Nghiên Cứu Kháng Thể Tái Tổ Hợp CYFRA21-1 Phát Triển Kit Chẩn Đoán Ung Thư Phổi

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư

1.2. Nguồn gốc tế bào ung thư

1.3. Đặc điểm của tế bào ung thư

1.4. Ung thư phổi

1.5. Kháng nguyên CYFRA21-1

1.6. Cấu trúc của Cytokeratin

1.7. Biểu hiện của Cytokeratin

1.8. Kháng thể

1.9. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và thực tiễn hiện nay

1.10. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1

1.11. Công nghệ phage display

1.12. Giới thiệu công nghệ phage display

1.13. Ứng dụng của kháng thể phage-scFv trong chẩn đoán và điều trị

2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.2. Mẫu bệnh phẩm

2.3. Sinh phẩm và hóa chất

2.4. Trang thiết bị

2.5. Phần mềm máy tính

2.6. Phương pháp

2.7. Các phương pháp thao tác với DNA, RNA

2.8. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp

2.9. Các kỹ thuật phage display

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1

3.2. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi

3.3. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1

3.4. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1

3.5. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1

3.6. Biểu hiện và thu kháng nguyên CYFRA21-1

3.7. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1

3.8. Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1

3.9. Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/Cyfra21-1

3.10. Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp

3.11. Tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1

3.12. Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp

3.13. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1

3.14. Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1

3.15. Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã được gây miễn dịch

3.16. Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1

3.17. Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv (kháng thể phage)

3.18. Kết quả chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1

3.19. Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1

3.20. Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1

3.21. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Kháng Thể Tái Tổ Hợp CYFRA21 1

Ung thư phổi (UTP) là một trong những căn bệnh nguy hiểm, gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Việc chẩn đoán sớm UTP có ý nghĩa then chốt trong việc cải thiện tiên lượng bệnh. Các phương pháp chẩn đoán hiện tại còn nhiều hạn chế, thúc đẩy việc tìm kiếm các marker ung thư phổi mới, đặc hiệu hơn. CYFRA21-1 nổi lên như một chỉ dấu đầy hứa hẹn, đặc biệt trong UTP không tế bào nhỏ (NSCLC). Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp CYFRA21-1 mở ra hướng phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi hiệu quả, nhanh chóng và chính xác hơn. Luận án của Lê Đình Chắc (2013) đặt nền móng cho việc này bằng cách tập trung vào tạo kháng thể scFv đặc hiệu, hứa hẹn ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị.

1.1. Tầm quan trọng của chẩn đoán sớm ung thư phổi

Ung thư phổi, đặc biệt là NSCLC, thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, khi khả năng điều trị hiệu quả đã giảm đáng kể. Chẩn đoán sớm ung thư phổi cho phép can thiệp kịp thời, tăng cơ hội sống sót và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Các phương pháp như xét nghiệm CYFRA21-1 có thể hỗ trợ phát hiện bệnh ở giai đoạn tiền lâm sàng.

1.2. Vai trò của CYFRA21 1 trong ung thư phổi không tế bào nhỏ

Protein CYFRA21-1, một mảnh cytokeratin 19, thường tăng cao trong huyết thanh của bệnh nhân NSCLC. Mức độ tăng cao này có liên quan đến giai đoạn bệnh và tiên lượng. Vì vậy, CYFRA21-1 là một marker ung thư phổi có giá trị trong chẩn đoán và theo dõi điều trị.

II. Vấn Đề Thiếu Kit Chẩn Đoán Ung Thư Phổi Độ Nhạy Cao

Mặc dù CYFRA21-1 là một marker ung thư phổi tiềm năng, các kit chẩn đoán ung thư hiện tại dựa trên xét nghiệm CYFRA21-1 vẫn còn những hạn chế về độ nhạy và độ đặc hiệu. Điều này dẫn đến tỷ lệ âm tính giả và dương tính giả cao, ảnh hưởng đến quyết định điều trị. Do đó, nhu cầu cấp thiết là phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi mới, có độ chính xác cao hơn, dựa trên công nghệ kháng thể tái tổ hợp.

2.1. Hạn chế của các phương pháp chẩn đoán ung thư phổi hiện tại

Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh như chụp X-quang và CT scan có thể phát hiện khối u phổi, nhưng không đủ để phân biệt giữa ung thư và các bệnh phổi khác. Sinh thiết phổi là phương pháp chính xác nhất, nhưng xâm lấn và không phải lúc nào cũng khả thi. Xét nghiệm CYFRA21-1 hiện tại chưa đủ độ nhạy để phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm.

2.2. Yêu cầu về độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán ung thư phổi

Một kit chẩn đoán ung thư phổi lý tưởng cần có độ nhạy cao để phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm, khi khả năng điều trị hiệu quả nhất. Đồng thời, độ đặc hiệu cao là cần thiết để tránh chẩn đoán nhầm lẫn và điều trị không cần thiết. Công nghệ kháng thể tái tổ hợp hứa hẹn đáp ứng được các yêu cầu này.

2.3. Giá trị chẩn đoán của xét nghiệm CYFRA21 1 trong các mẫu bệnh phẩm

Việc định lượng CYFRA21-1 trong các bệnh phẩm huyết thanh, máu và dịch màng phổi đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán. Tuy nhiên, để đạt được độ chính xác chẩn đoán cao, cần có kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu và quy trình chuẩn hóa.

III. Tạo Kháng Thể Tái Tổ Hợp CYFRA21 1 Giải Pháp Ưu Việt

Sử dụng công nghệ sinh học phân tử để tạo ra kháng thể tái tổ hợp CYFRA21-1 là một giải pháp đầy triển vọng. Phương pháp này cho phép sản xuất kháng thể với số lượng lớn, độ tinh khiết cao và khả năng tùy biến linh hoạt. Các kháng thể scFv (single-chain variable fragment) đặc biệt phù hợp để phát triển kit chẩn đoán do kích thước nhỏ và khả năng gắn kết kháng nguyên cao.

3.1. Ưu điểm của kháng thể tái tổ hợp so với kháng thể đơn dòng

Sản xuất kháng thể bằng công nghệ tái tổ hợp cho phép kiểm soát chất lượng và số lượng sản phẩm tốt hơn so với phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng truyền thống. Ngoài ra, kháng thể tái tổ hợp có thể được thiết kế để có độ đặc hiệu và ái lực cao hơn.

3.2. Công nghệ Phage Display trong tạo kháng thể đặc hiệu CYFRA21 1

Công nghệ phage display là một phương pháp hiệu quả để chọn lọc kháng thể có ái lực cao với CYFRA21-1. Phương pháp này cho phép tạo ra một thư viện kháng thể scFv đa dạng và chọn lọc các kháng thể mong muốn thông qua quá trình gắn kết với kháng nguyên.

3.3. Ứng dụng kháng thể trong phương pháp ELISA và miễn dịch huỳnh quang

Kháng thể tái tổ hợp CYFRA21-1 có thể được sử dụng trong các phương pháp ELISA và miễn dịch huỳnh quang để định lượng CYFRA21-1 trong bệnh phẩm. Các phương pháp này cho phép phát hiện marker ung thư phổi một cách nhanh chóng và chính xác.

IV. Quy Trình Phát Triển Kit Chẩn Đoán Ung Thư Phổi Tiềm Năng

Quy trình phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi dựa trên kháng thể tái tổ hợp CYFRA21-1 bao gồm nhiều bước, từ tách dòng gen, biểu hiện protein, gây miễn dịch, chọn lọc kháng thể, đến kiểm tra độ nhạy CYFRA21-1 và độ đặc hiệu CYFRA21-1 trên các mẫu bệnh phẩm máu và bệnh phẩm huyết thanh.

4.1. Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21 1

Bước đầu tiên là tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 trong hệ thống biểu hiện protein thích hợp. Protein CYFRA21-1 tái tổ hợp này sẽ được sử dụng để gây miễn dịch và chọn lọc kháng thể.

4.2. Gây miễn dịch và tạo dòng kháng thể scFv đặc hiệu

Động vật thí nghiệm (ví dụ: gà) được gây miễn dịch bằng kháng nguyên CYFRA21-1. Sau đó, các tế bào lympho B từ động vật được sử dụng để tạo ra một thư viện kháng thể scFv bằng công nghệ phage display.

4.3. Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của kit chẩn đoán

Sau khi chọn lọc được kháng thể scFv đặc hiệu, kit chẩn đoán được xây dựng và đánh giá trên các mẫu bệnh phẩm từ bệnh nhân UTP và người khỏe mạnh. Độ nhạy CYFRA21-1, độ đặc hiệu CYFRA21-1 và độ chính xác chẩn đoán là các chỉ số quan trọng cần được xác định.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Kit Chẩn Đoán Ung Thư

Nghiên cứu của Lê Đình Chắc đã thành công trong việc tạo ra kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu CYFRA21-1 bằng công nghệ phage display. Kháng thể phage này có khả năng liên kết mạnh mẽ với kháng nguyên CYFRA21-1 và có tiềm năng ứng dụng trong kit chẩn đoán ung thư phổi. Nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán UTP hiệu quả hơn.

5.1. Kết quả sàng lọc và chọn lọc kháng thể scFv đặc hiệu

Quá trình sàng lọc bằng công nghệ phage display đã chọn được một số dòng kháng thể scFv có khả năng liên kết đặc hiệu với CYFRA21-1. Các kháng thể này được xác định trình tự gen và đánh giá ái lực.

5.2. Ứng dụng kháng thể phage trong định lượng CYFRA21 1

Kháng thể phage được sử dụng để định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Immuno RT-PCR. Kết quả cho thấy kháng thể này có khả năng phát hiện CYFRA21-1 với độ nhạy cao.

VI. Tiềm Năng và Hướng Phát Triển Kit Chẩn Đoán Ung Thư Phổi

Việc phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi dựa trên kháng thể tái tổ hợp CYFRA21-1 là một hướng đi đầy hứa hẹn. Nghiên cứu này không chỉ góp phần cải thiện chẩn đoán ung thư phổi mà còn mở ra tiềm năng phát triển các phương pháp điều trị nhắm trúng đích dựa trên kháng thể.

6.1. Giá trị tiên lượng ung thư phổi và theo dõi điều trị

Kit chẩn đoán có thể được sử dụng để tiên lượng ung thư phổi và theo dõi đáp ứng điều trị. Mức độ CYFRA21-1 trong bệnh phẩm có thể phản ánh hiệu quả điều trị và nguy cơ tái phát bệnh.

6.2. Hướng nghiên cứu tiếp theo Phát triển kháng thể trị liệu

Ngoài ứng dụng trong chẩn đoán, kháng thể tái tổ hợp CYFRA21-1 còn có tiềm năng được phát triển thành kháng thể trị liệu nhắm trúng đích vào tế bào ung thư phổi. Nghiên cứu trong tương lai sẽ tập trung vào cải thiện độ đặc hiệu và tăng cường khả năng diệt tế bào ung thư của kháng thể.

Nghiên Cứu Tạo Kháng Thể Tái Tổ Hợp Đặc Hiệu Kháng Nguyên CYFRA21-1