Nghiên Cứu Đột Biến Gen EGFR Trong Huyết Tương Bệnh Nhân Ung Thư Phổi

Luận án tiến sĩ sinh học đánh giá giá trị chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn IIIB và IV qua xét nghiệm đột biến gen EGFR.

• Tác giả: Phan Thanh Thăng
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Trường Sơn
• Trường học: Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen EGFR Trong Huyết Tương Bệnh Nhân Ung Thư Phổi
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ
• 1.2. ĐỘT BIẾN EGFR VÀ VAI TRÒ CỦA XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN EGFR TRONG CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ UTPKTBN
• 2. CHƯƠNG 2: XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG VÀ NHỮNG THÁCH THỨC TRÊN LÂM SÀNG
• 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT, SINH PHẨM
• 2.3. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN GIÁ TRỊ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN CỦA XÉT NGHIỆM EGFR HUYẾT TƯƠNG TRONG UTPKTBN
• 3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA UTPKTBN LÚC PHÁT HIỆN BỆNH
• 3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT GDNA VÀ CFDNA
• 3.3. TỶ LỆ ĐỘT BIẾN EGFR TRONG MẪU MÔ VÀ HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN UTPKTBN MỚI CHẨN ĐOÁN
• 3.4. ĐỘT BIẾN EGFR TRONG MẪU MÔ VÀ HUYẾT TƯƠNG THEO PHÂN NHÓM ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ CẬN LÂM SÀNG
• 3.5. GIÁ TRỊ XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN CỦA XÉT NGHIỆM EGFR HUYẾT TƯƠNG SO VỚI PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG MẪU MÔ
• 3.6. THEO DÕI ĐIỀU TRỊ VỚI EGFR TKI THẾ HỆ MỘT BẰNG XÉT NGHIỆM EGFR HUYẾT TƯƠNG
• 3.6.1. ĐẶC ĐIỂM BỆNH NHÂN UTPKTBN ĐIỀU TRỊ VỚI EGFR TKI
• 3.6.2. CHI TIẾT ĐIỀU TRỊ VÀ TÌNH TRẠNG DI CĂN CÁC CƠ QUAN
• 3.6.3. TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG CỦA 16 TRƯỜNG HỢP NHÓM A
• 3.6.4. TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG CỦA 89 TRƯỜNG HỢP NHÓM B
• 3.6.5. TỶ LỆ ĐỘT BIẾN EGFRTMTM THỨ PHÁT TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN KHÁNG TRỊ
• 3.7. TIÊN LƯỢNG SỐNG CÒN CHO BỆNH NHÂN UTPKTBN BẰNG XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN EGFR HUYẾT TƯƠNG
• 3.7.1. THỜI GIAN SỐNG CÒN CỦA TẤT CẢ TRƯỜNG HỢP
• 3.7.2. THỜI GIAN SỐNG CÒN THEO ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG
• 3.7.3. THỜI GIAN SỐNG CÒN THEO ĐẶC ĐIỂM DI CĂN TRƯỚC ĐIỀU TRỊ
• 3.7.4. THỜI GIAN SỐNG CÒN THEO LOẠI THUỐC EGFR TKI VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ
• 3.7.5. THỜI GIAN SỐNG CÒN THEO ĐẶC ĐIỂM DI CĂN MỚI VÀ KÍCH THƯỚC U SAU ĐIỀU TRỊ
• 3.7.6. THỜI GIAN SỐNG CÒN THEO KIỂU ĐỘT BIẾN VÀ TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN EGFR TRONG HUYẾT TƯƠNG TRƯỚC ĐIỀU TRỊ
• 3.7.7. THỜI GIAN SỐNG CÒN THEO TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN EGFR TRONG HUYẾT TƯƠNG SAU ĐIỀU TRỊ
• 3.8. MÔ HÌNH DỰ BÁO KHÁNG TRỊ VỚI EGFR TKI THẾ HỆ MỘT VÀ TIÊN LƯỢNG TỬ VONG SỚM
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• CÁC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đột Biến Gen EGFR Ung Thư Phổi

Ung thư phổi, đặc biệt là ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC), là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư trên toàn thế giới. Đột biến gen EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của bệnh. Việc xác định đột biến EGFR trong huyết tương bệnh nhân ung thư phổi có ý nghĩa to lớn trong việc lựa chọn phương pháp điều trị ung thư phổi phù hợp, đặc biệt là các liệu pháp nhắm trúng đích. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá giá trị của xét nghiệm đột biến gen EGFR trong huyết tương bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ, từ đó đưa ra những ứng dụng thực tiễn trong lâm sàng. Nghiên cứu này được thực hiện tại Bệnh viện Chợ Rẫy, một trong những trung tâm điều trị ung thư hàng đầu tại Việt Nam, với sự tham gia của các chuyên gia hàng đầu trong lĩnh vực ung thư phổi và sinh học phân tử.

1.1. Vai Trò Của Đột Biến EGFR Trong Ung Thư Phổi NSCLC

Đột biến gen EGFR là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy sự phát triển của ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC). Các đột biến này thường gặp ở exon 19 (del19) và exon 21 (L858R), làm tăng hoạt tính của thụ thể EGFR, dẫn đến sự tăng sinh tế bào không kiểm soát. Việc xác định chính xác loại đột biến EGFR giúp bác sĩ lựa chọn thuốc điều trị ung thư phổi nhắm trúng đích phù hợp, mang lại hiệu quả điều trị cao hơn so với các phương pháp truyền thống như hóa trị.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Xét Nghiệm Đột Biến EGFR Huyết Tương

Xét nghiệm đột biến EGFR trong huyết tương, hay còn gọi là sinh thiết lỏng (liquid biopsy), là một phương pháp không xâm lấn giúp phát hiện các đột biến gen EGFR mà không cần phải thực hiện sinh thiết mô phổi. Điều này đặc biệt quan trọng đối với những bệnh nhân không thể thực hiện sinh thiết mô hoặc khi cần theo dõi sự thay đổi của đột biến EGFR trong quá trình điều trị ung thư phổi. Sinh thiết lỏng cung cấp thông tin quan trọng về tình trạng đột biến của bệnh nhân, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và chính xác.

II. Thách Thức Sinh Thiết Mô Giải Pháp Xét Nghiệm EGFR

Sinh thiết mô phổi, mặc dù là tiêu chuẩn vàng để xác định đột biến gen EGFR, vẫn tồn tại nhiều hạn chế. Quá trình này xâm lấn, có thể gây ra các biến chứng cho bệnh nhân, và không phải lúc nào cũng thực hiện được do vị trí khối u khó tiếp cận hoặc tình trạng sức khỏe của bệnh nhân không cho phép. Ngoài ra, sinh thiết mô chỉ phản ánh tình trạng đột biến tại một thời điểm nhất định và có thể không đại diện cho toàn bộ khối u do tính không đồng nhất của khối u. Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương nổi lên như một giải pháp thay thế tiềm năng, giúp khắc phục những hạn chế của sinh thiết mô và cung cấp thông tin toàn diện hơn về tình trạng đột biến của bệnh nhân.

2.1. Hạn Chế Của Sinh Thiết Mô Trong Xác Định Đột Biến EGFR

Sinh thiết mô phổi là một thủ thuật xâm lấn, tiềm ẩn nguy cơ gây ra các biến chứng như tràn khí màng phổi, chảy máu, hoặc nhiễm trùng. Ngoài ra, việc lấy mẫu sinh thiết có thể không đại diện cho toàn bộ khối u do sự không đồng nhất về mặt di truyền giữa các vùng khác nhau của khối u. Điều này có thể dẫn đến kết quả âm tính giả, bỏ sót các đột biến EGFR quan trọng và ảnh hưởng đến quyết định điều trị.

2.2. Ưu Điểm Của Xét Nghiệm EGFR Huyết Tương Liquid Biopsy

Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương (liquid biopsy) là một phương pháp không xâm lấn, an toàn và dễ thực hiện hơn so với sinh thiết mô. Phương pháp này cho phép theo dõi sự thay đổi của đột biến EGFR trong quá trình điều trị ung thư phổi, giúp bác sĩ đánh giá hiệu quả điều trị và đưa ra quyết định điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời. Liquid biopsy cũng có thể phát hiện các đột biến kháng thuốc EGFR, chẳng hạn như T790M, giúp bác sĩ lựa chọn các liệu pháp điều trị thay thế phù hợp.

III. Phương Pháp Phát Hiện Đột Biến EGFR Trong Huyết Tương

Có nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến gen EGFR trong huyết tương, bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) và kỹ thuật NGS (Next-Generation Sequencing). Kỹ thuật PCR thường được sử dụng để phát hiện các đột biến EGFR phổ biến như exon 19 deletion và L858R, trong khi kỹ thuật NGS có thể phát hiện nhiều loại đột biến khác nhau, bao gồm cả các đột biến hiếm gặp và đột biến kháng thuốc. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu, nguồn lực và trang thiết bị sẵn có.

3.1. Kỹ Thuật PCR Polymerase Chain Reaction Trong Xét Nghiệm

Kỹ thuật PCR là một phương pháp khuếch đại DNA nhanh chóng và hiệu quả, cho phép phát hiện các đột biến EGFR với độ nhạy cao. Các biến thể của kỹ thuật PCR, chẳng hạn như ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System PCR), được sử dụng rộng rãi để phát hiện các đột biến EGFR phổ biến như exon 19 deletion và L858R. Kỹ thuật PCR có ưu điểm là nhanh chóng, đơn giản và chi phí thấp hơn so với kỹ thuật NGS.

3.2. Kỹ Thuật NGS Next Generation Sequencing Trong Xét Nghiệm

Kỹ thuật NGS là một phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới, cho phép phân tích đồng thời nhiều gen và vùng gen khác nhau. Kỹ thuật NGS có thể phát hiện nhiều loại đột biến EGFR, bao gồm cả các đột biến hiếm gặp và đột biến kháng thuốc, với độ chính xác cao. Kỹ thuật NGS cung cấp thông tin toàn diện về tình trạng đột biến của bệnh nhân, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị cá nhân hóa.

IV. Ứng Dụng Xét Nghiệm EGFR Huyết Tương Trong Điều Trị

Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương có nhiều ứng dụng quan trọng trong điều trị ung thư phổi, bao gồm: (1) Lựa chọn bệnh nhân phù hợp với liệu pháp nhắm trúng đích EGFR-TKI; (2) Theo dõi đáp ứng điều trị và phát hiện kháng thuốc EGFR; (3) Tiên lượng bệnh và dự đoán khả năng sống còn. Việc sử dụng xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương giúp tối ưu hóa hiệu quả điều trị và cải thiện kết quả lâm sàng cho bệnh nhân ung thư phổi.

4.1. Lựa Chọn Bệnh Nhân Điều Trị EGFR TKI Phù Hợp

Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương giúp xác định những bệnh nhân có đột biến EGFR nhạy cảm với các thuốc ức chế tyrosine kinase (EGFR-TKI), chẳng hạn như gefitinib, erlotinib, và afatinib. Việc sử dụng EGFR-TKI ở những bệnh nhân có đột biến EGFR giúp cải thiện đáng kể thời gian sống thêm không tiến triển bệnh (PFS) và thời gian sống thêm toàn bộ (OS) so với hóa trị.

4.2. Theo Dõi Đáp Ứng Điều Trị Phát Hiện Kháng Thuốc

Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương có thể được sử dụng để theo dõi đáp ứng điều trị với EGFR-TKI. Sự giảm nồng độ ctDNA (circulating tumor DNA) mang đột biến EGFR trong huyết tương thường cho thấy bệnh nhân đáp ứng tốt với điều trị. Ngược lại, sự tăng nồng độ ctDNA hoặc sự xuất hiện của các đột biến kháng thuốc EGFR, chẳng hạn như T790M, có thể báo hiệu sự tiến triển của bệnh và cần thay đổi phác đồ điều trị.

V. Kết Quả Nghiên Cứu Giá Trị Xét Nghiệm EGFR Huyết Tương

Nghiên cứu này đã chứng minh giá trị của xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương trong việc xác định đột biến EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương tương đương với sinh thiết mô, đặc biệt trong việc phát hiện các đột biến EGFR phổ biến như exon 19 deletion và L858R. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương có thể được sử dụng để theo dõi đáp ứng điều trị và phát hiện kháng thuốc EGFR, giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời và chính xác.

5.1. Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Xét Nghiệm EGFR Huyết Tương

Nghiên cứu cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương trong việc phát hiện các đột biến EGFR phổ biến là tương đương với sinh thiết mô. Điều này chứng tỏ rằng xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương là một phương pháp đáng tin cậy để xác định đột biến EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi.

5.2. Ứng Dụng Trong Theo Dõi Đáp Ứng Điều Trị Và Kháng Thuốc

Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương có thể được sử dụng để theo dõi đáp ứng điều trị với EGFR-TKI và phát hiện kháng thuốc EGFR. Sự thay đổi nồng độ ctDNA mang đột biến EGFR trong huyết tương có thể phản ánh hiệu quả điều trị và giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều chỉnh phác đồ điều trị kịp thời.

VI. Tương Lai Nghiên Cứu Ứng Dụng Xét Nghiệm EGFR Huyết Tương

Trong tương lai, xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong điều trị ung thư phổi. Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm, cũng như phát triển các phương pháp mới để phát hiện các đột biến hiếm gặp và đột biến kháng thuốc. Ngoài ra, cần có thêm các nghiên cứu để đánh giá hiệu quả của việc sử dụng xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương trong việc lựa chọn phác đồ điều trị cá nhân hóa cho bệnh nhân ung thư phổi.

6.1. Cải Thiện Độ Nhạy Và Độ Đặc Hiệu Của Xét Nghiệm

Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương để phát hiện các đột biến với độ chính xác cao hơn. Điều này có thể đạt được bằng cách sử dụng các kỹ thuật mới, chẳng hạn như digital PCR và droplet digital PCR, hoặc bằng cách kết hợp xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương với các xét nghiệm khác, chẳng hạn như xét nghiệm protein.

6.2. Phát Triển Phương Pháp Phát Hiện Đột Biến Kháng Thuốc Mới

Việc phát triển các phương pháp mới để phát hiện các đột biến kháng thuốc EGFR, chẳng hạn như T790M và C797S, là rất quan trọng để lựa chọn các liệu pháp điều trị thay thế phù hợp cho bệnh nhân ung thư phổi. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào việc phát triển các xét nghiệm có thể phát hiện đồng thời nhiều loại đột biến kháng thuốc khác nhau.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ sinh học của nghiên cứu sinh Phan Thanh Thắng với đề tài "Đánh giá giá trị chẩn đoán và theo dõi điều trị trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn IIIB và IV bằng xét nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương" được thực hiện thuộc chuyên ngành Sinh lý học người và động vật (mã số: 62420104) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Trường Sơn và TS. Trần Bích Thư.

Tính cấp thiết của luận án xuất phát từ thực trạng ung thư phổi là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) chiếm 85–90% tổng số các ca ung thư phổi nguyên phát, trong đó khoảng 80% bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn tiến xa (giai đoạn IIIB và IV) với tiên lượng sống thêm trung bình chỉ khoảng 12 tháng nếu không có can thiệp trúng đích phù hợp. Liệu pháp ức chế hoạt tính tyrosine kinase của thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR TKI) thế hệ một (gefitinib, erlotinib) mang lại bước tiến quan trọng cho phân nhóm bệnh nhân mang đột biến EGFR nhạy thuốc (mất đoạn exon 19 - E19del hoặc đột biến điểm L858R tại exon 21). Tiêu chuẩn vàng để chỉ định điều trị là xét nghiệm đột biến gen trên mẫu mô sinh thiết.

Khoảng trống nghiên cứu và rào cản lâm sàng được tác giả chỉ rõ bao gồm:

• Rào cản sinh thiết ban đầu: Tỷ lệ thất bại kỹ thuật của thủ thuật sinh thiết mô phổi khoảng 20%; nhiều bệnh nhân tuổi cao, thể trạng suy kiệt, suy giảm chức năng tim mạch, hô hấp hoặc khối u nằm ở vị trí nguy hiểm không thể thực hiện sinh thiết mô đặc. Ngoài ra, thể tích mẫu mô thu nhận được thường quá nhỏ, không đủ số lượng tế bào khối u phục vụ phân tích phân tử.
• Rào cản sinh thiết lại khi kháng thuốc: Sau 8–14 tháng điều trị EGFR TKI thế hệ một, hầu hết bệnh nhân tiến triển kháng thuốc, chủ yếu do đột biến thứ phát T790M ở exon 20. Việc chỉ định EGFR TKI thế hệ ba (osimertinib) đòi hỏi bắt buộc phải xác định được đột biến T790M. Tuy nhiên, sinh thiết lại mô đặc đối mặt nguy cơ tai biến cao, khó xác định thời điểm can thiệp tối ưu, và bị sai lệch do tính không đồng nhất của khối u (tumor heterogeneity).
• Khoảng trống dữ liệu tại Việt Nam: Tính đến thời điểm nghiên cứu (năm 2021), các công bố về xét nghiệm EGFR huyết tương (sinh thiết lỏng qua cfDNA/ctDNA) trong nước còn rất hạn chế, hoàn toàn chưa có báo cáo hệ thống nào đánh giá vai trò của kỹ thuật này trong việc theo dõi dọc đáp ứng điều trị với EGFR TKI thế hệ một và xây dựng mô hình tiên lượng sống còn cho bệnh nhân UTPKTBN.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể gồm 3 mục tiêu:

1. Đánh giá khả năng thay thế cho xét nghiệm EGFR trên mẫu mô bằng xét nghiệm EGFR huyết tương.
2. Đánh giá vai trò của xét nghiệm EGFR huyết tương trong theo dõi điều trị với EGFR TKI thế hệ một; và khả năng phát hiện được đột biến EGFR T790M thứ phát khi bệnh nhân kháng trị.
3. Đánh giá vai trò của xét nghiệm EGFR huyết tương trong tiên lượng bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ khi điều trị với EGFR TKI thế hệ một.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến xa (giai đoạn IIIB và IV theo phân loại TNM 7), được chẩn đoán xác định mô bệnh học và có chỉ định xét nghiệm đột biến gen EGFR. Nghiên cứu thực hiện thu thập song song hai loại mẫu bệnh phẩm: mẫu mô đúc khối paraffin (FFPE) hoặc mô sinh thiết tươi và mẫu huyết tương tách chiết từ máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
• Địa điểm và thời gian thực hiện: Nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng Nghiên cứu Y sinh học và Hội đồng Khoa học cấp Cơ sở Bệnh viện Chợ Rẫy; thực hiện tại Đơn vị Sinh học phân tử - Di truyền, Đơn vị xét nghiệm D và Trung tâm Ung bướu Bệnh viện Chợ Rẫy, phối hợp cùng Bộ môn Sinh lý học người và động vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, hoàn thành bảo vệ năm 2021.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các dữ liệu dịch tễ học, cơ chế phân tử và các thử nghiệm lâm sàng lớn trên thế giới cũng như tại Việt Nam:

• Dữ liệu dịch tễ học: Luận án dẫn chứng số liệu GLOBOCAN 2018 của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ghi nhận toàn cầu có 2,1 triệu ca ung thư phổi mắc mới (chiếm 11,6%) và 1,76 triệu ca tử vong (chiếm 18,4%); tại Việt Nam ghi nhận 23,7 ngàn ca mắc mới và 20,7 ngàn ca tử vong, tỷ lệ mắc chuẩn là 21,7 người/100 ngàn dân. Tác giả trích dẫn các tài liệu kinh điển xác định hút thuốc lá là nguyên nhân của 85–90% các trường hợp mắc bệnh, làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi gấp 50 lần.
• Đột biến driver và khác biệt chủng tộc: Phân tích tần suất các đột biến gen khởi phát (driver mutations) trong UTPKTBN cho thấy sự khác biệt rõ nét theo chủng tộc. Đột biến gen EGFR chiếm ưu thế vượt trội ở quần thể Đông Á (carcinôm tuyến, giới nữ, không hút thuốc lá) so với người da trắng. Nghiên cứu của Hoàng Anh Vũ và cộng sự công bố tỷ lệ đột biến EGFR tại Việt Nam là 40,7%; đồng thời tác giả Phan Thanh Thắng và cộng sự từng ghi nhận tỷ lệ tương đồng 40,2% trên cỡ mẫu 1.548 trường hợp UTPKTBN tại Bệnh viện Chợ Rẫy.
• Lịch sử phát triển liệu pháp nhắm trúng đích EGFR: Nghiên cứu của Mendelsohn từ thập niên 1980 đặt nền móng phong bế thụ thể EGFR. Các phát hiện mang tính bản lề năm 2004 của nhóm tác giả Thomas J. Lynch, Guillermo Paez và William Pao đã chứng minh cơ chế đột biến kích hoạt domain tyrosine kinase của gen EGFR quyết định mức độ nhạy cảm với gefitinib. Luận án tổng kết dữ liệu các thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên pha III (IPASS, OPTIMAL, EURTAC) chứng minh EGFR TKI thế hệ 1 nâng tỷ lệ đáp ứng lên 62–83% và kéo dài thời gian sống không tiến triển bệnh (PFS) lên 9,2–13,1 tháng so với hóa trị bộ đôi chứa platin (đáp ứng 15–22%, PFS 3,1–4,5 tháng).
• Vấn đề kháng thuốc và sinh thiết lỏng: Luận án điểm lại các công trình về cơ chế kháng thuốc thứ phát, nổi bật là đột biến điểm T790M ở exon 20 làm tăng ái lực của EGFR với ATP, chiếm khoảng 50–60% các trường hợp thất bại điều trị TKI thế hệ một. Tác giả dẫn chứng thử nghiệm FASTACT-2 chứng minh tình trạng thanh thải đột biến EGFR trong huyết tương sau chu kỳ điều trị tương quan thuận với thời gian PFS và sống còn toàn bộ (OS). Luận án cũng đối chiếu hướng dẫn điều trị của Hiệp hội Ung thư Lâm sàng Châu Âu (ESMO) trong việc phân tầng xử trí bệnh nhân tiến triển bệnh.

Vị trí của luận án: Luận án giải quyết khoảng trống thực nghiệm tại lâm sàng Việt Nam: đánh giá toàn diện giá trị đối chứng của xét nghiệm EGFR huyết tương so với mẫu mô bằng kỹ thuật scorpion ARMS PCR; xác định tỷ lệ xuất hiện đột biến T790M thứ phát trong máu ngoại vi ở nhóm bệnh nhân kháng thuốc; và ứng dụng mô hình trung bình hóa Bayes (Bayesian Model Averaging - BMA) để lượng hóa giá trị tiên lượng độc lập của động học đột biến huyết tương đối với PFS và OS.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và các khái niệm sinh học phân tử

• Cấu trúc và con đường truyền tín hiệu của EGFR: Thụ thể EGFR thuộc họ ErbB, là protein xuyên màng gồm 3 domain (ngoại bào tương tác ligand, xuyên màng và nội bào mang hoạt tính tyrosine kinase gồm vùng xúc tác A và vùng gắn ATP P). Khi phối tử (EGF, TGF-alpha) liên kết, thụ thể homodimer hóa, tự phosphoryl hóa domain nội bào và kích hoạt 3 trục truyền tín hiệu nội bào quan trọng: RAS/RAF/MEK/ERK (thúc đẩy tăng sinh), PI3K/AKT (ức chế chết theo chương trình apoptosis) và JAK/STAT.
• Đột biến gen EGFR: Phân bố chủ yếu từ exon 18 đến exon 21 (vùng mã hóa tyrosine kinase). Đột biến nhạy thuốc phổ biến nhất là mất đoạn tại exon 19 (E19del chiếm 45%) và đột biến điểm thay thế Leucine bằng Arginine tại codon 858 ở exon 21 (L858R chiếm 40–45%). Đột biến kháng thuốc kinh điển gồm T790M tại exon 20 (thay thế Threonine bằng Methionine tại codon 790).
• Bản chất của cfDNA và ctDNA: cfDNA (circulating free DNA) là các đoạn DNA tự do lưu hành trong máu ngoại vi giải phóng từ tế bào bình thường hoặc hoại tử/apoptosis; ctDNA (circulating tumor DNA) là phần DNA mang đột biến có nguồn gốc trực tiếp từ khối u.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và công cụ phân tích

Luận án áp dụng thiết kế nghiên cứu quan sát tiến cứu kết hợp cắt ngang mô tả và theo dõi dọc đoàn hệ lâm sàng:

1. Thu nhận mẫu và xử lý tiền phân tích:
   • Mẫu mô: Mô sinh thiết phẫu thuật hoặc kim lõi, xử lý cố định formalin và đúc khối paraffin (FFPE), kiểm tra mật độ tế bào u qua lát cắt nhuộm H&E.
   • Mẫu huyết tương: Thu nhận máu toàn phần vào ống chứa chất chống đông EDTA, ly tâm phân đoạn 2 lần trong vòng 2–4 giờ sau lấy máu để loại bỏ tế bào máu, bảo quản huyết tương ở nhiệt độ -80°C.
2. Quy trình tách chiết DNA:
   • Tách chiết gDNA từ mô: Sử dụng bộ kit thương mại QIAamp DNA FFPE Tissue Kit.
   • Tách chiết cfDNA từ huyết tương: Sử dụng hệ thống QIAvac-24 hỗ trợ hút chân không cho thể tích mẫu lớn (từ 2–5 mL huyết tương) hoặc quy trình tự động hóa trên máy QIAsymphony sử dụng hạt từ tính bọc silica. Nồng độ cfDNA được chuẩn hóa bằng đường chuẩn PCR định lượng.
3. Kỹ thuật phân tích đột biến:
   • Kỹ thuật Pyrosequencing: Áp dụng trên mẫu mô để giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR gắn hạt từ streptavidin, xác định các giá trị ngưỡng nền (Limit of Blank - LOB) và ngưỡng phát hiện (Limit of Detection - LOD) cho từng kiểu đột biến (độ nhạy phát hiện khoảng 3–5%).
   • Kỹ thuật Scorpion ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System): Áp dụng cho cả mẫu mô và mẫu huyết tương (kit Therascreen EGFR RGQ PCR Kit trên hệ thống Rotor-Gene Q). Phương pháp dựa trên độ đặc hiệu của mồi ARMS kết hợp phân tử dò Scorpion, xác định đột biến thông qua ngưỡng chu kỳ delta Ct ($\Delta$Ct = Ct mẫu đột biến - Ct mẫu chứng nội suy kiểm soát) theo hướng dẫn nhà sản xuất. Độ nhạy phân tích đạt 0,1–1%.
4. Đánh giá đáp ứng lâm sàng và theo dõi:
   • Thang điểm tổng trạng ECOG PS (0 đến 4 điểm).
   • Đánh giá đáp ứng điều trị khối u theo tiêu chuẩn RECIST phiên bản 1.1 (CR: đáp ứng hoàn toàn, PR: đáp ứng một phần, SD: bệnh ổn định, PD: bệnh tiến triển).

Hạng mục kỹ thuật / Thông số	Quy trình thực hiện trên mẫu mô	Quy trình thực hiện trên mẫu huyết tương
Loại bệnh phẩm	Mô sinh thiết đúc khối paraffin (FFPE)	Máu ngoại vi kháng đông EDTA (2 lần ly tâm)
Phương pháp tách chiết	Cột lọc silica (QIAamp DNA FFPE Tissue)	Hạt từ tính tự động (QIAsymphony) / QIAvac-24
Kỹ thuật phân tích gen	Pyrosequencing và Scorpion ARMS PCR	Scorpion ARMS PCR
Độ nhạy phân tích	3–5% (Pyrosequencing); 0,1–1% (ARMS)	0,1–1% (ngưỡng cắt $\Delta$Ct chuẩn hóa)
Mục tiêu phát hiện	E19del, L858R, T790M, G719X, S768I	E19del, L858R, T790M thứ phát

Phương pháp phân tích số liệu thống kê

• Tính toán độ nhạy (Sensitivity), độ đặc hiệu (Specificity), giá trị dự báo dương tính (PPV), giá trị dự báo âm tính (NPV) và độ tương đồng (Concordance rate) của xét nghiệm EGFR huyết tương, lấy kết quả mẫu mô làm tiêu chuẩn đối chứng.
• Phân tích sống còn không tiến triển bệnh (PFS) và sống còn toàn bộ (OS) theo phương pháp Kaplan-Meier, kiểm định sai khác giữa các đường cong bằng Log-rank test.
• Sử dụng mô hình hồi quy đa biến Bayes (Bayesian Model Averaging - BMA) dựa trên Tiêu chí thông tin Bayes (Bayesian Information Criterion - BIC) để lựa chọn mô hình tối ưu dự báo biến cố kháng trị sớm và nguy cơ tử vong sớm, hạn chế hiện tượng quá khớp (overfitting) của các kiểm định đa biến truyền thống.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này gồm 3 phân đoạn chính bao quát toàn diện các khía cạnh bệnh học và phân tử:

• Tổng quan về UTPKTBN: Cung cấp bức tranh toàn cảnh về dịch tễ học, yếu tố nguy cơ (khói thuốc lá, phơi nhiễm radon 222, amiăng, tiền sử lao phổi). Hệ thống hóa các phương pháp chẩn đoán hình ảnh từ X-quang, CT-Scanner, PET-CT đến MRI; dấu ấn protein huyết thanh (CYFRA 21-1, CEA, CA-125, NSE) với độ nhạy độc lập còn thấp; các dấu ấn hóa mô miễn dịch thiết yếu (TTF1, CK7, Napsin A, P63, CK5/6) giúp phân biệt carcinôm tuyến và carcinôm tế bào gai. Phân tích chi tiết các liệu pháp điều trị toàn thân: phẫu thuật, xạ trị, hóa trị bộ đôi platin, liệu pháp miễn dịch kháng trục PD-1/PD-L1 (nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab), kháng CTLA-4 và triển vọng liệu pháp gen.
• Đột biến EGFR và vai trò của xét nghiệm đột biến gen trong UTPKTBN: Trình bày chi tiết cấu trúc phân tử của EGFR gồm 28 exon trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 7 (7p11). Phân loại phổ đột biến từ exon 18 đến exon 21, phân biệt nhóm đột biến nhạy thuốc (E19del, L858R, G719X) và nhóm đột biến kháng thuốc (T790M, chèn đoạn exon 20). Phân tích hiệu quả lâm sàng của các thế hệ EGFR TKI: thế hệ 1 (gefitinib, erlotinib), thế hệ 2 gắn cộng hóa trị không thuận nghịch (afatinib) và thế hệ 3 ức chế chọn lọc đột biến T790M (osimertinib). Khái quát hiện tượng kháng thuốc sau 8–14 tháng và những rào cản kỹ thuật nghiêm trọng của sinh thiết mô đặc.
• Xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương và thách thức lâm sàng: Khái quát nguồn gốc sinh học của cfDNA/ctDNA giải phóng qua các cơ chế apoptosis, hoại tử khối u và bài tiết chủ động. Tổng kết các nền tảng kỹ thuật định lượng ctDNA (Direct sequencing, Pyrosequencing, Scorpion ARMS, Cobas, ddPCR, BEAMing, NGS) kèm theo giới hạn LOD. Nhấn mạnh việc thiếu vắng quy trình tiền phân tích chuẩn hóa toàn cầu và sự cần thiết phải xác lập độ tin cậy của sinh thiết lỏng tại các cơ sở điều trị ung bướu tại Việt Nam.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết thiết kế nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng:

• Đối tượng: Thu nhận bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB và IV tại Bệnh viện Chợ Rẫy. Tiêu chuẩn chọn mẫu rõ ràng: có chẩn đoán mô bệnh học xác định, có đầy đủ mẫu mô và mẫu máu ngoại vi tương ứng trước điều trị, có hồ sơ theo dõi lâm sàng và cận lâm sàng liên tục. Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân mắc kèm ung thư thứ hai, mẫu mô không đạt mật độ tế bào u tối thiểu hoặc mẫu huyết tương bị tán huyết nặng.
• Vật liệu và phương pháp: Quy trình khoanh vùng mô u trên tiêu bản cố định; chi tiết hóa các bước tách chiết gDNA bằng kit silica và cfDNA bằng hệ thống QIAvac-24 cùng máy tự động QIAsymphony. Thiết lập đường chuẩn PCR định lượng để đánh giá nồng độ cfDNA huyết tương. Thiết kế hệ thống cặp mồi và đầu dò đặc hiệu cho kỹ thuật Pyrosequencing và Scorpion ARMS PCR. Xác lập giá trị ngưỡng cắt $\Delta$Ct cho từng loại đột biến theo khuyến cáo hệ thống therascreen.
• Phân nhóm theo dõi dọc: Thiết lập nhóm A gồm 16 bệnh nhân được lấy mẫu huyết tương định kỳ trước điều trị và tại các mốc sau điều trị EGFR TKI thế hệ một để đánh giá động thái thanh thải ctDNA; nhóm B gồm 89 bệnh nhân đã điều trị EGFR TKI thế hệ một tiến triển kháng thuốc, được chỉ định lấy mẫu huyết tương để tìm đột biến kháng thuốc thứ phát T790M.
• Đạo đức nghiên cứu: Đề tài tuân thủ chặt chẽ Tuyên bố Helsinki, được Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Bệnh viện Chợ Rẫy phê duyệt, toàn bộ bệnh nhân hoặc đại diện gia đình ký văn bản đồng thuận tham gia nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày khối lượng dữ liệu thực nghiệm đồ sộ chia làm 4 nội dung trọng tâm:

1. Giá trị xác định đột biến của xét nghiệm EGFR huyết tương so với mẫu mô

• Tỷ lệ phát hiện đột biến: Khảo sát đối chứng song song trên các bệnh nhân mới chẩn đoán cho thấy tỷ lệ phát hiện đột biến gen EGFR trên mẫu mô và mẫu huyết tương có sự khác biệt rõ rệt tùy thuộc vào kỹ thuật phân tích. Kỹ thuật Scorpion ARMS PCR trên mẫu huyết tương cho độ đặc hiệu rất cao nhưng độ nhạy bị giới hạn bởi nồng độ ctDNA phóng thích vào tuần hoàn.
• Giá trị chẩn đoán: Khi so sánh với tiêu chuẩn vàng là xét nghiệm mẫu mô, xét nghiệm EGFR huyết tương bằng Scorpion ARMS đạt độ đặc hiệu tổng thể từ 95% đến 100%, giá trị dự báo dương tính (PPV) đạt xấp xỉ tuyệt đối. Tuy nhiên, độ nhạy đạt mức trung bình (khoảng 60–75%), dao động tùy theo kiểu đột biến (độ nhạy phát hiện E19del thường cao hơn so với L858R).
• Phân tích phân nhóm theo đặc điểm lâm sàng: Độ nhạy của xét nghiệm EGFR huyết tương tăng cao rõ rệt ở phân nhóm bệnh nhân có tải lượng u lớn, có di căn xa đa cơ quan (di căn xương, di căn tạng ngoài lồng ngực), bệnh nhân không hút thuốc lá và có dấu ấn TTF1 dương tính trên hóa mô miễn dịch. Ngược lại, ở những bệnh nhân tổn thương khu trú hoặc đã qua can thiệp phẫu thuật/hóa xạ trị trước đó, độ nhạy phát hiện đột biến trong huyết tương có xu hướng giảm.

Thông số chẩn đoán của xét nghiệm EGFR huyết tương	Nhóm đột biến E19del	Nhóm đột biến L858R	Toàn bộ đột biến EGFR
Độ nhạy (Sensitivity)	Cao hơn nhóm L858R	Thấp hơn nhóm E19del	60% – 75%
Độ đặc hiệu (Specificity)	> 95%	> 95%	95% – 100%
Giá trị dự báo dương tính (PPV)	Xấp xỉ 98–100%	Xấp xỉ 98–100%	Xấp xỉ 98–100%
Mối tương quan lâm sàng	Tải lượng u cao, di căn xa	Tải lượng u cao, di căn xa	Tương đồng cao với mô đặc

2. Theo dõi điều trị với EGFR TKI thế hệ một bằng xét nghiệm EGFR huyết tương

• Theo dõi động học đột biến ở nhóm A (16 trường hợp): Xét nghiệm huyết tương trước điều trị đều dương tính với đột biến EGFR nhạy thuốc. Sau khi điều trị bằng gefitinib hoặc erlotinib, nồng độ ctDNA mang đột biến giảm mạnh hoặc biến mất hoàn toàn (chuyển âm tính) trong máu ngoại vi ở những chu kỳ đánh giá đầu tiên tương ứng với giai đoạn khối u đáp ứng trên lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh (PR hoặc SD).
• Sự xuất hiện tái phát sớm của đột biến: Ở 21 trường hợp được ghi nhận theo dõi mở rộng, đột biến EGFR ban đầu tái xuất hiện trở lại trong huyết tương trước khi hình ảnh cắt lớp vi tính (CT-Scanner) phát hiện tổn thương tiến triển (PD) trung bình từ 1 đến 3 tháng.
• Phát hiện đột biến T790M thứ phát ở nhóm B (89 trường hợp kháng thuốc): Ở những bệnh nhân tiến triển bệnh sau liệu pháp EGFR TKI thế hệ một, xét nghiệm sinh thiết lỏng huyết tương phát hiện đột biến T790M thứ phát với tỷ lệ dao động từ 40% đến 50%. Kết quả này chứng minh xét nghiệm huyết tương bằng Scorpion ARMS hoàn toàn có thể giúp định danh đột biến kháng thuốc để chuyển sang thuốc thế hệ ba mà không cần bắt buộc can thiệp sinh thiết lại mô đặc.

3. Tiên lượng sống còn cho bệnh nhân UTPKTBN bằng xét nghiệm EGFR huyết tương

• Sống còn không tiến triển bệnh (PFS) và sống còn toàn bộ (OS): Đường cong Kaplan-Meier chỉ ra sự phân tách rõ nét giữa các phân nhóm:
  • Bệnh nhân có đột biến EGFR huyết tương chuyển đổi thành âm tính sau điều trị có PFS và OS dài hơn vượt trội so với nhóm vẫn duy trì đột biến dương tính dai dẳng trong huyết tương.
  • Tình trạng mang đột biến EGFR nhạy thuốc kèm theo đột biến kép T790M trước điều trị (đột biến nguyên phát hiếm gặp) có tiên lượng PFS ngắn hơn đáng kể so với nhóm chỉ mang đơn đột biến nhạy thuốc.
  • Phân tích đơn biến xác nhận các yếu tố ảnh hưởng bất lợi đến sống còn bao gồm: tuổi cao, điểm số tổng trạng ECOG PS cao ($\ge 2$), có di căn xương trước điều trị, xuất hiện vị trí di căn mới sau điều trị và không đạt được sự thanh thải đột biến EGFR trong huyết tương sau liệu trình đầu.

4. Mô hình dự báo kháng trị với EGFR TKI thế hệ một và tiên lượng tử vong sớm

• Ứng dụng hồi quy Bayes (BMA): Sử dụng tiêu chí BIC để sàng lọc các biến số từ lâm sàng, cận lâm sàng và phân tử:
  • Mô hình dự báo kháng trị sớm: Tình trạng tồn lưu đột biến EGFR trong huyết tương sau điều trị là biến số độc lập dự báo nguy cơ tiến triển kháng thuốc sớm với EGFR TKI thế hệ một.
  • Mô hình tiên lượng tử vong sớm: Luận án xây dựng mô hình tiên lượng tối ưu gồm 3 yếu tố và mô hình mở rộng 5 yếu tố. Trong đó, điểm ECOG PS, tình trạng di căn xương trước điều trị và trạng thái đột biến EGFR huyết tương sau điều trị là các thông số cốt lõi giúp phân tầng chính xác nhóm bệnh nhân có nguy cơ tử vong sớm, với tỷ số nguy cơ (Hazard Ratio - HR) có ý nghĩa thống kê cao.

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Chương cuối tóm tắt toàn bộ các kết luận rút ra từ 3 mục tiêu nghiên cứu, khẳng định giá trị thực tiễn của xét nghiệm đột biến gen qua sinh thiết lỏng và nêu các kiến nghị triển khai quy trình kỹ thuật vào thường quy lâm sàng tại các đơn vị ung bướu.

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Xác lập cơ sở khoa học thực nghiệm về mối tương quan giữa nồng độ ctDNA mang đột biến gen EGFR trong máu ngoại vi với đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh và giai đoạn di căn của bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB và IV tại Việt Nam.
2. Chứng minh động học thanh thải đột biến EGFR trong huyết tương phản ánh trực tiếp mức độ thoái triển tế bào u dưới tác động của thuốc ức chế tyrosine kinase, bổ sung bằng chứng sinh học về sự biến đổi phân tử diễn ra sớm hơn so với thay đổi kích thước giải phẫu học trên chẩn đoán hình ảnh.
3. Ứng dụng thành công phương pháp trung bình hóa mô hình Bayes (BMA) để xây dựng mô hình tiên lượng tử vong sớm và dự báo kháng thuốc, cung cấp công cụ toán - sinh học có độ tin cậy cao trong cá thể hóa tiên lượng cho bệnh nhân ung thư phổi.

Những đóng góp mới về mặt thực tiễn lâm sàng

1. Cung cấp quy trình hoàn chỉnh về thu nhận, xử lý tiền phân tích mẫu huyết tương và kỹ thuật xét nghiệm Scorpion ARMS PCR đạt độ đặc hiệu cao (>95%), cho phép chỉ định điều trị EGFR TKI thế hệ một cho những bệnh nhân không thể sinh thiết mô hoặc mẫu sinh thiết mô không đủ tế bào u.
2. Khẳng định giá trị thực hành của sinh thiết lỏng trong việc giải quyết bế tắc lâm sàng khi bệnh nhân kháng thuốc: phát hiện đột biến T790M thứ phát trong máu ngoại vi đạt tỷ lệ 40–50%, tạo căn cứ xác thực để chuyển đổi phác đồ sang thuốc thế hệ ba (osimertinib) mà không cần thực hiện thủ thuật sinh thiết lại mô đặc xâm lấn nguy hiểm.
3. Xác lập xét nghiệm EGFR huyết tương như một công cụ theo dõi dọc đáp ứng thuốc định kỳ: việc tái xuất hiện đột biến EGFR trong máu ngoại vi đóng vai trò dấu hiệu cảnh báo sớm tiến triển kháng thuốc trước khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng hoặc tổn thương trên phim CT-Scanner.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất của luận án

• Khuyến nghị các cơ sở điều trị ung bướu đưa xét nghiệm đột biến EGFR huyết tương vào thường quy lâm sàng như một chỉ định song hành hoặc thay thế bước một cho các trường hợp bệnh nhân chống chỉ định sinh thiết mô đặc.
• Thiết lập quy trình giám sát định kỳ ctDNA huyết tương (sau mỗi 1–3 tháng điều trị EGFR TKI) nhằm phát hiện sớm hiện tượng kháng thuốc sinh học và phát hiện đột biến T790M thứ phát.
• Đề xuất hoàn thiện và chuẩn hóa quy trình kỹ thuật tiền phân tích tách chiết cfDNA từ thể tích huyết tương lớn bằng hệ thống tự động để nâng cao độ nhạy phát hiện đột biến.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi nghiên cứu chỉ tập trung vào nhóm bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn tiến xa (IIIB và IV); chưa khảo sát nhóm bệnh nhân giai đoạn sớm (I–IIIA).
• Cỡ mẫu theo dõi dọc (nhóm A gồm 16 bệnh nhân) còn khiêm tốn do yêu cầu khắt khe về việc thu mẫu máu định kỳ và tuân thủ điều trị liên tục tại một trung tâm duy nhất.
• Kỹ thuật Scorpion ARMS PCR dù có độ đặc hiệu cao nhưng độ nhạy bị giới hạn ở ngưỡng 0,1–1%, dẫn tới hiện tượng âm tính giả ở những bệnh nhân có mức độ phóng thích ctDNA vào máu thấp; kỹ thuật này cũng chỉ khu trú ở một số đột biến điểm đã biết, không bao quát được toàn bộ các đột biến hiếm gặp khác.

Hướng nghiên cứu tiếp:

• Mở rộng nghiên cứu theo dõi dọc trên cỡ mẫu lớn hơn ở quy mô đa trung tâm để củng cố độ chính xác của các mô hình tiên lượng BMA.
• Ứng dụng các công nghệ phân tích sinh học phân tử có độ nhạy phân tích siêu cao như giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) định hướng chiều sâu hoặc kỹ thuật PCR kỹ thuật số giọt (droplet digital PCR - ddPCR) nhằm nâng cao độ nhạy phát hiện đột biến EGFR và các đột biến phối hợp (TP53, RB1, KRAS, khuếch đại gen MET, HER2).
• Khảo sát vai trò của xét nghiệm EGFR huyết tương ở nhóm bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn sớm sau phẫu thuật nhằm phát hiện bệnh tồn lưu tối thiểu (MRD).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị ứng dụng cao cho nhiều nhóm đối tượng:

• Bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Hô hấp: Tham khảo cơ sở thực chứng để chỉ định sinh thiết lỏng trong lựa chọn phác đồ EGFR TKI bước một khi thiếu mẫu mô; áp dụng theo dõi động học ctDNA để nhận diện sớm hiện tượng kháng thuốc và phát hiện đột biến T790M thứ phát nhằm kịp thời chuyển đổi sang thuốc thế hệ ba.
• Chuyên viên Sinh học phân tử và Xét nghiệm Y học: Tham khảo chi tiết các thông số kỹ thuật, quy trình tiền phân tích huyết tương, kỹ thuật tách chiết cfDNA bằng QIAvac-24 và QIAsymphony, phương pháp chuẩn hóa đường chuẩn qPCR định lượng và tiêu chí ngưỡng cắt $\Delta$Ct của kỹ thuật Scorpion ARMS PCR.
• Nghiên cứu sinh và Giảng viên khối ngành Khoa học Sự sống, Y Dược: Học hỏi phương pháp luận nghiên cứu kết hợp giữa sinh học thực nghiệm và y học lâm sàng; đặc biệt là kỹ thuật xử lý số liệu sống còn đa biến phức tạp bằng mô hình trung bình hóa Bayes (BMA) dựa trên tiêu chí BIC để lựa chọn mô hình dự báo tối ưu.

Câu hỏi thường gặp

1. Xét nghiệm đột biến gen EGFR trên mẫu huyết tương có thể thay thế hoàn toàn sinh thiết mô đặc trong chẩn đoán ban đầu không?
Không thể thay thế hoàn toàn mà mang vai trò bổ sung chiến lược. Luận án chỉ rõ xét nghiệm mẫu mô vẫn là tiêu chuẩn vàng do cung cấp đầy đủ thông tin giải phẫu bệnh học và có độ nhạy phát hiện đột biến cao. Tuy nhiên, xét nghiệm EGFR huyết tương có độ đặc hiệu đạt từ 95% đến 100% và giá trị dự báo dương tính xấp xỉ tuyệt đối, do đó khi kết quả huyết tương dương tính, bác sĩ có thể chỉ định ngay EGFR TKI cho bệnh nhân không thể hoặc thất bại sinh thiết mô. Ngược lại, nếu kết quả huyết tương âm tính, nguy cơ âm tính giả vẫn tồn tại (do độ nhạy chỉ đạt 60–75%), bệnh nhân bắt buộc phải tìm cách sinh thiết mô lại nếu điều kiện lâm sàng cho phép.

2. Đột biến kháng thuốc T790M thứ phát được phát hiện trong huyết tương với tỷ lệ bao nhiêu và có ý nghĩa lâm sàng gì?
Trong nhóm 89 bệnh nhân kháng thuốc EGFR TKI thế hệ một (nhóm B), xét nghiệm Scorpion ARMS PCR huyết tương phát hiện đột biến T790M thứ phát với tỷ lệ từ 40% đến 50%. Ý nghĩa lâm sàng cốt lõi là giúp bệnh nhân kháng thuốc được xác nhận cơ chế kháng thuốc để chuyển sang dùng thuốc EGFR TKI thế hệ ba (osimertinib) mà không cần thực hiện thủ thuật sinh thiết lại khối u vốn tiềm ẩn nhiều nguy cơ tai biến và khó lấy được mẫu đạt yêu cầu.

3. Động học đột biến EGFR trong huyết tương thay đổi như thế nào trong quá trình điều trị và có vai trò gì trong tiên lượng?
Ở những bệnh nhân đáp ứng với thuốc TKI, đột biến EGFR trong huyết tương giảm nồng độ nhanh chóng và chuyển sang trạng thái âm tính sau các chu kỳ điều trị đầu tiên. Sự thanh thải đột biến này tương quan thuận có ý nghĩa thống kê với việc kéo dài thời gian sống không tiến triển bệnh (PFS) và sống còn toàn bộ (OS). Ngược lại, nếu đột biến vẫn tồn tại dai dẳng hoặc tái xuất hiện sau giai đoạn âm tính, bệnh nhân có nguy cơ tiến triển kháng thuốc rất cao; tín hiệu phân tử này xuất hiện sớm hơn tổn thương tiến triển trên CT-Scanner từ 1 đến 3 tháng.

4. Kỹ thuật sinh học phân tử nào được tác giả sử dụng để phát hiện đột biến EGFR trong huyết tương và ưu điểm của kỹ thuật đó là gì?
Tác giả sử dụng kỹ thuật Scorpion ARMS PCR (với bộ kit therascreen EGFR RGQ PCR Kit trên hệ thống máy Rotor-Gene Q). Ưu điểm của kỹ thuật này là độ đặc hiệu rất cao, thời gian thực hiện nhanh, quy trình chuẩn hóa thông qua việc tính toán ngưỡng chu kỳ cắt delta Ct ($\Delta$Ct), và độ nhạy phân tích đạt từ 0,1% đến 1%, rất phù hợp để phát hiện các phân tử ctDNA mang đột biến có hàm lượng thấp trong mẫu huyết tương.

5. Luận án đã ứng dụng công cụ thống kê nào để xây dựng mô hình tiên lượng tử vong sớm và dự báo kháng thuốc?
Luận án ứng dụng phương pháp hồi quy đa biến trung bình hóa mô hình Bayes (Bayesian Model Averaging - BMA) kết hợp Tiêu chí thông tin Bayes (BIC). Phương pháp này giúp đánh giá đồng thời hàng loạt mô hình kết hợp từ các biến số lâm sàng, cận lâm sàng và phân tử, từ đó chọn ra mô hình tối ưu (mô hình 3 yếu tố và 5 yếu tố) gồm các chỉ số độc lập có giá trị dự báo cao nhất (tổng trạng ECOG PS, di căn xương trước điều trị và trạng thái đột biến EGFR huyết tương sau điều trị), khắc phục triệt để các sai số do hiện tượng quá khớp dữ liệu.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Phan Thanh Thắng đã giải quyết trọn vẹn 3 mục tiêu khoa học đặt ra, chứng minh tính khả thi và giá trị lâm sàng của xét nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương bằng kỹ thuật Scorpion ARMS PCR trên bệnh nhân UTPKTBN giai đoạn IIIB và IV tại Bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả nghiên cứu xác lập sinh thiết lỏng là phương án thay thế đáng tin cậy khi không có mẫu mô đặc, đồng thời là công cụ giám sát động học đáp ứng điều trị và phát hiện hiệu quả đột biến kháng thuốc thứ phát T790M. Việc ứng dụng thành công mô hình hồi quy Bayes trong luận án đã khẳng định giá trị tiên lượng độc lập của tình trạng thanh thải đột biến ctDNA đối với thời gian sống còn của người bệnh, đóng góp dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho sự phát triển của y học cá thể hóa tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Ung thư phối là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư trên toàn thế giới. Đa số bệnh nhân ung thư phổi được phát hiện ở giai đoạn trễ mà không có triệu chứng đặc hiệu; có tiên lượng xấu trên lâm sàng do bệnh thường diễn tiễn nhanh và có nguy cơ tử vong rất cao. So với thể bệnh ung thư phổi tế bào nhỏ (small-cell lung cancer), ung thư phối không tế bào nhỏ (UTPKTBN; non-small cell lung cancer) thường gặp hơn và có tiên lượng tốt hơn nhờ có các thuốc điều trị nhắm đích đột biến gen EGFR, ALK, BRAF hay ROST. Trong đó, các thuốc nhắm đích đột biến EGFR (EGFR TKI — tyrosine kinase inhibitor) thé hệ một duoc sử dụng rộng rãi nhất hiện nay nhờ hiệu quả cao, trong khi đột biến này cũng thường xuất hiện ở UTPKTBN hơn so với ALK, BRAF hay ROSI.

Đây được xem là bước nhảy vọt trong điều tri UTPKTBN, giúp nâng cao hiệu quả điều trị so với hóa trị cô điển và xa trị, kéo dài thời gian sống không tiến triển bệnh và giảm thiêu được tối đa các tác dụng phụ do hóa chất và tia xạ gây ra, đồng thời nâng cao chất lượng cuộc sông cho bệnh nhân. Đề được điều trị với EGFR TKI như erlotinib hay gefitinib, bệnh nhân UTPKTBN cần được sinh thiết dé lay mẫu mô làm xét nghiệm tìm đột biến EGFR (điều kiện đủ) theo khuyến cáo. Trong đó, hai kiểu đột biến nhạy thuốc được tầm soát trước tiên gồm mất đoạn exon19 (E19del) và đột biến điểm L858R ở exon 21. Xét nghiệm trên mẫu mô được xem là tiêu chuẩn vàng trong thực hành lâm sàng.

Tuy nhiên, thực tế cho thấy nhiều trường hợp mới phát hiện bệnh nhưng không sinh thiết được dé lấy mẫu mô làm xét nghiệm chan đoán do nhiều nguyên nhân khác nhau (tuổi già, sức khỏe kém, tình trạng bệnh nặng, có rối loạn chức năng hô hấp, tim mạch, hoặc khối u nằm ở vị trí khó sinh thiết. Trong khi đó, nhiều bệnh nhân dù đủ điều kiện sinh thiết nhưng tỷ lệ thành công của thủ thuật chỉ khoảng 80% mà thôi. Một số trường hợp khác mặc dù đã sinh thiết được nhưng không đủ tế bao dé làm xét nghiệm tìm đột biến gen do mẫu quá nhỏ, và vì vậy không được hưởng lợi từ liệu pháp EGFR TKI. Trong một tinh thế khác, bệnh nhân có đột biến EGFR, đã được điều trị với EGFR TKI thế hệ thứ nhất nhưng nghỉ ngờ kháng trị, cần phải xác định lại tình trạng đột biến EGFR, đặc biệt là đột biến EGFRT?9%M thứ phát dé chuyển hướng điều trị với EGFR TKI thế hệ thứ ba như osimertinib theo khuyến cáo.

Van đề là sinh thiết lại ở bệnh nhân kháng trị thực sự rất khó khăn. Trong khi đó, sinh thiết lại cũng tiềm ấn nhiều nguy cơ biến chứng nguy hiểm, với tỷ lệ tương đương hoặc thậm chí cao hơn so với sinh thiết lần đầu. Ngoài ra, không thể xác định được thời điểm tối ưu dé sinh thiết lai, trong khi kết quả xét nghiệm rất khác biệt giữa các thời điểm, và giữa những tổn thương u trong cơ thé do tính không đồng nhất của khối u (tumor heterogeneIty). Trong bối cảnh đó, sự ra đời của kỹ thuật sinh thiết lỏng (liquid biopsy) có thể là giải pháp thay thế cho sinh thiết mô đặc, giúp bác sĩ lâm sàng có thêm lựa chọn dé dễ dàng thu mẫu bệnh phẩm và làm xét nghiệm chan đoán cho bệnh nhân.

Xác định đột biến EGFR trong huyết tương là kỹ thuật không xâm lấn do chỉ cần lay máu làm xét nghiệm, rat phù hợp với bệnh nhân khó sinh thiết hoặc không sinh thiết được. Các nghiên cứu cho thấy độ nhạy và độ tương đồng kết quả xét nghiệm EGFR huyết tương so với trong mẫu mô rất khác biệt giữa các trung tâm, phụ thuộc nhiều vào điều kiện tiền phân tích, phương pháp tách chiết cfDNA (circulating free DNA) từ huyết tương, kỹ thuật xác định đột biến, và cả yếu tố chủng tộc. Trong khi, vẫn chưa có khuyến cáo về quy trình chuẩn hóa cho xét nghiệm này từ Tổ chức Y tế thế giới (WHO: world health organization). Mặt khác, vẫn chưa có sự đồng thuận về việc sử dụng xét nghiệm EGFR huyết tương trong theo dõi điều trị với EGFR TKI, đánh giá đáp ứng thuốc và tiên lượng sống còn cho bệnh nhân UTPKTBN.

Tại Việt Nam, nghiên cứu về xét nghiệm EGFR huyết tương vẫn còn rất hạn chế, hầu hết được báo cáo trong khoảng một năm gần đây, trong khi vẫn chưa có báo cáo nào về vai trò của xét nghiệm nay trong theo dõi điều trị với EGFR TKI va tiên lượng sống còn cho bệnh nhân UTPKTBN. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài nghiên cứu “Đánh giá giá trị chan đoán và theo dõi điều trị trên bệnh nhân ung thư phối không tế bào nhỏ giai đoạn IIIB và IV bằng xét nghiệm đột biến gen EGFR huyết tương” được thực hiện dé cho thấy sức thuyết phục trong chân đoán và vai trò tiên lượng của xét nghiệm này trong thực tế. Do vậy, nghiên cứu mang đậm tính thực tiễn, hướng tới triển khai ứng dụng kỹ thuật mới trên lâm sàng để chọn lựa bệnh nhân cho liệu pháp EGFR TKI, giúp giảm thiểu nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân, giảm chi phí phát sinh, rút ngắn thời gian khám chữa bệnh va nâng cao chất lượng dịch vụ. Nghiên cứu còn có ý nghĩa đặc biệt, nhằm góp phần xây dựng cơ sở khoa học trong tầm soát nhanh gen bệnh ung thư nói chung và UTPKTBN nói riêng; làm phong phú thêm co sở dữ liệu phục vụ cho công tác dao tạo, giảng dạy nâng cao kinh nghiệm, trình độ cho người làm chuyên môn; giúp bắt kịp tiễn bộ khoa học công nghệ mới nhất so với các nước trên thế giới.

Ba mục tiêu nghiên cứu của đề tài gồm: 1. Đánh giá khả năng thay thé cho xét nghiện EGFR trên mẫu mô bằng xét nghiệm EGFR huyết tương. Đánh giá vai trò của xét nghiện EGFR huyết tương trong theo dõi điều trị với EGER TKI thé hệ một; và khả năng phát hiện được đột biến EGFRTMTM thự phát khi bệnh nhân kháng tri. Đánh giá vai trò của xét nghiện EGFR huyết tương trong tiên lượng bệnh ung thu phổi không tế bào nhỏ khi điều trị với EGFR TKI thé hệ một.

Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TONG QUAN VE UNG THU PHOI KHONG TE BAO NHỎ 1. Dich té hoc Ung thư phối là nguyên nhân gây tử vong hang dau trong các loại ung thư trên toàn thế giới. Số liệu mới nhất năm 2018 cho thấy toàn thế giới có khoảng 2,1 triệu ca mắc mới (chiếm 11,6% trong tổng số các loại ung thư), và khoảng 1,76 triệu ca tử vong do ung thư phôi (chiếm 18,4% tổng số ca tử vong do ung thư) [15].

Dự đoán năm 2020 trên toàn thế giới, số lượng ung thư phổi mắc mới tăng lên 2,27 triệu, và số lượng tử vong do ung thư phổi tăng lên 1,98 triệu. Phổi Vú Đại trực tràng Tiền liệt tuyến Dạ dày Gan Thực quản Cổ tử cung Tuyến giáp [ Mắc mới Bàng quang E Tử vong 1 200 000 1 600 000 2000000 sano 0 400 000 800 000 ro ty Số lượng Hình 1. Thứ hạng của 10 loại ung thư thường gặp nhất trên thé giới năm 2018 (Nguồn: GLOBOCAN 2018, WHO) Tại Việt Nam, năm 2018 có khoảng 23,7 ngàn ca mắc mới và 20,7 ngàn ca tử vong do ung thư phổi, đứng thứ hai sau ung thư gan. Tỷ lệ mắc ung thư phổi trung bình của cả 2 giới khoảng 21,7 người/100 ngàn dân [15].

Dự đoán năm 2020, số lượng ung thư phối mắc mới tại Việt Nam tăng lên 29,1 ngàn ca, với khoảng 26,1 ngàn ca tử vong. Trong ung thư phối nguyên phát, khoảng 85 — 90% các trường hợp là thé ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN; non-small cell lung cancer) [118]. Khoảng 10 — 15% trường hợp còn lại là ung thư phôi tế bào nhỏ (small cell lung cancer). Ung thư phổi thường diễn tiến chậm và thầm lặng, trong đó hầu hết (~ 80%) bệnh nhân không có triệu chứng gì cho đến khi được phát hiện đều ở giai đoạn tiến xa (giai đoạn IIIB, IV).

Thời gian sống thêm trung bình của bệnh nhân ở giai đoạn tiến xa chỉ khoảng 12 tháng [185]. Trong khi đó, chỉ khoảng 17% bệnh nhân ung thu phối sống thêm được 5 năm [185]. Hút thuốc hay ảnh hưởng bởi khói thuốc là một trong số yếu tố nguy cơ gây ung thư phổi [95]. Thống kê cho thấy hút thuốc lá gây ra ung thư phổi cho 85 — 90% số ca [95].

Nguy co mắc ung thư phổi của những người hút thuốc lá cao gấp 50 lần so với người không hút. Nguy cơ này ở người hít phải khói thuốc cũng cao hơn nhiều so với người bình thường [95]. Phơi nhiễm với các yếu tổ phóng xạ như uranium, radon 222, polonium. hay các yếu tô độc hại thải ra trong quá trình công nhiệp hóa như amiăng, kim loại nặng, silica, asbestos, khói, hay khí ga.

cũng là yếu tố nguy cơ gây ung thư phổi cao [95]. Ngoài ra, mac lao phôi, viêm phế quan phổi mạn tính hay tính nhạy cảm di truyền cũng làm tăng nguy cơ mắc bệnh [95]. Triệu chứng của bệnh Đa số bệnh nhân mắc UTPKTBN không có triệu chứng lâm sảng đặc hiệu, trong khi đó khoảng 25% bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng cụ thể [2]. Ở giai đoạn tiễn xa, bệnh nhân có thể có các triệu chứng như: ho kéo dài, đặc biệt là ho ra máu, khàn tiếng, khó thở, đau ngực, và các triệu chứng ở các cơ quan khác khi khối u đi căn tới như đau nhức xương, đau đầu do tăng áp lực nội sọ, giảm sức nhìn, đột quy.

Ngoài ra có thé có các triệu chứng không điển hình như suy nhược cơ thé, giảm cân. Chan đoán hình ảnh Chân đoán hình ảnh là công cụ đầu tiên giúp tầm soát UTPKTBN khi bệnh nhân có dấu hiệu nghi ngờ. Các kỹ thuật chân đoán hình ảnh thường dùng hiện nay gồm X-Quang, nội soi, CT-Scanner (computed tomography), PET-CT (positron emission tomography computed tomography), MRI (magnetic resonance imaging), xa hinh xuong va siéu 4m. X-Quang ngực được sử dung rộng rãi, với liều phóng xa thấp nhưng chi phát hiện được u khi bệnh đã ở giai đoạn tiến xa.

Nội soi phế quản là công cụ quan trọng, giúp đánh giá tắc nghẽn đường hô hap va thông qua đó thu mẫu dịch rửa phế quản hoặc mẫu sinh thiết dé làm xét nghiệm giải phẫu bệnh học. CT-Scanner ngực và PET-CT là hai công cụ quan trọng, giúp đánh giá giai đoạn bệnh, khả năng di căn và mức độ hoạt động của khối u.