CHƯƠNG 1. Đặt van đề Lan Kim tuyến tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume là một loài thực vật thuộc họ Orchidoideae. Lan Kim tuyến có nguồn gốc từ Hy Lạp, sau đó được phát hiện nhiều nhất ở các nước như Thái Lan, Việt Nam, Trung Quốc. Lan Kim tuyến là một trong những được thảo quý, giúp dưỡng âm, bổ máu.
Trong y học cô truyền, lan Kim tuyến giúp chữa trị một số bệnh như đau bụng, đau ruột, sốt cao, hoặc đắp bên ngoài chỗ vết thương bị ran cắn, các chỗ sưng, tăng cường sức khỏe, bô máu, chủ trị bệnh phổi, di tinh, yếu gan, yếu tỳ. Hiện nay, lan Kim tuyến ngoài tự nhiên bị thu hái nhiều đến mức cạn kiệt (Nguyễn Tiến Bân, 2005). Cây được trồng bằng các phương pháp truyền thống sinh trưởng phát triển chậm. Vì vậy, việc nghiên cứu ra những phương pháp nhân giống mới dé thay thé cho phương pháp nhân giống truyền thống là rất cấp thiết.
Phương pháp nuôi cấy mô in vitro được biết đến là phương pháp nhân giống có năng suất cao và sạch bệnh. Việc gia tăng năng suất cây trồng cũng như tăng hàm lượng các hợp chất có lợi trong thực vật là rất quan trọng. Tuy nhiên, trong tự nhiên các hợp chất thứ cấp được tạo ra tùy thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng và phát triển của thực vật, nhưng số lượng là rất ít so với nhu cầu sử dụng. Do đó, nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bảo thực vật sử dụng chất kích khang dé tăng cường sinh tổng hợp các hợp chat thứ cấp là một giải pháp đang được quan tâm hàng đầu.
Từ những cơ sở nêu trên thì đề tài “Ảnh hưởng của một số elicitor lên sự sinh trưởng và tích lũy hợp chất ở cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro trong môi trường lỏng” được thực hiện nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu tăng cường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong nuôi cay mô in vitro cây lan Kim tuyến. Mục tiêu đề tài Xác định nồng độ Salicylic acid và Yeast extract thích hợp cho sự sinh trưởng va tích lũy hợp chất ở cây Lan Kim tuyến in vitro. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Khảo sát sự anh hưởng riêng lẻ của Salicylic aicd và Yeast extract lên sự sinh trưởng và tích lũy hợp chất của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro. Nội dung 2: Khảo sát sự ảnh hưởng kết hợp của SA và YE lên sự sinh trưởng và tích lũy hợp chat của cây lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro.
TONG QUAN TAI LIEU 2. Tổng quan về cây lan Kim tuyến Phân loại thực vật (Sách Đỏ Việt Nam, 2007) Giới : Plantae Bộ : Asparagales Họ : Orchidaceae Tông : Cranichideae Chi : Anoectochillus Loài : Anoectochilus setaceus Hình 2. Cây lan Kim tuyến (Nguyễn Việt Cường, 2022) Lan Kim tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume. Ngoài ra, còn có các tên gọi khác như Lan gam, Lan Kim tuyến tơ.
Đặc điểm thực vật học của cây lan Kim tuyến Lan Kim tuyến là cây thân thảo có chiều cao từ 10 - 20 cm, thân màu tim, mong nước, mang từ 2 đến 6 lá mọc cách, xòe trên mặt đất. Thân lan Kim tuyến gồm thân rễ và thân khí sinh. Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dai. Thân rễ có chiều dài từ 5 - 12 cm, đường kính thân rễ từ 2,5 - 3,5 mm.
Thân rễ màu nâu đỏ hoặc xanh trắng, nhẫn, không phủ lông và có từ 3 - 7 gióng. Thân khí sinh thường mong nước, nhãn, có phủ lông mềm, màu hồng nhạt hoặc xanh trang. Thân được boc bởi các be lá xếp lợp, thường mọc thắng đứng trên mặt đất, ít khi nghiêng. Chiều dài thân khí sinh 3 - 7 em, đường kính 2,5 - 3,5 mm.
Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau, mỗi thân có từ 2 - 5 gióng. Rễ có chiều dài thay đổi từ 1 - 9 em, được mọc ra từ các mau trên thân rễ, cũng có khi được hình thành từ thân khí sinh. Thường mỗi mau có 1 rễ, đôi khi có thé có vài rễ. Mỗi cây có từ 2 - 9 rễ.
Số lượng lá trên một cây có từ 2 - 6 chiếc, thường gặp là 4. Lá có bẹ nhẫn, hình máng ôm lây thân. Hệ gân lông chim thường có 5 gân gốc nổi rõ các gân phụ, màu đỏ tia ánh Kim, mặt dưới lá gân màu xanh. Kích thước của lá thay đổi, dài 3 - 5 cm, rộng 2 - 4 cm.
Cụm hoa mọc ở đầu ngọn thân, dài từ 5 - 20 cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4 - 10 hoa. Hoa màu trắng, có cánh môi lớn. Hai bên ria mang từ 6 - 8 râu mỗi bên. Hoa nở vào thang 9 đến tháng 12 (Lo Thị Mai Thu, 2021).
Nguồn gốc và phân bố của cây lan Kim tuyến Lan Kim tuyến được phát hiện nhiều nhất tại Hy Mã Lạp Sơn với khoảng 28 loại, được thấy nhiều ở Indonexia, Thái Lan, Trung Quốc,. Ở Việt Nam, chúng phân bố hẹp tại một số địa phương như Hải Phòng, Lào Cai, Tam Đảo, Quảng Trị, Kon Tum, Sơn La, Yên Bái,. Lan Kim tuyến sinh trưởng rất chậm đưới tán rừng, trên sườn núi đá granit, ridlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất âm, rất giàu mùn và lá cây rụng. Lan Kim tuyến là một loài quý hiếm có tên trong Sách Đỏ Việt Nam và Phụ lục IA của Nghị định số 32/CP thuộc nhóm thực vật nghiêm cam khai thác, sử dụng vì mục đích thương mai và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN Ala,c,d, trong sách đỏ Việt Nam (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2007).
Thành phần hóa học cây lan Kim tuyến Trong cây lan Kim tuyến có nhiều hợp chất như nhóm flavonoids (Quercetin, Isorhamnetin), nhóm steroids, polysaccharides, oligosacharides và đường don, alkaloid và nhiều nguyên tố vi lượng và các khoáng chất. Ngoài ra, trong lan Kim tuyến còn có các chất khác với khối lượng rất nhỏ như sterols và một số kim loại như: Ca, Mg, Fe, Mn, Sr, Cu, Cr. re} OH HO HO ‘OH Genistein Phloretin Isoflavones Chalcones HO O. HO ‘OH Chalconaringenin HO HO OH OH OCH3 6 HO.
oN AC On HO, is S 6 “ ‘OH lô on OH OH canon Flavonols iisasarein Delphinidin Anthocyanins Cyanidin Hình 2. Cấu trúc cơ bản của một số hợp chat Flavonoid 4 2. Giá trị kinh tế và ý nghĩa dược học cây lan Kim tuyến Lan Kim tuyến được biết đến nhiều do khả năng ứng dụng trong y dược. Theo y học cô truyền Trung Hoa, lan Kim tuyến được dùng đề điều trị bệnh tiểu đường, làm tan khối u, giảm lipase trong máu và chữa viêm gan.
Lan Kim tuyến là nguồn được thảo quý, có giá kinh tế cao, trong đó loài Anoectochilus setaceus Blume thường gặp nhất và có giá trị thương mại cao nhất, gấp hàng chục lần các loài khác (Trần Thị Hồng Thúy và ctv, 2015). Tác giả Đỗ Thi Gam (2017), da chiết xuất và định lượng Flavonoid tổng số từ 3 loài Lan Kim tuyến của Việt Nam, kết quả cho thấy hợp chất Flavonoid được tích lũy chủ yếu ở lá cây lan Kim tuyến. Đặc biệt, quercetin và isorhamnetin thuộc nhóm flavonoid có giá trị được tính cao. Quercetin đóng vai trò như một chất giúp ngăn ngừa và điều trị ung thư một cách hiệu quả; chất này có chức năng cải thiện sức khỏe tim mạch, làm giảm lượng cholesterol giúp ngăn ngừa sơ vữa động mạch, ngăn ngừa đột quy và một số bệnh liên quan về tim mạch.
Theo nghiên cứu của Lê Đình Chắc (2019) về thành phần hóa học và vai trò của quercetin, isorhamnetin va ferulic acid trong hé tro nâng cao sức khỏe con người trong lan Kim tuyến tại Việt Nam thì trong nhóm flavonoid hợp chất isorhamnetin lại có khả năng ngăn ngừa tôn thương các tế bao trong cơ thé, hoạt động như một chất chống oxi hóa mạnh mẽ. Isorhamnetin được coi như một hop chất chống ung thư nhờ vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư. Ngoài ra, quercetin cũng là một hợp chat rat tốt đành cho bệnh nhân bị tiểu đường và cao huyết áp. Với khả năng chống viêm của mình cũng như khả năng làm bền thành mạch chống tai biên mach máu lão.
Đây cũng là một hợp chất quý đóng vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường và các bién chứng của bệnh tiểu đường. Tình hình nghiên cứu về cây cây lan Kim tuyến Chi lan Kim tuyến (Anoectochilus) đã được nghiên cứu ở một vài quốc gia nhưng chủ yếu ở Trung Quốc đã được nghiên cứu một cách toàn diện cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học và công dụng phòng, chữa bệnh (Lai Wan Yu, Lai Wan Nian, 2005). Nguyễn Thanh Mai và Mai Trường (2019). Đã ghiên cứu nuôi cấy lỏng lắc thu sinh khối lan Kim tuyến ban địa Anoectochilus roxburghii (Wall).
Đã xây dung thành công qui trình nhân nhanh lan Kim tuyến ban địa (Anoectochilus roxburghii (Wall) in vifro từ nguồn mẫu chồi tạo được từ khúc cắt thân. 5 Nguyễn Việt Cường và ctv (2022) đã xây dựng quy trình định lượng isorhamnetin trong cao chiết từ cây lan Kim tuyến (anoectochilus roxburghii) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Nguyễn Thị Ngọc Sương và ctv (2022) đã nghiên cứu đặc điểm giải phẫu và phân tích sơ bộ thành phần hóa học của lan Kim tuyến có thành phần chính bao gồm polysaccharid, flavonoid va glycoside. Chow va ctv (1982) đã nghiên cứu về nguồn vật liệu sử dung cho nhân sinh khối in vitro loài Anoectochilus formosanus rat da dang.
Nam 1907, Liu va ctv da chon chéi đỉnh dé nuôi cay mô. Nam 1987, Ho va ctv, năm 1992, Lee va ctv đã sử dung phôi hat dé lam nguon vật liệu nuôi cay. Năm 2001, các tác giả Yih-juh Shiau, Abhay Psagare, Uei-Chin Chen, Shu-Ru Yang và Hsin-Sheng Tsay đã nghiên cứu thành công loài Lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) từ hạt với công thức môi trường vào mau là: 1/2 MS + 0,2% than hoạt tinh + 8% dịch chiết chuối + 2 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA. Ở nước ta Lan Kim tuyến được xếp trong nhóm IA trong sách đỏ Việt Nam, cần bảo tồn các quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn Quốc Gia và Khu Bao tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống tạo hàng hóa xuất khâu và bảo về nguồn gen.
Ở Việt Nam do người dân thu hai tự phát dé bán làm thuốc nên có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên rất cao nếu không có biện pháp bảo vệ kịp thời. Hiện nay trong nước loài lan Kim tuyến (Anoecotchilus setaceus Blume) đã được nghiên cứu rộng rãi hơn về kỹ thuật nhân giống, gây trồng.