MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là nước nhiệt đới gió mùa với sự đa dạng về địa hình, kiểu đất, có khí hậu rất đặc trưng giữa các vùng miền đã làm nên sự phong phú về thành phần cũng như số lượng các loài thực vật. Trong đó có rất nhiều cây thuốc quý được dùng trong điều trị bệnh. Riêng họ Thiên lý (Aslepciadaceae) có khoảng 4.500 loài phân bố các khu vực nhiệt đới châu Mỹ, Ấn độ, Myanmar, châu Phi, châu Á trong đó có Việt Nam.
Trong y học cổ truyền, cây hà thủ ô trắng thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) được dùng làm thuốc bổ chữa thiếu máu, sốt rét kinh niên, thấp khớp, rối loạn kinh nguyệt, suy nhược thần kinh, ăn uống khó tiêu. Riêng rễ cây còn dùng để giải độc, chữa cảm sốt, trị vết sưng, vết thương do rắn cắn [1]. Ngoài ra cây hà thủ ô trắng còn cho thấy nhiều tiềm năng trong điều trị ung thư. Người ta đã cô lập các hợp chất trong rễ cây và thử các hoạt tính sinh học thì thấy được khả năng ức chế các loại tế bào như tế bào u xơ tử cung HT-1080, tế bào ung thư biểu mô tuyến giáp A549 ở phổi người [2], tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [3].
Bên cạnh việc khảo sát các hợp chất tự nhiên và thử hoạt tính sinh học của rễ cây thì chưa thấy có nghiên cứu trong lá và thân cây hà thủ ô trắng. Vì vậy tôi quyết định chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn B của cao chloroform từ lá và thân dây leo cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.), họ Asclepiadaceae” để khảo sát và phân lập các hợp chất có trong lá và thân cây này. Các nghiên cứu về đặc điểm thực vật -Tên khoa học: Streptocaulon juventas Merr [4]. - Tên thường gọi: Cây hà thủ ô trắng còn có tên là hà thủ ô nam, bạch hà thủ ô, củ vú bò, dây sữa bò, dây mốc… [4].
- Nguồn gốc phân bố: + Hiện tại có khoảng 10 loài thuộc chi Streptocaulon ở vùng nhiệt đới châu Á. + Loài hà thủ ô trắng phân bố chủ yếu ở 3 nước Việt Nam, Lào Campuchia và một số vùng phía nam Trung Quốc. + Ở Việt Nam, hà thủ ô trắng phân bố rải rác khắp tỉnh niềm núi, trung du và đôi khi cả ở đồng bằng. Thường thấy ở Vĩnh Phúc, Hà Tây, Tuyên Quang [4].
- Mô tả thực vật: Hà thủ ô trắng thuộc họ dây leo, dây dài từ 2-5m. Thân và cành màu nâu đỏ, có nhiều lông, dày hơn ở ngọn non, khi già nhẵn dần. Lá mọc đối, hình trứng ngược, mặt trên màu xanh sẫm, mặt dưới màu trắng nhạt có nhiều lông mịn. Hoa màu nâu nhạt hoặc vàng tía.
Quả hình thoi, màu xám nhiều lông. Rễ củ dài có màu trắng, giữa có lõi trong như củ sắn nhưng có vị đắng [1]. Quả cây hà thủ ô trắng Hình 1. Củ cây hà thủ ô trắng 2 Hình 1.
Hoa cây hà thủ ô trắng Hình 1. Lá và thân cây hà thủ ô trắng 1. Công dụng của hà thủ ô Hà thủ ô trắng có vị ngọt đắng, chát, tính mát, có tác dụng bổ máu, bổ gan và thận. Một số bài thuốc dùng trong đông y [1].
• Chữa cảm sốt, ra mồ hôi nhiều, chữa vết thương sưng đau: dùng dạng cao thuốc hoặc rượu uống. • Chữa đái rát, đái buốt: hà thủ ô trắng sắc nước hàng ngày. • Chữa rắn cắn: rễ hoặc lá hà thủ ô trắng nhai nuốt nước, bã đắp lên vết thương. • Chữa lở, ngứa: lá và cành hà thủ ô trắng đun nước tắm.
Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học 1. Các nghiên cứu trên thế giới 1. Cây hà thủ ô trắng Năm 2003, Jun-ya Ueda và cộng sự đã phân lập được mười sáu hợp chất cardenolide, hai hợp chất phenylpropanoide và phenylethanoide từ rễ củ hà thủ ô trắng. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ở người đó là u xơ tử cung HT-1080, ung thư biểu mô tuyến giáp A549, ung thư cổ tử cung HeLa và trên ba dòng tế bào ở chuột là ung thư đại tràng 26-L5, ung thư phổi Lewis, các khối u ác tính B16-BL6.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cả mười sáu hợp chất cardenolide phân lập được đều có khả năng ức chế mạnh và có chọn lọc đối với sự phát triển của dòng tế bào HT- 1080 (IC50 = 0,054-1,6 µM) và A549 (IC50 = 0,016-0,65 µM) [5]. Cấu trúc của mười sáu hợp chất cardenolide được xác định là : acovenosigenin A digitoxoside (1); 3 acovenosigenin A (2); digitoxigeningentiobioside (3); digitoxigenin 3-O-[-O-𝛽- glucopyranosyl-(1→ 6)-O-β-glucopyranosyl-(1→4)-3-O-acetyl-β digitoxopyranoside] (4); digitoxigenin 3-O-[O-β-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-glucopyranosyl-(1→4)-O-β- digitalopyranosyl-(1→4)-β- cymaropyranoside] (5); periplogenin 3-O-(4- O-β- glucopyranosyl-β-digitalopyranoside) (6); periplogenin 3-O-β-digitoxoside (7); periplocymarin (8); periplogenin (9); 17α- digitoxigenin (10); digitoxigenin 3-O-[O- β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside] (11); digitoxigenin sophoroside (12); echujin (13); periplogenin glucosid (14); corchorusoside C (15); subalpinoside (16). 3 R= Glc6 – Glc 10 R= H 4 R= (3-O-Ac-Dig)4-Glc6-Glc 11 R= Dig4-Glc6-Glc 5 R= Cym4-Dtl4-Glc6-Glc 12 R= Glc2-Glc 6 R= Dlt4-Glc 13 R= Cym4-Glc6-Glc 7 R= Dig 14 R= Glc 8 R= Cym 15 R= Dig4-Glc 9 R= H 4 Năm 2008, từ thân hà thủ ô trắng mọc ở vùng tây nam Trung Quốc, Ahihui Liu và cộng sự đã phân lập được bảy hợp chất có cấu trúc được xác định là syringaldehyde (17), isofraxidin (18), ferulic acid (19), scopoletin (20), syringic acid (21), salicylaldehyde (22), scoparone (23) cùng với 2 hợp chất đã biết đó là β-sitosterol và daucosterol. Khi tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được ở trên, thấy rằng đa số chúng có khả năng ức chế tế bào ung thư bạch cầu HL- 60 ở người [3].
Năm 2013, từ rễ hà thủ ô trắng mọc ở vùng tây nam Trung Quốc, Jun Yin và cộng sự đã phân lập được sáu hợp chất cardenolide (24 -29) cùng với mười tám hợp chất cardenolide đã được tìm thấy trước đó. Các hợp chất phân lập được đánh giá là có tính gây độc đối với dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến giáp A549 ở người [6]. Cấu trúc của sáu hợp chất cardenolide mới được xác định là: 1𝛼,14β-dihydroxy-5β-card-20(22)- enolide-3- O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-digitalopyranoside] (24); acovenosigenin A 3-O- [O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitalopyranoside (25); 16-O-acetyl- 5 hydroxyperiplogenin-3-O-𝛽-digitoxopyranoside] (26); digitoxigenin 3-O-[O-𝛽-D- glucopyranosyl-(1-6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-2-O-acetyl-β-digitalopyranoside] (27); 16-O-acetylhydroxyacovenosigenin (28); 1β,3β,14β-trihydroxy-5β-card-16,20(22)- dienolide (29). R1 R2 R3 R4 24 α-OH Dtl2-Glc H H 25 β-OH Dtl4-Glc H 26 H Dig OH OAc 27 H (2-O-Ac-Dtl)4-Glc6- H H Glc 28 β-OH H H OAc Năm 2015, Chun Ye và cộng sự đã phân lập được mười hợp chất cardenolide từ rễ cây hà thủ ô trắng, bao gồm sáu hợp cardenolide glycoside (30-35) và bốn hợp chất (36- 39) được xem là tìm thấy lần đầu tiên trong chi Streptocaulon [2].
Cấu trúc của mười hợp chất được xác định là: periplogenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D- glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (30); periplogenin 3-O-[O- β- D-glucopyranosyl-(-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranoside] (31); acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β- D- cymaropyranoside] (32); acovenosigenin A 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β- D- glucopyranosyl-(1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (33); 16-O-acetyl- hydroxyacovenosigenin 3-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-O-β-D-glucopyranosyl- (1→4)-2-O-acetyl-β-D-digitalopyranoside] (34); acovenosigenin A 3-O-[O- β-D- 6 glucopyranosyl-(1→6) glucopyranosyl-(1-6)-O-β-D-glucopyranosyl-(1-4)-O-β-D- digitalopyranosyl-(1-4)-β-D- cymaropyranoside] (35); odoroside G (36); digitoxigenin 3-O-β-D-cellobioside (37); digitoxigenin-3-O-β-D-glucosyl-(1-4)-3-O- acetyl-β-D-digitoxoside (38); 5β-hydroxygitoxigenin (39). R1 R2 R3 R4 30 H (2-O-Ac-Dtl)4-Glc6-Glc OH H 31 H Dig4-Glc4-Glc OH H 32 OH Cym4-Glc6-Glc H H 33 OH (2-O-Ac-Dtl)4-Glc6-Glc H H 34 OH (2-O-Ac-Dtl)4-Glc6-Glc H OAc 35 OH Cym4-Dtl4-Glc6-Glc H H 36 H Dtl4-Glc6-Glc H H 37 H Glc4-Glc H H 38 H (3-O-Ac-Dig)4-Glc H H 39 H H OH OH 1.2 Các cây thuộc chi Streptocaulon Bên cạnh các nghiên cứu trên cây hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas) còn có một số nghiên cứu trên các loài cùng chi như: Streptocaulon griffithii; Streptocaulon tomentosum; Streptocaulon baumii;., phân bố chủ yếu ở các nước Myanmar, Philippines, Trung Quốc. 7 Năm 2005, từ rễ của loài S. griffithii thu hái ở tỉnh Yunnam Trung Quốc, Ma Chunhui và cộng sự đã phân lập được mười ba hợp chất gồm có periplogenin (40); periplogenin-3β-acetate (41); periplogenin 3-O-β-D-glucopyranoside ( 42); uzarigenin (43); α-amyrolacetate (44); α-amyrol tridecanoate (45); ursolic acid (46); 9,19-cyclolart-25-en-3β,24R-diol (47); 9,19-cyclolart-25-en-3β,24S-diol (48); cycloeucalenol (49); 9,19-cyclolart-23E-en-3β,25-diol (50); 25- methoxy- 9,19-cyclolart-23E-en-3β-ol (51); 11α,12α-epoxytaraxer-14-en-3β- acetate (52); cùng với 3 hợp chất là oleanolic acid (53); β-sitosterol (54); β- daucosterol (55) [7].
R1 R2 R1 R2 44 CH 3 CO CH3 40 H 𝛽-OH 45 CH 3(CH2)11CO CH3 41 CH3COO 𝛽-OH 46 H COOH 42 Glc 𝛽-OH 43 H 𝛼 -OH R1 R2 47 CH3 48 CH3 49 H 50 CH3 51 CH3 8 Năm 2017, từ rễ của loài S. griffithii thu hái ở tỉnh Guangxi, Trung Quốc, Yi- Chao Ge và cộng sự đã phân lập được ba hợp chất triterpenoid là: 28, 29-nor-3β, 4β-dihydroxyl-9, 19-cycloartan-26-acid (53), 28, 29-nor-3β, 4β- dihydroxyl-9, 19- cycloartan- 26- methylester (54), 30-nor-3β-acetoxy-lupan-20-one (55) [8]. 53 R=H (55) 54 R=CH3 Năm 2007, Từ rễ của loài S. tomentosum phân bố ở quận Mawlamyine, Myanmar, Myint Myint Khine và các cộng sự đã phân lập được một hợp chất cardenolide.
Cấu trúc của hợp chất này được xác định là pregnene-3β-16α-diol- 3- O-[2,4-O-diacetyl-β-digitalopyranosyl (1→4) -β-D-cymaropyranoside]-16-O-[β- D- glucopyranoside] (56) [9]. 9 (56) Năm 2011, Từ rễ của loài S. tomentosum sáu hợp chất cardenolide đã được phân lập bởi Luay J. Rashan và cộng sự [10].
Cấu trúc của sáu hợp chất được xác định: 17α -H- periplogenin (57), 17α-Hperiplogenin-3-O-β-D-digitoxoside (58), 17α-H-periplogenin-3-O-β-D-cymaroside (59), 17α-H-periplogenin-β- glucopyranosyl (1→4)-2-O-acetyl-β-digitalopyranoside (60), 17β-H-periplogenin- 3-O-β-D-digitoxoside (61) và 17α-H-digitoxigenin (62). R1 R2 R3 57 OH H OH 58 OH H Dig 59 OH H Cym 60 OH H Dtl4-Glc 61 OH H Dig 62 H H OH 1. Các nghiên cứu trong nước Năm 2002, Phạm Thanh Tâm và Trần Hùng nghiên cứu về tác dụng hạ lipid huyết của rễ củ hà thủ ô trắng. Các phân đoạn cao chiết được thử nghiệm trên mô hình gây tăng cholesterol huyết nội sinh và ngoài sinh trên chuột.
Kết quả cho thấy cao chiết n-butanol cho đáp ứng tốt trên mô hình này và là một tín hiệu kahr quan cho việc phân lập các thành phần có tác dụng sau này [11]. 10 Năm 2007, từ phân đoạn cao dichloromethane của rễ hà thủ ô trắng, Nguyễn Đức Tuấn và cộng sự đã phân lập được sáu hợp chất [12]. Cấu trúc của sáu hợp chất được xác định là: 17-α-periplogenin (63); 17-β-periplogenin (64); 17-α-digitoxigenin (65); 16-dehydropregnenolon (66), 5-pregnen-3,17,20-triol (67) và 𝛼-amyrin acetate (68). 70 R= (3-O-Ac-Dtl)4-Glc 71 R= Cym4-Glc 12 CHƯƠNG 2.
Hóa chất, thiết bị, phương pháp 2. Hóa chất • Dung môi: n-hexane, chloroform, ethyl acetate, acetone, methanol, ethanol, n-butanol (chemsol, Việt Nam) • Thuốc thử hiện vết trên bảng sắc ký lớp mỏng: dung dịch H2SO4 20%, hơ nóng. • Sắc ký lớp mỏng pha thường: TLC silica gel 60 F254 (250 µm, Merck, Germany) • Sắc ký lớp mỏng pha đảo: TLC RP-18 F254 (250 µm, Merck, Germany) • Sắc ký cột pha thường: silica gel 60 (40-63 μm, Merck, Germany) 2. Thiết bị • Các cột sắc ký.
• Bình triển khai sắc ký lớp mỏng.