–3m, vỏ xám nâu vàng, lá có 3 gân tỏa từ cuống, hoa đơn tính, quả kép mọng nước chuyển từ đỏ sang đen sẫm); vùng phân bố tập trung tại các vùng khí hậu mát như Bảo Lộc, Cát Tiên (Lâm Đồng).
• Phân tích công dụng các bộ phận dùng trong y học dân gian: Tang diệp (lá - tán phong thanh nhiệt, chữa ho, đau mắt đỏ), Tang bạch bì (vỏ rễ - lợi tiểu, hạ huyết áp, chữa hen suyễn), Tang thầm (quả - bổ can thận, dưỡng huyết), Tang ký sinh và Tang phiêu tiêu. Nêu dẫn chứng nghiên cứu dược lý của các tác giả Nhật Bản về tác dụng hạ đường huyết của nước sắc vỏ rễ dâu trên thỏ thực nghiệm.
• Tổng quan cấu trúc, phân loại hóa học và cơ chế tác dụng sinh học của 12 nhóm flavonoid chính; phân tích ứng dụng của flavonoid trong việc dập tắt gốc tự do, kháng viêm và ức chế các dòng tế bào ung thư.
• Tổng kết thành phần hóa học qua các công trình tiêu biểu: Saleh (1982) phân lập moracetin; Matsuyama (1991) phân lập moracin N; Adam (1996) phân lập các alkaloid piperidine; Sun Yeou Kim (1999) phân lập 9 hợp chất flavonoid chống oxy hóa (astragalin, quercetin-3-O-$\beta$-D-glucopyranoside...); Wen-yi (2002), Jiang Du (2003), Park (2003), Sohn (2004), Hesham (2006) và Zhang Mi (2009) phân lập các hợp chất kuwanon, mulberrofuran, leachianone và flavonoid glycoside từ các bộ phận của cây dâu tằm.

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình xử lý 2,0 kg bột lá dâu tằm khô và các bước phân tách hóa học:

• Điều chế cao thô: Bột khô được tận trích bằng ethanol 70%, lọc và cô giảm áp thu được 250,0 g cao EtOH sệt. Hòa cao với lượng nhỏ cồn-nước rồi chiết lỏng - lỏng lần lượt thu được cao $CHCl_3$ (7,07 g) và cao EtOAc (14,2 g).
• Phân đoạn sắc ký cao EtOAc:
  • Tiến hành sắc ký cột 14,2 g cao EtOAc trên silica gel với hệ dung môi rửa giải $CHCl_3:\text{MeOH}$ có độ phân cực tăng dần (20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 100% MeOH), gom thành 4 phân đoạn ký hiệu MA1 đến MA4.
  • Phân đoạn MA3 (6,0 g) được sắc ký cột tiếp tục với hệ PE:Acetone (10:1 đến 100%) thu 4 phân đoạn (MA31–MA34).
  • Phân đoạn MA32 (2,02 g) tiếp tục qua cột silica gel với hệ PE:Acetone (1:1 đến 100%) thu được 5 phân đoạn phụ (MA321–MA325).
• Phân lập hợp chất MA1A: Phân đoạn MA321 (571,0 mg) được sắc ký cột silica gel nhiều lần với hệ dung môi $CHCl_3:\text{MeOH}\ (10:1)$, thu nhận được 34,7 mg hợp chất sạch màu trắng, mã hiệu MA1A.
• Phân lập hợp chất MA3D: Phân đoạn MA324 (410,0 mg) qua sắc ký cột silica gel với hệ $CHCl_3:\text{MeOH}:H_2O$ (10:1:0,1; 7:1:0,1; 5:1:0,1) thu phân đoạn MA3242 (197,1 mg). Đoạn này tiếp tục qua sắc ký cột pha đảo RP-18 (dung môi $\text{MeOH}:H_2O = 1:4$) và tinh chế lại bằng cột silica gel với hệ $CHCl_3:\text{MeOH}:H_2O\ (7:1:0,1)$, thu được 78,5 mg hợp chất sạch màu vàng, mã hiệu MA3D.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các số liệu định lượng, đồ thị khảo sát và lập luận giải cấu trúc hóa học của các chất:

• Định lượng flavonoid tổng:
  • Xây dựng đường chuẩn Rutin: Phương trình hồi quy tuyến tính $y = 0,0064x$ trong khoảng nồng độ 20–100 mg/l tại bước sóng 510 nm.
  • Khảo sát các thông số chiết xuất: Tác giả khảo sát đơn yếu tố về nồng độ cồn (50%, 70%, 96%), tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml), nhiệt độ chiết ($^\circ\text{C}$) và thời gian chiết (giờ). Kết quả xác định điều kiện tối ưu để chiết flavonoid tổng là: dung môi ethanol 70%, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi 1:15, nhiệt độ chiết 50°C và thời gian chiết 3 giờ.
• Biện luận cấu trúc hợp chất MA1A:
  • Dạng bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy $121-122^\circ\text{C}$.
  • Phổ $^1H\text{-NMR}$ và $^{13}C\text{-NMR}$ kết hợp kỹ thuật DEPT chỉ ra 13 carbon, bao gồm một vòng benzyl đối xứng (với carbon bậc bốn $C-1$ ở $\delta_C\ 139,06\text{ ppm}$, carbon $C-4$ ở $\delta_C\ 128,68\text{ ppm}$, các proton tương ứng $H-4$ ở $\delta_H\ 7,29\text{ ppm}$, $H-3, H-5$ ở $\delta_H\ 7,34\text{ ppm}$, $H-2, H-6$ ở $\delta_H\ 7,43\text{ ppm}$; nhóm methylene $C-7$ ở $\delta_C\ 71,77\text{ ppm}$ tương quan với hai proton $H-7a$ ở $\delta_H\ 4,68\text{ ppm}$ và $H-7b$ ở $\delta_H\ 4,94\text{ ppm}$) liên kết với 1 phân tử đường $\beta$-D-glucopyranose (proton anomer $H-1'$ xuất hiện ở $\delta_H\ 4,37\text{ ppm},\ J=8,0\text{ Hz}$ tương quan với $C-1'$ ở $\delta_C\ 103,3\text{ ppm}$; nhóm oxymethylene $C-6'$ ở $\delta_C\ 62,8\text{ ppm}$).
  • Tương quan HMBC giữa proton anomer $H-1'$ và carbon $C-7$ chứng minh vị trí gắn liên kết glycoside. Cấu trúc của MA1A được xác định là Benzyl-7-O-$\beta$-D-glucopyranoside.
• Biện luận cấu trúc hợp chất MA3D:
  • Dạng bột vô định hình màu vàng, nhiệt độ nóng chảy $168-170^\circ\text{C}$.
  • Phổ $^1H\text{-NMR}\ (500\text{ MHz}, \text{MeOD})$ thể hiện các tín hiệu đặc trưng của khung kaempferol: hai proton vòng A ở dạng mũi đôi tương tác meta $H-6\ (\delta_H\ 6,23\text{ ppm},\ J=2,0\text{ Hz})$ và $H-8\ (\delta_H\ 6,42\text{ ppm},\ J=1,5\text{ Hz})$; hệ thống 4 proton vòng B dạng $AA'BB'$ gồm $H-2', H-6'\ (\delta_H\ 8,07\text{ ppm},\ d,\ J=8,5\text{ Hz})$ và $H-3', H-5'\ (\delta_H\ 6,90\text{ ppm},\ d,\ J=9,0\text{ Hz})$.
  • Phần đường gồm hai gốc đường: $\beta$-D-glucopyranose (proton anomer $H-1''$ ở $\delta_H\ 5,14\text{ ppm},\ d,\ J=7,5\text{ Hz}$) và $\alpha$-L-rhamnopyranose (proton anomer $H-1'''$ ở $\delta_H\ 4,54\text{ ppm},\ d,\ J=1,0\text{ Hz}$; nhóm methyl $H-6'''$ ở $\delta_H\ 1,11\text{ ppm},\ d,\ J=6,0\text{ Hz}$).
  • Tương quan phổ HMBC khẳng định liên kết $(1\to 6)$ giữa gốc rhamnose và glucose, đồng thời gốc rutinoside liên kết vào vị trí oxy ở $C-3$ của khung aglycone. Cấu trúc MA3D được xác định là Nicotiflorin (Kaempferol-3-O-rutinoside).

---

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp thông số tối ưu chiết flavonoid tổng và kết quả phân lập

Thông số / Hợp chất	Điều kiện tối ưu / Đặc điểm vật lý	Phương pháp / Cấu trúc hóa học xác định
Nồng độ dung môi chiết	Ethanol 70%	Đo quang UV-Vis tại $\lambda = 510\text{ nm}$
Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi	1:15 (g/ml)	Phương pháp Zou, Lu và Wei
Nhiệt độ chiết xuất	50°C	Chiết hồi lưu nhiệt độ kiểm soát
Thời gian chiết xuất	3 giờ	Chiết hồi lưu
Đường chuẩn Rutin	$y = 0,0064x$	Khoảng tuyến tính 20–100 mg/l
Hợp chất MA1A	Khối lượng: 34,7 mg; Bột màu trắng; $T_\text{nc} = 121-122^\circ\text{C}$	Benzyl-7-O-$\beta$-D-glucopyranoside (Phổ 1D & 2D NMR)
Hợp chất MA3D	Khối lượng: 78,5 mg; Bột màu vàng; $T_\text{nc} = 168-170^\circ\text{C}$	Nicotiflorin (Kaempferol-3-O-rutinoside) (Phổ 1D & 2D NMR)

Đóng góp của đề tài

• Xác lập được bộ thông số thực nghiệm định lượng về điều kiện tối ưu để chiết xuất flavonoid tổng từ lá dâu tằm thu hái tại Lâm Đồng.
• Phân lập thành công hai hợp chất tinh khiết có hàm lượng đáng kể từ phân đoạn ethyl acetate gồm một hợp chất benzyl glycoside (MA1A) và một hợp chất flavonoid diglycoside (MA3D).
• Cung cấp tập dữ liệu phổ học cộng hưởng từ hạt nhân ($^1H\text{-NMR}$, $^{13}C\text{-NMR}$, DEPT, HSQC, HMBC) chi tiết và đầy đủ của hai hợp chất MA1A và MA3D, làm cơ sở dữ liệu đối chiếu cho các nghiên cứu hóa học thực vật về loài Morus alba L. tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Mẫu nguyên liệu thực vật chỉ mới được thu hái tại một địa điểm duy nhất (thị xã Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng) vào một thời điểm trong năm (tháng 12/2009), chưa khảo sát biến thiên hàm lượng hoạt chất theo mùa thu hái và các vùng sinh thái thổ nhưỡng khác nhau.
• Quá trình sắc ký phân lập mới chỉ tập trung xử lý sâu phân đoạn MA3 (cụ thể là MA321 và MA324) của cao ethyl acetate; các phân đoạn còn lại từ cao petroleum ether, cao chloroform và dịch chiết nước chưa được khảo sát triệt để.
• Khóa luận dừng lại ở mức độ phân lập và giải cấu trúc hóa học, chưa tiến hành thử nghiệm các hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, kháng vi sinh vật kiểm định, ức chế enzyme) trực tiếp trên hai hợp chất tinh khiết thu được.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiếp tục thực hiện sắc ký phân lập trên các phân đoạn cao chiết còn lại của lá dâu tằm nhằm tìm kiếm thêm các hợp chất thứ cấp khác.
• Thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học in vitro (khả năng quét gốc tự do DPPH, kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế enzyme $\alpha$-glucosidase) của hợp chất MA1A và MA3D.
• Nghiên cứu mở rộng khảo sát hàm lượng flavonoid tổng theo các giai đoạn sinh trưởng của lá và các vùng trồng dâu tằm khác tại Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu học thuật có giá trị ứng dụng cụ thể:

• Đối tượng sử dụng: Sinh viên, học viên cao học, giảng viên và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Công nghệ sinh học.
• Nội dung tham khảo hữu ích:
  • Quy trình thực nghiệm định lượng flavonoid tổng bằng phản ứng tạo màu với $AlCl_3$ và đo quang phổ UV-Vis.
  • Kỹ thuật phối hợp sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18 trong việc phân tách các hợp chất glycoside có độ phân cực gần nhau.
  • Phương pháp phân tích và quy kết tín hiệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (HSQC, HMBC) để xác định vị trí liên kết glycoside và cấu hình không gian của phân tử đường.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu lá dâu tằm sử dụng trong nghiên cứu được thu hái ở đâu và xử lý ban đầu như thế nào?
Mẫu lá dâu tằm (Morus alba L.) được thu hái tại thị xã Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 12 năm 2009. Sau khi thu hái, mẫu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, sấy lại ở nhiệt độ thấp và xay thành bột mịn với tổng khối lượng bột khô sử dụng là 2,0 kg.

2. Phương pháp định lượng flavonoid tổng trong lá dâu tằm được tiến hành theo quy trình nào?
Nghiên cứu áp dụng phương pháp đo quang phổ của Zou, Lu và Wei. Dịch chiết mẫu phản ứng với dung dịch $NaNO_2\ 5%$ và $AlCl_3\ 10%$, sau đó kiềm hóa bằng $NaOH\ 4%$, định mức và để yên 15 phút rồi đo mật độ quang ở bước sóng 510 nm. Hàm lượng flavonoid tổng được tính toán dựa trên phương trình đường chuẩn của chất đối chiếu Rutin ($y = 0,0064x$).

3. Các điều kiện công nghệ nào cho hiệu suất chiết flavonoid tổng cao nhất từ lá dâu tằm?
Qua quá trình khảo sát thực nghiệm, tác giả xác định điều kiện tối ưu gồm: dung môi ethanol nồng độ 70%, tỉ lệ khối lượng nguyên liệu so với thể tích dung môi là 1:15 (g/ml), nhiệt độ chiết xuất duy trì ở 50°C và thời gian chiết hoàn lưu trong 3 giờ.

4. Hai hợp chất tinh khiết phân lập được từ lá dâu tằm có tên gọi, khối lượng và nhiệt độ nóng chảy là bao nhiêu?
Hai hợp chất phân lập được từ cao ethyl acetate gồm:

• Hợp chất MA1A: Phân lập từ phân đoạn MA321 với khối lượng 34,7 mg, dạng bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy $121-122^\circ\text{C}$, được xác định là Benzyl-7-O-$\beta$-D-glucopyranoside.
• Hợp chất MA3D: Phân lập từ phân đoạn MA324 qua sắc ký cột pha đảo RP-18 với khối lượng 78,5 mg, dạng bột vô định hình màu vàng, nhiệt độ nóng chảy $168-170^\circ\text{C}$, được xác định là Nicotiflorin (Kaempferol-3-O-rutinoside).

5. Cấu trúc hóa học của hợp chất MA3D (Nicotiflorin) được tạo thành từ những thành phần nào?
Nicotiflorin (MA3D) có cấu trúc gồm phần khung aglycone là kaempferol (3,5,7,4'-tetrahydroxyflavone) liên kết tại vị trí $C-3$ với một mạch đường rutinoside. Mạch đường này gồm một phân tử đường $\beta$-D-glucopyranose liên kết với một phân tử $\alpha$-L-rhamnopyranose qua cầu nối glycoside $(1\to 6)$.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của Phan Thị Mai Trâm đã khảo sát có hệ thống các điều kiện công nghệ chiết xuất flavonoid tổng từ lá dâu tằm (Morus alba L.) thu hái tại Bảo Lộc, Lâm Đồng và xác định được bộ thông số tối ưu (EtOH 70%, tỉ lệ 1:15, 50°C, 3 giờ) bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis. Bằng việc kết hợp sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18 trên phân đoạn cao ethyl acetate, tác giả đã phân lập thành công hai hợp chất sạch là Benzyl-7-O-$\beta$-D-glucopyranoside (MA1A) và Nicotiflorin (MA3D). Cấu trúc hóa học của hai hợp chất được xác định rõ ràng thông qua phân tích hằng số vật lý và hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D, 2D NMR. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu khoa học thực nghiệm có giá trị, đóng góp vào việc chuẩn hóa cơ sở dữ liệu hóa học thực vật của loài dâu tằm tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Mở Đầu Mớ Đầu Go} Ngây nay khoa học phat triển, đặc biệt là ngảnh hóa được đã nghiên cứu tông hợp được nhiều loại thuốc chữa bệnh có hoạt tính sinh học cao nhưng đồng thời cũng gây một vải tác dụng phụ cho người dùng. Vi thế, việc nghiên cứu va tim ra nhiều loại thuốc mới có nguồn gốc thảo dược luôn được các nha khoa học quan tâm. Nhiều hợp chất được phân lập từ thảo dược có hoạt tính sinh học quan trọng như kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng viêm. Việt Nam nam trong vùng nhiệt đới gió mùa nóng va am nên có thảm thực vật rất đa dạng và phong phú với nhiều chủng loại khác nhau, việc sử dụng các bộ phận của cây cỏ lam thuốc chữa bệnh đã có truyền thống lâu đời.

Tuy nhiên, các bài thuốc, vị thuốc y học cỗ truyền ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học, cũng như chưa tiến hành thử nghiệm sinh học nhằm làm sáng tỏ, kiểm chứng các tác dụng của nó. Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu vé thành phẩn hóa học cây dâu tim, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về loại thảo được nảy. Với những dược tính đã biết, có thé đâu tằm vẫn còn ấn chứa những công dụng hữu ích khác mà chúng ta chưa biết đến. Trong dé tai này, chúng tôi tiến hành khảo sát hàm lượng flavonoid va phân lập một số hợp chat từ lá dâu tằm Morus alba L.

họ Dâu tằm (Moraceae), nhằm góp phan nâng cao giá trị cây thuốc Việt Nam. Chương | TÔNG QUAN Khóa Luận Tốt Nghiệp Tong Quan 1.1 DAC TINH THUC VAT Tên khoa hoc: Morus alba L. Morus acidosa Griff, thuộc họ: Dâu tằm Moraceae. Cây dâu tim còn được gọi là may môn (Thỏ), dâu cang (Mèo), tim lang.1 Đặc điểm thực vật cây dâu tam.

l'!'Êk Bì Cây dâu là một cây có thé cao tới 15m, nhưng thường do hái lá luôn nên chi cao 2-3m. Vỏ xám nau vàng. đầu lá nhọn hay hơi tù, mặt đưới có lông thưa ở gân, cuống không lông, phía cudng hơi tròn hoặc hơi bằng. Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt.

Hoa đơn tính, cùng gốc hay khác gốc. Hoa đực mọc thành bông đơn ở nách lá, hoa đực có nhụy cai lép, có 2 voi nhị dai, Hoa cái cũng mọc thành bông hay thành khối hình cau, có 4 lá dai. Qua bế bao bọc trong các lá dài, mọng nước thành một quả phức (quả kép) mau đó, sau den sam. Quả có thé ăn được và lam thuộc.

Khóa Luận Tốt Nghiệp Tổng Quan Hình 1. Lá cây Dâu tằm Hình 1. Hoa cây Dau tằm 1.2 Phân bố, thu hái và chế biến !'! Cây dâu tằm có nguồn gốc Trung Quốc. Đã được di thực vào Việt Nam tir lau, hiện nay được trong ở khắp nơi dé lấy lá nuôi tim, một số bộ phận được khai thác dùng lam thuốc.

Trồng ở nhiều nơi ở Việt Nam. Vi cây ua khi hậu mát nên mọc được ở nhiều vùng dat. Huyện Cát Tiên, phía nam tỉnh Lâm Đông trồng 300 ha dâu tăm. Cây được trồng nhiều dé lấy lá nuôi tim.

Trồng vao mùa xuân, mùa thu. Người ta thu hái vào mùa hạ, còn cảnh thi thu hai quanh năm, cắt nhỏ, phơi khô. Vỏ rẻ trước khi phơi phải cạo sạch lớp vỏ ngoài, quả hái khi chín.2 CONG DUNG CUA CÂY DAU TAM. ft :Êi - Lá dau gọi là Tang diệp (Folium Mori).

- Vỏ rễ cây dâu gọi là Tang bạch bì (Cortex, Mori radicis). - Quả dâu gọi là Tang thầm (Fructus Mori). - Cây moc ký sinh trên cây dâu gọi là Tang ky sinh (Ramulus loranthi) - Tô bọ ngựa trên cây đâu gọi là Tang phiêu tiêu (Ootheca mantidis). - Sâu đâu: Con sâu năm trong thân cay dâu, von là âu trùng của một loại xen toc.1 Các nghiên cứu về được lí.

[rong Nhật Ban được vật học tạp chỉ vẻ vo rẻ cây dâu, các tác giả Nhật Ban thử nghiệm cho thỏ udng nước sắc vỏ rẻ cay dau roi theo đối lượng đường te Khóa Luận Tốt Nghiệp Tong Quan trong mau thay lúc mới uống vào, lượng đường trong máu tăng lên, sau đó giảm dan. Các bộ phận khác của cây dâu chưa có tải liệu nghiên cứu nhiều.2 Theo y học dân gian.1 Vỏ rễ cây dâu Vị ngọt, nhạt, hơi đẳng, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, hành thủy, giảm ho. Làm thuốc lợi tiểu tiện, dùng trong bệnh thủy thũng, chữa ho lâu ngày, hen, ho có dom, băng huyết, chữa sốt, chữa cao huyết áp, dj ứng do ăn uống, phong thắp. Liều ding hằng ngày 6-18g đưới dạng thuốc sắc hay thuốc bột.

Chữa ho ra máu: vỏ ré cây đâu 600g. Ngâm nước vo gạo 3 đêm. Tước nhỏ, cho thêm 250g gạo nếp sao vang, tán nhỏ, trộn đều. Ngày uống hai lan.

Ho lâu nam: vỏ cây dâu - vỏ rễ cây chanh. Hai vị bằng nhau, mỗi thứ 10g sắc uống trong 10 ngảy. Trẻ con ho có đờm: vỏ rễ cây dâu 4g sắc với nước cho uéng. Rung tóc: lấy vỏ rễ cây dâu giã dập, ngâm nước.

Dun sôi nửa giờ. Lọc, lấy nước đó gội đầu.2 Lá dâu Lá đâu có vị đắng, ngọt, tính hàn. Có tác dụng tán phong, thanh nhiệt, lương huyết sáng mắt, dùng chữa phong ôn biểu chứng, lao nhiệt sinh ho, đầu nhức mắt đỏ, nước mắt chảy nhiều, hoa mắt. Chữa nôn ra máu: lá đâu cuối màu, sao vang sắc uống.

Mụn nhọn lâu ngày không liền miệng: lá dâu sao vàng tán nhỏ, rắc vào mụn đã rửa sạch.3 Quả dâu Vị ngọt, chua. Có tác dụng bô gan, than, khứ phong. loa lich, mat có màng, tai ủ, huyết hư, tiện bí. Những người đại tiện tiết tả không được dùng.

Chữa trang nhạc: quả dâu (loại quả đã chín đen) 2 bát đầy. Cho vào vải vắt lay nước, cô thành cao mềm. Ngày uống 3 lan, mỗi lin 5g. Tóc không mọc-tóc bạc: quá đâu ngâm nước, lọc lấy nước xát vào đầu Lang phiêu tiêu lợi tiêu tiện.

Chữa đi tiểu nhiều lần, di tinh, liệt dương, bạch đới. trẻ con dai dâm. Khóa Luận Tốt Nghiệp Tong Quan 1.3 VAI NET VE HỢP CHAT FLAVONOID 1. Đại cương và phân loại “!""! Flavonoid là những hợp chat mau phenol thực vật, tạo nên màu cho thực vật.

Phan lớn các flavonoid có mau vang (do từ flavus la màu vâng), tuy vay, một số sắc tổ có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản Cạ-C;-C,. Flavonoid cỏ cấu trúc căn bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzene A và B nỗi nhau qua một dây có 3 C, nên thường được gọi là C„-C;-C,. Các flavonoid có thé hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D-glucose, kế đó là D-galactose, L-rhamnose, L- arabinose, D-xylose, D-apiose và acid uronic.

Các flavonoid được phân thành nhiều nhóm với cấu trúc co bản khác nhau. Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) vả các mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon.1 Flavone Flavone có cấu trúc chung 2 vòng benzene A va B. Vòng B gắn vào vòng C (pyran) qua dây nối ở Cp.2 Flavanone Flavanone khác với flavone ở chỗ không có nối đôi ở vị trí C; và Cs. Tat cả các flavanone được phát hiện cho đến nay đều có nhóm OH ở vong A hoặc B.3 Flavonol Khác với flavone là có thêm nhóm OH ở Cs.

Flavonol rat phổ biến trong tự nhiên. Thống kê trên 1000 loài thuộc thực vật hạt kín thi thấy 48% loài có kaempferol, 26% quercetin và myricetin chiếm 10% trong tổng số loài có flavonol.4 Dihydroflavonol Cau trúc cơ bản giống flavonol nhưng không có nối đôi C;-Cạ. Còn gọi là 3-hydroxyflavanol hoặc flavanol Khóa Luận Tết Nghi Tổng Quan 1.5 Chalcone Chalcone có 2 vòng A và B nỗi với nhau bởi | mạch hở 3 carbon, không có di vòng như các flavonoid khác và sé thứ ty carbon bắt đầu từ vòng B.6 Dihydrochalcone Là chalcon mắt đây nối đôi a, B. Loại này it gặp trong ty nhiên.7 Aurone Là nhóm flavonoid có màu vảng sáng.

Khung của auron cũng có 12 carbon như các flavonoid khác, nhưng dị vòng C chi có 5 cạnh. Số lượng cũng như sự phân bế trong cây cũng hạn chế.8 Anthocycyanidin Về cấu trúc, nhóm nay khác các flavonoid khác ở chỗ không có nhóm carbonyl ở Cy.9 Leucoanthocyanidin Là 3,4-diol flavan, không mau, nhưng gặp acid biến thành anthocyanidin có mau hồng hoặc đó, rất phổ biến trong cây, nhất là trong vỏ cây và gỗ.10 Isoflavone La nhóm isoflavonoid phổ biến nhất.11 Rotenoid Người ta đã biết khoảng 15 chất rotenoid, chất điển hình nhất là rotenone có trong cây thuốc cá Derris elliptica. Tác dụng quan trọng của nhóm hợp chất này là điệt sâu bọ, do hạn chế khả năng thu nhận oxy của sâu bọ.12 Neoflavonoid Chất đầu tiên được phân lập là calophylolid chiết từ hạt cây Mù u Calophyllum inophyllum và một số loài Calophyllum khác, họ Guttiferae. Dưới đây là cầu trúc cơ bản của một số khung flavonoid điển hình: MP OH OH re) O Flavone Flavonol Dihydroflavonol Khóa Luận Tốt N Tôn n Dihydrochalcone Isoflavanone Anthocyanidin Rotenoid Neoflavonoid Hình 1.4 : Cấu trúc một số dạng flavonoid 1.2 Hoạt tính sinh học của các flavonoid, I97H39M4 Flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học mặc dù ở nồng độ cao cũng không gây độc cho cơ thể, như khả năng chống oxy hóa, kháng khối u, kháng viêm, chống dị ứng và là tác nhân bảo vệ gan.

Vì vậy, nghiên cứu về hoạt tính của các flavonoid luôn nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học, đặc biệt là nghiên cứu khả năng kháng khối u của flavonoid, 1.1 Tác dụng chống oxy hóa. Các flavonoid là các chat chỗng oxy hóa tự nhiên. Chúng có khả năng bắt các gốc gây oxy hóa và dập tắt các oxy singlet. Các nghiên cứu đã chứng tỏ flavonol, flavone cũng như các anthocyanin có hoạt tính chống oxy hóa chủ yếu được trên khả nang bắt các dụng gốc tự do của oxy.

Một sé hợp chat flavonoid có tác dụng chéng oxy hóa: albanin D (30), albanin E (37), resveratrol (38). Khóa Luận Tot Nghigp Tong Quan 1.2 Tac dung khang viém Do kha năng của flavonoid ức chế sự tạo thành các chất trung gian của quá trình viêm như prostaglandin, leukotriene hoặc nitric oxide.3 Tác dụng chống ung thư Nam 1980, Brown, Sugimura va Nagao đã nghiên cứu và nhận thay khối u không phát triển ở chuột khi cho chuột ăn với 2% quercetin trong khẩu phản. Năm 2003, Wenying Ren và cộng sự nghiên cứu vả báo cáo các tác dụng được lí của hợp chất flavonoid và kết luận các hợp chất flavonoid có thể tốt cho quá trình điều trị bệnh ung thư, chúng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.