Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu
Ung thư cổ tử cung là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến hàng đầu ở nữ giới, đứng thứ hai sau ung thư vú về tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong trên phạm vi toàn cầu. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC, Globocan 2008), toàn cầu ghi nhận khoảng 529.828 ca mắc mới và 275.128 ca tử vong mỗi năm, trong đó 86% trường hợp tập trung tại các quốc gia đang phát triển. Tại Việt Nam, số liệu thống kê ghi nhận mỗi năm có khoảng 5.174 phụ nữ được chẩn đoán mắc bệnh và 2.472 trường hợp tử vong; căn bệnh này trở thành nguyên nhân tử vong do ung thư đứng hàng thứ hai trên toàn quốc và đứng đầu tại Thành phố Hồ Chí Minh.
Tác nhân căn nguyên chủ yếu dẫn tới sự hình thành và tiến triển của ung thư cổ tử cung là virus sinh u nhú ở người (Human Papilloma Virus - HPV), đặc biệt là các chủng nguy cơ cao như HPV 16 và HPV 18 (chiếm khoảng 70% các ca bệnh). Cơ chế phân tử cho thấy hai oncoprotein E6 và E7 của virus gắn kết và làm bất hoạt các protein ức chế khối u chủ chốt của tế bào vật chủ là p53 và pRb, dẫn tới sự mất kiểm soát chu trình tế bào và phân chia mất kiểm soát. Mặc dù vậy, các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán truyền thống hiện nay vẫn bộc lộ nhiều hạn chế kỹ thuật:
- Phết tế bào cổ tử cung (Pap smear): Dễ bị ảnh hưởng bởi dịch nhầy, mủ, máu, nguy cơ phết tế bào không đều dẫn tới âm tính giả hoặc khó đọc kết quả.
- Soi cổ tử cung và sinh thiết: Đòi hỏi thiết bị chuyên dụng, bác sĩ giàu kinh nghiệm, chi phí cao và mang tính xâm lấn.
- Xét nghiệm HPV-PCR: Chỉ xác định tình trạng đang nhiễm virus chứ không phản ánh được mức độ tổn thương mô học hay giai đoạn tiến triển bệnh.
Bên cạnh yếu tố nhiễm HPV kéo dài, những biến đổi biểu sinh (epigenetics), cụ thể là hiện tượng methyl hóa bất thường tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của các gen ức chế khối u, đóng vai trò then chốt trong giai đoạn sớm của quá trình sinh ung. Sự methyl hóa quá mức làm bất hoạt quá trình phiên mã, khiến tế bào mất khả năng kiểm soát tăng sinh và tích lũy các sai hỏng di truyền. Trong đó, gen RARβ (Retinoic Acid Receptor beta) là một gen ức chế khối u quan trọng tham gia điều hòa biệt hóa và tăng trưởng tế bào biểu mô thông qua trung gian acid retinoic. Việc khảo sát sự methyl hóa vùng promoter gen RARβ hứa hẹn cung cấp một dấu chuẩn sinh học phân tử (biomarker) phục vụ sàng lọc, phát hiện sớm ung thư cổ tử cung.
Tác giả xác định ba mục tiêu nghiên cứu cụ thể:
- Thu thập thông tin về đặc điểm, cấu trúc của gen RARβ và mối tương quan về sự methyl hóa trên gen này với bệnh ung thư cổ tử cung.
- Thiết kế các cặp mồi khuếch đại đặc hiệu cho vùng khảo sát của gen trong phản ứng MSP (Methylation Specific PCR); từ đó sử dụng hệ thống mồi này để đánh giá mức độ methyl hóa gen RARβ trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung trong thực nghiệm.
- Cung cấp dữ liệu khoa học góp phần xây dựng hệ thống các gen chỉ thị liên quan đến sự methyl hóa bất thường phục vụ chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung thư.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
- Đối tượng nghiên cứu: Trình tự gen RARβ ở người (Gene ID: 5915), vùng promoter chứa các đảo CpG; 32 mẫu bệnh phẩm lâm sàng từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung (bao gồm 4 mẫu mô tươi và 28 mẫu dịch phết) do Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á cung cấp; mẫu DNA chứng methyl hóa và không methyl hóa của hãng Qiagen.
- Không gian và thời gian: Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và phòng xét nghiệm của Công ty Việt Á, hoàn thành vào tháng 08 năm 2011.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp
Khóa luận xây dựng hệ thống lý thuyết dựa trên các khái niệm di truyền học phân tử và cơ chế biến đổi biểu sinh (epigenetics) ở sinh vật nhân thực (Eukaryote):
- Hiện tượng methyl hóa DNA: Quá trình cộng hóa trị bổ sung nhóm methyl (-CH3) vào vị trí carbon số 5 của Cytosine trong cặp dinucleotide CpG thông qua sự xúc tác của các enzyme DNA methyltransferase (DNMTs gồm DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L), sử dụng S-adenosylmethionine (SAM) làm chất cho gốc methyl. Đảo CpG là vùng DNA có kích thước tối thiểu 200 bp với tỷ lệ GC > 50%, thường nằm ở đầu 5' và vùng promoter của khoảng một nửa số gen ở người. Khi đảo CpG ở vùng promoter bị methyl hóa quá mức, các yếu tố phiên mã bị ngăn cản gắn vào hoặc các protein gắn methyl-CpG (MBDs như MeCP2) sẽ huy động các phức hợp ức chế làm bất hoạt phiên mã gen.
- Biến đổi histone: Sự phối hợp giữa quá trình methyl hóa DNA và các biến đổi đầu N của phân tử histone (acetyl hóa/khử acetyl hóa bởi enzyme HAT/HDAC, methyl hóa, phosphoryl hóa) làm biến đổi cấu trúc chất nhiễm sắc, chuyển vùng biểu hiện gen thành vùng dị nhiễm sắc đóng xoắn.
- Gen RARβ và đồng phân RARβ2: Gen nằm ở vị trí cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 3 (3p24), gồm hai vùng promoter P1 và P2 điều khiển biểu hiện 4 loại mRNA (RARβ1 đến RARβ4). Dạng RARβ2 là đồng phân chủ yếu ở người, có kích thước khoảng 170 kb gồm 6 exon, mang thụ thể hạt nhân đáp ứng với acid retinoic để kích hoạt các gen điều hòa chu trình tế bào.
Hệ thống phương pháp nghiên cứu kết hợp giữa tin sinh học (in silico) và thực nghiệm sinh học phân tử (in vitro):
| Nhóm phương pháp |
Kỹ thuật / Công cụ sử dụng |
Mục đích và thông số kỹ thuật |
| Khai thác dữ liệu & Tin sinh học |
PubMed (NCBI) |
Thu thập và phân tích các nghiên cứu quốc tế về tần số methyl hóa gen RARβ trên ung thư cổ tử cung. |
|
Methprimer |
Xác định tọa độ các đảo CpG trên vùng promoter gen RARβ; hỗ trợ tính toán mồi MSP. |
|
TF SEARCH |
Dự đoán vị trí liên kết của các nhân tố phiên mã (Sp1, E2F, P300, GATA, c/EBP...) trên đảo CpG. |
|
methBLAST & BLAST (NCBI) |
Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi được thiết kế trên hệ gen đã biến đổi bisulfite. |
|
IDT OligoAnalyzer |
Đánh giá chiều dài mồi, hàm lượng GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm), cấu trúc kẹp tóc (hairpin loop) và dimer mồi. |
| Thực nghiệm sinh học phân tử |
Tách chiết DNA bằng Phenol/Chloroform |
Phá vỡ màng tế bào bằng SDS 10% và Proteinase K (20 mg/ml, ủ 48°C trong 2h); biến tính loại bỏ protein bằng phenol:chloroform (1:1); tủa DNA bằng NH4OAc 5M và ethanol tuyệt đối lạnh. |
|
Kiểm tra chất lượng DNA |
Đo quang phổ hấp thụ OD260/OD280 (chuẩn tinh sạch 1,8–2,0); điện di gel agarose 2% (80V, 30 phút); phản ứng PCR kiểm chứng với cặp mồi gen nội suy DcR1-W (DcR1 hoang dại). |
|
Biến đổi Bisulfite |
Sử dụng bộ kit EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) nhằm chuyển hóa các Cytosine không bị methyl hóa thành Uracil (sau đó thành Thymine qua PCR), giữ nguyên 5-methylcytosine. |
|
Đánh giá độ đặc hiệu mồi bằng QMSP |
Phản ứng Real-time PCR định lượng sử dụng chất phát huỳnh quang SYBR Green (SYBR PCR master mix) trên mẫu DNA chuẩn methyl hóa và không methyl hóa (Qiagen). |
|
Đánh giá mức độ methyl hóa bằng MSP |
Phản ứng PCR chuyên biệt methyl hóa thực hiện riêng rẽ với 2 cặp mồi: mồi methyl (RARβ-M, Tm 55°C) và mồi không methyl (RARβ-U, Tm 50°C), sử dụng mastermix của Việt Á và Fermentas. |
Nội dung chính theo từng chương
Phần I: Đại cương về ung thư cổ tử cung, Epigenetics và gen RARβ
Chương này trình bày tổng quan dịch tễ học bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và tại Việt Nam, nêu rõ tỷ lệ mắc và tử vong cao do bệnh diễn tiến âm thầm từ 10 đến 15 năm qua 4 giai đoạn (nhiễm HPV, tiền ung thư, ung thư tại chỗ chưa di căn, ung thư di căn). Phân tích chi tiết vai trò của 15–18 type HPV nguy cơ cao (đặc biệt là 16 và 18) cùng hoạt tính phá hủy chốt kiểm soát chu trình tế bào của protein E6 (gắn p53) và E7 (gắn pRb). Tác giả phân tích cặn kẽ ưu điểm và giới hạn của các phương pháp sàng lọc lâm sàng hiện hữu (Pap smear, soi cổ tử cung, sinh thiết, HPV-PCR) và hai loại vaccine thương mại thời điểm đó (Gardasil của Merck & Co; Cervarix của GlaxoSmithKline).
Phần tiếp theo thiết lập nền tảng lý thuyết biểu sinh học, giải thích chi tiết cấu trúc hạt nucleosome, cơ chế bổ sung nhóm methyl tại vị trí C5 của cytosine thuộc cặp dinucleotide CpG dưới sự tác động của hệ enzyme DNMTs, cùng cơ chế đối kháng chức năng giữa enzyme acetyl hóa histone (HAT) và khử acetyl histone (HDAC). Cuối cùng, chương tập trung phân tích gen RARβ, chỉ ra rằng vùng promoter P2 điều hòa đồng phân RARβ2 chứa các yếu tố đáp ứng acid retinoic (RAREs). Tác giả tổng hợp các dẫn chứng từ y văn thế giới chứng minh tình trạng methyl hóa bất thường vùng promoter gen này xuất hiện trong nhiều ung thư biểu mô, đặc biệt là ung thư cổ tử cung với tỷ lệ methyl hóa dao động từ 33% đến 66% ở giai đoạn xâm lấn.
Phần II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết nguồn vật liệu, hóa chất, thiết bị và các bước thực hiện nghiên cứu. Đối tượng mẫu lâm sàng gồm 32 mẫu bệnh phẩm (4 mẫu mô tươi bảo quản lạnh và 28 mẫu phết tế bào cổ tử cung) được lưu giữ ở -30°C trước khi chiết tách. Quy trình tách chiết DNA bằng phenol/chloroform được chuẩn hóa từng bước cho cả hai dạng mẫu mô và mẫu dịch phết. Khóa luận cung cấp các công thức hóa chất cụ thể (Tris-HCl 1M pH 8, EDTA 0,5M pH 8, NaCl 5M, SDS 10%, Proteinase K 20 mg/ml, NH4OAc 5M, cồn 70% và 100%).
Quy trình kiểm tra chất lượng DNA sau tách chiết được thực hiện nghiêm ngặt qua ba bước: đo quang phổ xác định nồng độ và tỷ số OD260/OD280, điện di trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide, và phản ứng PCR kiểm chứng với cặp mồi DcR1-W (chiều dài sản phẩm khuếch đại chuẩn) với chu trình nhiệt 40 chu kỳ (95°C trong 30 giây, 68°C trong 30 giây, 72°C trong 1 phút). Quy trình biến đổi bisulfite bằng EpiTect Bisulfite Kit được mô tả cụ thể với các chu kỳ luân nhiệt biến tính (95°C) và ủ nhiệt (60°C) kéo dài, kết thúc bằng quá trình thu hồi 40 µl dịch DNA tinh sạch trong đệm EB. Phương pháp QMSP kiểm tra độ đặc hiệu của mồi trên mẫu chứng Qiagen bằng SYBR Green được thiết lập với chu trình 40 chu kỳ ở 55°C, tiếp nối bởi phân tích đường cong nóng chảy (melting curve). Phương pháp MSP trên mẫu lâm sàng được tối ưu hóa với hai hệ kit khuếch đại (Việt Á và Fermentas).
Phần III: Kết quả và thảo luận
Nội dung chương được cấu trúc thành hai hợp phần lớn:
- Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico: Tác giả rà soát 12 công trình công bố quốc tế về tình trạng methyl hóa vùng promoter gen RARβ trên ung thư cổ tử cung, trích xuất 23 bộ số liệu để phân tích ảnh hưởng của phương pháp kỹ thuật và loại mẫu bệnh phẩm đến tần số methyl hóa phát hiện được. Về mặt tin sinh học, từ mã số Gene ID 5915, nghiên cứu xác định gen nằm trên nhiễm sắc thể 3p24, promoter chứa 2 hộp RAREs (trình tự nucleotide nhận diện GTTCAC) và hộp TATA. Sử dụng phần mềm Methprimer, tác giả phát hiện 2 đảo CpG: đảo CpG I (dài 165 bp, tọa độ từ +65 đến +214 tính từ điểm bắt đầu phiên mã) và đảo CpG II (dài 150 bp, tọa độ từ +543 đến +693). Sử dụng TF SEARCH, tác giả nhận diện nhiều vị trí gắn của các nhân tố phiên mã trọng yếu nằm trong các đảo này như Sp1, E2F, P300, GATA, AML-1A, c/EBP, CDP. Đảo CpG II được lựa chọn để thiết kế mồi MSP do chứa mật độ cao các vị trí gắn yếu tố phiên mã quan trọng. Các tiêu chí thiết kế mồi MSP được tuân thủ nghiêm ngặt: chứa tối thiểu 3 vị trí CpG trong trình tự mồi (có ít nhất một vị trí ở đầu 3'), mồi xuôi giàu Thymine, mồi ngược giàu Adenine, chênh lệch Tm giữa cặp mồi methyl (RARβ-M) và unmethyl (RARβ-U) không quá 5°C.
- Kết quả thực nghiệm: Tách chiết DNA thành công từ 32 mẫu bệnh phẩm; tỷ lệ OD260/OD280 của phần lớn các mẫu nằm trong giới hạn tinh sạch cho phép. Điện di gel agarose và phản ứng PCR với cặp mồi DcR1-W cho thấy vạch sản phẩm đặc hiệu rõ nét, khẳng định DNA thu nhận không bị đứt gãy nghiêm trọng và đủ tiêu chuẩn để xử lý bisulfite. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu mồi bằng QMSP trên mẫu chứng Qiagen (methylated control và unmethylated control) chứng minh cặp mồi RARβ-M chỉ khuếch đại mẫu DNA đã methyl hóa, cặp mồi RARβ-U chỉ khuếch đại mẫu DNA không methyl hóa, không có hiện tượng bắt chéo hay hình thành dimer mồi không đặc hiệu. Khi triển khai MSP trên các mẫu lâm sàng đã biến đổi bisulfite, phản ứng phân biệt rõ ràng trạng thái methyl hóa và không methyl hóa tại vùng promoter gen RARβ.
Phần IV: Kết luận và đề nghị
Chương này đúc kết toàn bộ kết quả đạt được từ thiết kế mồi in silico đến tối ưu hóa quy trình MSP trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng, đồng thời chỉ ra một số kiến nghị cụ thể nhằm hoàn thiện phương pháp và định hướng triển khai các nghiên cứu tiếp theo ở quy mô lâm sàng rộng hơn.
Kết quả và đóng góp
Nghiên cứu mang lại những kết quả định lượng cụ thể từ cả phân tích tổng quan dữ liệu và thực nghiệm phân tử:
Tổng hợp dữ liệu y văn quốc tế về tần số methyl hóa gen RARβ
Từ 12 công trình nghiên cứu trên bệnh nhân ung thư cổ tử cung, tác giả thu nhận và phân loại 23 tập số liệu thực nghiệm. Phân tích cho thấy QMSP là phương pháp phổ biến nhất, chiếm 47,8% (11/23 lượt nghiên cứu), theo sau là phương pháp MSP chiếm 43,4% (10/23 lượt nghiên cứu); phương pháp Nested-MSP chỉ chiếm 8,7% (2/23). Xét về nguồn mẫu, mẫu mô tươi được sử dụng nhiều nhất, chiếm 52,2% (12/23), mẫu tế bào tróc chiếm 21,7% (5/23), trong khi mẫu mô đúc paraffin, mẫu phết tế bào (Pap smear) và vệt cạo cổ tử cung chỉ chiếm từ 8,7% mỗi loại (2/23).
| Kỹ thuật phân tích |
Loại mẫu bệnh phẩm |
Giai đoạn / Dạng tổn thương |
Tần số methyl hóa gen RARβ ghi nhận |
| MSP |
Mô tươi (fresh frozen) |
Ung thư tế bào vảy (SCC) |
40% (8/20 mẫu theo nghiên cứu của Ivanova và cộng sự) |
| MSP |
Mô tươi |
Tổn thương mức độ thấp (LSIL) |
11% |
| MSP |
Dịch phết (Pap smear) |
Tổn thương mức độ thấp (LSIL) |
5% |
| MSP / QMSP |
Mô tươi / Mô đúc |
Ung thư cổ tử cung xâm lấn (ICC) |
Dao động trong khoảng 33% – 66% |
| QMSP |
Vệt cạo cổ tử cung |
Tổn thương mức độ thấp (LSIL) |
37,4% |
| QMSP |
Mô tươi |
Tổn thương mức độ thấp (LSIL) |
85% |
| MSP / QMSP |
Các loại mẫu khác nhau |
Tế bào cổ tử cung bình thường |
Biến thiên rộng, thiếu sự đồng nhất giữa các nghiên cứu |
Số liệu so sánh khẳng định tần số phát hiện methyl hóa chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi cả kỹ thuật phân tích và bản chất mẫu bệnh phẩm. Mẫu mô tươi chứa mật độ tế bào ác tính cao giúp phản ánh chính xác mức độ methyl hóa ở giai đoạn muộn, trong khi mẫu dịch phết chứa ít tế bào biến đổi nhưng có giá trị phát hiện tổn thương ở giai đoạn sớm không xâm lấn.
Kết quả khảo sát in silico và thực nghiệm
- Xác định cấu trúc promoter: Phân tích tin sinh học xác định chính xác 2 đảo CpG trên promoter gen RARβ (CpG I dài 165 bp từ +65 đến +214; CpG II dài 150 bp từ +543 đến +693). Đảo CpG II tập trung các vị trí liên kết của nhiều nhân tố phiên mã quan trọng (Sp1, E2F, P300, GATA, AML-1A, c/EBP, CDP).
- Hệ thống mồi đặc hiệu: Thiết kế thành công các cặp mồi MSP và kiểm chứng độ đặc hiệu trên hệ thống Real-time PCR (QMSP) sử dụng DNA chuẩn Qiagen. Nhiệt độ bắt cặp tối ưu được xác lập là 55°C cho cặp mồi methyl (RARβ-M) và 50°C cho cặp mồi không methyl (RARβ-U).
- Khảo sát trên bệnh phẩm lâm sàng: Tách chiết thành công DNA tinh sạch từ 32 mẫu bệnh phẩm lâm sàng (4 mẫu mô và 28 mẫu dịch phết); biến đổi bisulfite đạt chất lượng và thực hiện thành công phản ứng MSP khuếch đại phân biệt trạng thái methyl hóa của gen RARβ.
Đóng góp khoa học của đề tài:
Khóa luận đã chuẩn hóa hoàn chỉnh quy trình thực nghiệm từ khâu xử lý mẫu lâm sàng (đặc biệt là mẫu dịch phết không xâm lấn), chiết tách DNA, biến đổi bisulfite cho đến thiết kế mồi và thực hiện phản ứng MSP chuyên biệt cho gen RARβ. Đề tài cung cấp dữ liệu cơ sở thực chứng tại Việt Nam về tính khả thi của việc sử dụng mẫu dịch phết kết hợp kỹ thuật MSP để khảo sát dấu ấn biểu sinh, đóng góp trực tiếp vào mục tiêu dài hạn là xây dựng tổ hợp đa gen (panel biomarkers) phục vụ chẩn đoán sớm và theo dõi tiên lượng ung thư cổ tử cung.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Khóa luận tự chỉ ra những hạn chế thực tế trong phạm vi triển khai của đề tài:
- Hạn chế về cỡ mẫu và cơ cấu mẫu: Tổng số mẫu khảo sát còn khiêm tốn (32 mẫu bệnh phẩm), trong đó số lượng mẫu mô tươi quá ít (chỉ có 4 mẫu), trong khi mẫu dịch phết (28 mẫu) có lượng tế bào biến đổi bất thường rất thấp, gây thách thức lớn đối với độ nhạy của kỹ thuật phát hiện.
- Hạn chế về điều kiện trang thiết bị: Mặc dù phương pháp định lượng QMSP được chứng minh có độ nhạy vượt trội trong y văn, nghiên cứu chưa thể áp dụng QMSP đồng loạt trên toàn bộ mẫu lâm sàng do hạn chế về thiết bị Real-time PCR và chi phí hóa chất, buộc phải lựa chọn kỹ thuật MSP thông thường.
- Thiếu bước kiểm chứng giải trình tự: Chưa thực hiện giải trình tự nucleotide (sequencing) trực tiếp trên các sản phẩm PCR sau biến đổi bisulfite để xác nhận chính xác tuyệt đối mức độ methyl hóa tại từng vị trí nucleotide cytosine đơn lẻ.
Hướng nghiên cứu tiếp được tác giả đề xuất:
- Mở rộng quy mô khảo sát trên tập mẫu bệnh phẩm lớn hơn, phân loại chi tiết theo từng giai đoạn bệnh học lâm sàng (từ nhiễm HPV mạn tính, tổn thương tiền ung thư LSIL, HSIL đến ung thư biểu mô vảy SCC và ung thư biểu mô tuyến AC).
- Tiến hành giải trình tự chuỗi DNA sau xử lý bisulfite để đánh giá chi tiết tình trạng methyl hóa của từng vị trí CpG cụ thể trong vùng liên kết nhân tố phiên mã.
- Phối hợp khảo sát đồng thời gen RARβ với các gen ức chế khối u khác nhằm thiết lập bộ kit chẩn đoán phân tử đa gen có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên mẫu dịch phết cổ tử cung.
Giá trị tham khảo
Khóa luận tốt nghiệp này có giá trị ứng dụng và tham khảo thực tiễn rõ rệt đối với:
- Sinh viên và học viên chuyên ngành: Là tài liệu tham khảo chi tiết cho sinh viên, học viên cao học ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh - Sinh học Phân tử, Di truyền học và Y sinh học trong việc tiếp cận các kỹ thuật nghiên cứu biểu sinh học (Epigenetics).
- Người làm nghiên cứu về chỉ thị sinh học ung thư: Cung cấp tài liệu quy trình từng bước (protocol) có giá trị thực hành cao về:
- Quy trình xử lý và tách chiết DNA từ mẫu mô tươi và mẫu dịch phết cổ tử cung bằng phương pháp hóa chất truyền thống (phenol/chloroform).
- Nguyên tắc và các tiêu chí thiết kế mồi MSP chuyên biệt trên DNA đã biến đổi bisulfite (tính toán vị trí CpG ở đầu 3', hàm lượng Thymine/Adenine, bù trừ Tm giữa mồi M và mồi U).
- Phương pháp khai thác cơ sở dữ liệu tin sinh học để tìm kiếm đảo CpG (Methprimer) và vị trí gắn nhân tố phiên mã (TF SEARCH).
Câu hỏi thường gặp
1. Tại sao nghiên cứu lại chọn khảo sát gen RARβ và cụ thể là đồng phân RARβ2 trong ung thư cổ tử cung?
Gen RARβ là một gen ức chế khối u mã hóa cho thụ thể acid retinoic beta, có vai trò điều hòa quá trình biệt hóa tế bào, ức chế tăng sinh tế bào biểu mô và khởi động quá trình chết theo chương trình. Trong 4 đồng phân mRNA phiên mã từ 2 vùng promoter (P1 và P2), RARβ2 (phiên mã từ promoter P2) là dạng hiện diện chủ yếu trong tế bào biểu mô người. Khi vùng promoter của RARβ2 bị methyl hóa quá mức tại các đảo CpG, gen bị bất hoạt (im lặng hóa phiên mã), dẫn tới mất khả năng kiểm soát phân bào và tạo điều kiện tích lũy tổn thương tế bào sinh ung thư.
2. Cặp mồi DcR1 hoang dại (DcR1-W) có vai trò gì trong quy trình thực nghiệm của khóa luận?
Cặp mồi DcR1-W đóng vai trò là mồi kiểm chứng nội (internal control) để đánh giá chất lượng DNA bộ gen thu được sau quá trình tách chiết từ mẫu bệnh phẩm mô tươi và dịch phết. Việc chạy phản ứng PCR với DcR1-W và quan sát sản phẩm trên gel điện di cho phép khẳng định dịch chiết có chứa DNA bộ gen nguyên vẹn, không bị phân hủy hay ức chế enzym, qua đó đảm bảo mẫu đạt tiêu chuẩn trước khi đưa vào bước biến đổi bisulfite tiếp theo.
3. Hai đảo CpG trên vùng promoter của gen RARβ có đặc điểm và vị trí cụ thể như thế nào theo phân tích in silico?
Dựa vào công cụ tin sinh học Methprimer với số ID gen 5915 trên NCBI, tác giả xác định được hai đảo CpG ở vùng promoter gen RARβ:
- Đảo CpG I: Có chiều dài 165 bp, nằm ở tọa độ từ +65 đến +214 tính từ vị trí khởi đầu phiên mã.
- Đảo CpG II: Có chiều dài 150 bp, nằm ở tọa độ từ +543 đến +693 tính từ vị trí khởi đầu phiên mã. Đảo này chứa nhiều vị trí liên kết của các nhân tố phiên mã quan trọng như Sp1, E2F, P300, GATA, AML-1A... và được chọn làm đích để thiết kế mồi MSP.
4. Vì sao mồi unmethyl (U) thường được thiết kế có chiều dài lớn hơn mồi methyl (M) trong kỹ thuật MSP?
Trong kỹ thuật MSP trên DNA đã biến đổi bisulfite, toàn bộ cytosine không bị methyl hóa đều chuyển thành uracil và sau đó thành thymine trong chuỗi khuếch đại. Mồi unmethyl nhận diện mạch khuôn chứa nhiều thymine nên có hàm lượng GC thấp hơn so với mồi methyl (nơi các 5-methylcytosine được giữ nguyên là cytosine). Do hàm lượng GC giảm làm giảm nhiệt độ nóng chảy (Tm), mồi unmethyl phải được thiết kế dài hơn mồi methyl từ vài nucleotide để nâng giá trị Tm, giữ cho độ chênh lệch Tm giữa hai cặp mồi không vượt quá 5°C, giúp phản ứng PCR diễn ra ổn định ở nhiệt độ bắt cặp tương thích.
5. Sự khác biệt giữa mẫu mô tươi và mẫu dịch phết ảnh hưởng thế nào đến việc phát hiện mức độ methyl hóa?
Mẫu mô tươi lấy trực tiếp từ vùng tổn thương nghi ngờ ác tính nên có mật độ tế bào ung thư và tế bào dị sản rất cao, cho phép thu nhận DNA chất lượng với nồng độ cao và phản ánh chính xác tình trạng methyl hóa ở giai đoạn tiến triển. Ngược lại, mẫu dịch phết (Pap smear) thu nhận bằng tăm bông chứa chủ yếu là tế bào biểu mô bong tróc bình thường, số lượng tế bào mang biến đổi bất thường rất ít, làm cho nồng độ DNA mục tiêu thấp và đòi hỏi kỹ thuật phân tích phải có độ nhạy rất cao; tuy nhiên, mẫu dịch phết lại có ưu thế không xâm lấn, phù hợp cho mục tiêu sàng lọc sớm trong cộng đồng.
Kết luận
Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Thị Thúy An đã hoàn thành việc khảo sát cấu trúc promoter và các đảo CpG của gen ức chế khối u RARβ thông qua công cụ tin sinh học, thiết kế thành công hệ thống mồi MSP đặc hiệu cho vùng CpG II giàu vị trí liên kết nhân tố phiên mã. Công trình đã chuẩn hóa quy trình thực nghiệm từ tách chiết DNA bệnh phẩm, biến đổi bisulfite bằng EpiTect Bisulfite Kit đến kiểm tra độ đặc hiệu mồi bằng QMSP trên mẫu chứng và ứng dụng kỹ thuật MSP trên 32 mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Kết quả đạt được cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng, khẳng định tiềm năng ứng dụng của kỹ thuật khảo sát mức độ methyl hóa gen RARβ trên mẫu dịch phết không xâm lấn hướng tới tầm soát và chẩn đoán sớm ung thư cổ tử cung.
