MỞ ĐẦU Ngày nay, thực phẩm chứa mầm bệnh ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe con ngƣời và hiện đang trở thành nguyên nhân chính gây ra các dịch bệnh. Các nguy cơ nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng [19]. Hiện nay trong bảo quản thực phẩm, nisin đƣợc sử dụng khá rộng, từ các sản phẩm tƣơi sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng nhƣ dạng nƣớc. Sử dụng nisin thƣờng không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lƣợng, không để lại dƣ lƣợng trong thực phẩm.
Ngoài ra, dùng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Vì vậy, nisin đã trở thành chất chuyên biệt nguồn gốc sinh học có giá trị để bảo quản thực phẩm, khắc phục đƣợc nhƣợc điểm của các phƣơng pháp sử dụng hóa chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Trên thế giới, nisin lần đầu tiên đƣợc giới thiệu thƣơng mại nhƣ một chất bảo quản thực phẩm. Lần đầu tiên đƣợc sử dụng để làm chất bảo quản thực phẩm trong các sản phẩm phô mai đã chế biến và từ đó đã xác định đƣợc rất nhiều ứng dụng khác trong thực phẩm và đồ uống.
Tại Việt Nam, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là cơ quan đầu tiên khởi xƣớng những nghiên cứu về công nghệ lên men và thu hồi nisin từ vi khuẩn Lactococcus lactis, đã thiết lập đƣợc quy trình lên men và quy trình thu hồi bằng phƣơng pháp hấp phụ - phản hấp phụ sử dụng sinh khối tế bào. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung khảo sát các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nisin cao để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên, vấn đề thu nhận nisin đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao cần phải hoàn thiện thêm. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp nisin của một số chủng vi khuẩn lactic ứng dụng trong bảo quản thực phẩm” đã đƣợc đề xuất thực hiện.
Trang 12/130 BM20-QT.QLKH hƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 1. Tổng quan về Bacteriocin 1. Bacteriocin Bacteriocin là những hợp chất protein do vi khuẩn sinh tổng hợp và có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn khác. Bacteriocin không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chỉ kìm hãm nhƣng không trực tiếp giết vi sinh vật.
Bacteriocin do lactic acid bacteria sản xuất đƣợc chia thành 3 lớp [37, 48]. Lớp I: Lantibiotic, những phân tử peptide nhỏ (<5kDa), chịu nhiệt, hoạt động trên cấu trúc màng, Lantibiotic chứa những acid amin hiếm (lathionine, 3- methyllanthionine) và một số acid amin khử nƣớc. Lantibiotic có thể chia thành hai phân lớp dựa vào những đặc điểm cấu trúc và chức năng: - Lớp Ia: là những peptide tích điện dƣơng, gồm từ 21-38 acid amin. Những peptide này hoạt động chủ yếu do sự phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào của vi sinh vật đích.
- Lớp Ib: là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 acid amin. Hoạt động chủ yếu của chúng là phá vỡ các phản ứng enzyme của tế bào đích [28]. Lớp II: là những phân tử bacteriocin nhỏ (<10kDa) gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt. Bacteriocin lớp II chia thành 3 phân lớp: - Lớp IIa: rất đa dạng, điểm đặc trƣng là trình tự bảo tồn ở đầu N và hoạt tính kháng Listeria (ví dụ nhƣ Pediocin P -1, sakacin A).
- Lớp IIb: những bacteriocin lớp này cần có sự kết hợp của 2 peptide trong hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh, ví dụ nhƣ lactococcin G và plantaricins EF e JK. - Lớp IIc: đoạn peptide nhỏ, bền nhiệt, đƣợc đƣa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đƣờng tiết phụ thuộc nhân tố sec, ví dụ nhƣ divergicin và acidocin B. Lớp III: là những phân tử protein lớn (>30kDa), bền nhiệt, ví dụ nhƣ helveticins 1 do Lactobacillus helveticus sinh ra, acidofilicin A. Trang 13/130 BM20-QT.QLKH Về cơ chế hoạt động, bacteriocin thuộc nhóm I và II thƣờng là các peptide mang điện tích dƣơng và có khả năng thấm qua màng tế bào, gây thủng màng tế bào và làm thất thoát các ion, ATP và thành phần nội bào, dẫn đến tiêu diệt tế bào.
Nhóm lantibiotics là nhóm đƣợc chú ý nhất trong các nghiên cứu hiện nay. Đây là nhóm gồm các bacteriocin có phân tử nhỏ hơn 5kDa, có khả năng chịu nhiệt, chứa các acid amin bất thƣờng. Trong các chủng lactic acid bacteria thì Lactococcus lactis đƣợc quan tâm nghiên cứu rất nhiều, một số chủng Lactococcus lactis có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Bacteriocin do Lactococcus lactis gồm hai loại: lantibiotic và các kích thƣớc nhỏ, bền nhiệt không phải lantibiotic.
Nisin-bacteriocin do Lactococcus lactis tổng hợp là sản phẩm duy nhất đƣợc Tổ chức nông lƣơng thế giới (FAO) và Tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng nhƣ một chất phụ gia thực phẩm. Nisin sẽ phá vỡ chức năng vận chuyển của màng tế bào và tế bào chất thoát ra ngoài, nó có khả năng chống cả vi khuẩn gram âm lẫn vi khuẩn gram dƣơng, ức chế sự hình thành bào tử. Nisin có khả năng kháng đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dƣỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp., cũng nhƣ ức chế nảy chồi của bào tử các loài Bacillus và Clostridium [22].
Sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic Bacteriocin đƣợc tổng hợp theo cơ chế của sinh tổng hợp protein nhờ ribosome và những peptide bị biển đổi sau dịch mã [22, 43]. Các gen mã hóa sản xuất bacteriocin đƣợc tổ chức chung trong các cụm operon và cá thể đƣợc đặt trên các tiểu phần có thể di chuyển đƣợc nhƣ nhiễm sắc thể liên quan đến các transpons hoặc trên các plasmid [28]. ác bacteriocin đƣợc tổng hợp đầu tiên nhƣ những tiền peptides không hoạt động chứa N-terminal dẫn đầu. Những tiền peptide này đƣợc biến đổi bởi các protein khác hoặc axit amin đƣợc mã hóa bởi cụm gen bacteriocin trƣớc khi đƣa ra ngoài.
Ví dụ, có những lanthionine chứa liên kết chéo với thioether (Lans) hoặc methyl lanthione (MeLan) liên quan đến những amino acid 2. Những amino acid này đƣợc tổng hợp bởi tình trạng mất nƣớc của dƣ lƣợng serine và threonine theo Trang 14/130 BM20-QT.QLKH sau sự bổ sung của nội phân tử chọn lọc của cystein trên các amino acid không bão hòa [25]. Những bacteriocin quan trọng 1. Plantaricin Lactobacillus plantarum đƣợc công nhận là có thể sinh tổng hợp tối thiểu 6 loại bacteriocin khác nhau.
Tất cả những peptide này đƣợc sản xuất đầu tiên nhƣ những tiền chất chứa một nửa glycine. plantarum tổng hợp những bacteriocin thông qua gen PlnE và PlnF. Những peptide này sau đó đƣợc xuất ra ngoài và đƣợc xử lý bởi các protein PlnG và PlnH. Pheromone peptide của hệ thống này đƣợc mã hóa bởi 1 gen riêng biệt (Pln ) và đƣợc xuất ra ngoài bởi PlnG và đƣợc phát hiện bởi histidine protein kinase PlnB mà phosphorylate hai chất điều hòa phản ứng PlnC và PlnD.
Plantaricin ức chế một loạt các LAB gồm đối thủ cạnh tranh tự nhiên của L. plantarum và các vi khuẩn khác nhƣ Pediococcus, Cyanobacteria, Clostiridia và Propionobacteria [28]. Plantaricins JK, EF Các bacteriocin này đóng vai trò nhƣ những peptide hiệp lực. Chúng chứa 30 hoặc 40 dƣ lƣợng trong độ dài và có ít độ tƣơng đồng trong chuỗi đến các plantaricin khác.
Những bacteriocin này hoạt động với độ đặc hiệu nghiêm ngặt và sự kết hợp với các chất khác, ngoại trừ JK hoặc EF bị mất hiệp lực hoàn toàn [57]. Plantaricin S và Plantaricin W Plantaricin S là một hệ thống gồm 2 peptide đƣợc tách từ Lactobacillus plantarum sp. dùng trong việc lên men của olive xanh. Gene cấu trúc (α, β) chỉ ra rằng mỗi peptide ban đầu đƣợc sản xuất với 1 leader chứa glycin gấp đôi.
Những peptide này chứa 26 và 27 hàm lƣợng amino trong độ dài. Plantaricin S đƣợc công nhận trong việc kiểm soát quá trình lên men và bảo quản quả Olea europaea [57, 58]. Bacteriocin chứa 2 peptide khác là plantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb. Những thành phần lantiotic này gồm 29 và 32 hàm lƣợng amino acid.
Nisin Trang 15/130 BM20-QT. Vi sinh vật sinh tổng hợp nisin acteriocin đƣợc nghiên cứu nhiều nhất là nisin và đƣợc sinh tổng hợp bởi Lactococcus lactis sucsp. Lần đầu tiên nisin đƣợc phát hiện năm 1982 từ hiện tƣợng Streptococcus latis gây ức chế Lactococcus bulgaricus. Nisin đƣợc đặt xuất phát từ ý nghĩa “chất ức chế N’’ vì Lactococcus lactis ban đầu đƣợc phân vào nhóm N Streptococcus.
Lactococcus lactis là vi khuẩn gram âm đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất bơ và phomat, có dạng hình cầu hoặc chuỗi ngắn, dƣờng kính tế bào từ 0.15µm tùy thuộc vào điều kiện sinh trƣởng. Chúng bị ức chế trên môi trƣờng chứa 6% NaCl hoặc môi trƣờng quá kiềm (pH 9,6 trở lên) và có thể sinh trƣởng trong môi trƣờng sữa chứa 0,1% xanh methylene. Trong điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm Lactococcus lactis sinh trƣởng trên môi trƣờng thạch dƣới dạng khuẩn lạc màu vàng sáng. Chúng thực hiện quá trình lên men đồng hình, sinh ra acid lactic (+).
Tuy nhiên trong vài trƣờng hợp chúng cũng có thể sinh acid lactic (-) khi nuôi cấy trong điều kiện pH thấp. Khả năng tạo acid lactic là lý do tại sao loài Lac. lactic là vi khuẩn có vai trò quan trọng chủ yếu trong công nghiệp sữa nhƣ sản xuất sữa, sữa chua, phomat. lactic đƣợc thêm vào sữa, chúng sử dụng enzyme để sinh năng lƣợng ATP từ đƣờng lactose.
Acid lactic sinh ra bởi tế bào vi khuẩn làm đông sữa và đƣợc sử dụng để sản xuất phomat và sữa tƣơng. Nisin là một loại bacteriocin đƣợc khai thác và có ứng dụng rộng rãi nhất. Nó có hoạt tính chống lại vi khuẩn gram (+) gồm các vi sinh vật gây bệnh hoặc vi sinh vật gây hƣ hỏng thực phẩm gồm Samolnella aureus và Listeria monocytogernes. Ở Mỹ, việc sử dụng nó đã đƣợc chứng nhận bởi FDA từ năm 1988 trong phomai, súp lạnh đƣợc xử lý nhiệt và pho mát tiệt trùng đƣợc trữ lạnh.
Tính chất của nisin Khả năng tan: nisin là một peptide mang điện tích dƣơng nên mức độ hòa tan của nisin phụ thuộc rất nhiều vào pH. pH càng thấp thì khả năng tan càng tốt. Nisin hòa tan tốt nhất ở pH 2 (5,7 mg/ml) và giảm nhanh pH 8 (0,25 mg/ml). Hầu nhƣ Trang 16/130 BM20-QT.QLKH nisin không tan trong môi trƣờng trung tính hoặc kiềm.
Ngoài ra, mức độ hòa tan của nisin còn phụ thuộc vào dung dịch đệm. Tính bền nhiệt: nisin là một bacteriocin bền nhiệt. Ở nhiệt độ thấp từ 4 – 100C hoạt tính nisin hầu nhƣ không thay đổi trong một thời gian dài. Khi xử lý ở 10 – 600C trong 30 phút, hoạt tính nisin vẫn duy trì 80 – 90% hoạt tính ban đầu.