Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây đu đủ (Carica papaya Linn.), thuộc họ Đu đủ (Caricaceae), là loài cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng Trung Mỹ, hiện được di thực và canh tác phổ biến tại nhiều địa phương của Việt Nam. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng từ quả, các bộ phận của cây đu đủ như lá, thân, hạt và hoa từ lâu đã được ghi nhận trong y học dân gian để điều trị sốt rét, sốt xuất huyết, vàng da và điều hòa miễn dịch. Trong những năm gần đây, hoa đu đủ đực nhận được sự quan tâm đặc biệt trong cộng đồng và giới nghiên cứu y dược học nhờ công dụng phòng ngừa, hỗ trợ điều trị các bệnh lý đường hô hấp như viêm họng, ho hen, khản tiếng hoặc mất tiếng ở cả người lớn và trẻ nhỏ.

Các nghiên cứu hóa thực vật hiện đại đã xác định trong hoa đu đủ đực chứa nhiều nhóm hoạt chất sinh học có giá trị, nổi bật là các hợp chất nhóm flavonoid, glycosid, steroid, phenolic và acid hữu cơ. Nhiều thử nghiệm tiền lâm sàng đã chứng minh dịch chiết hoa đu đủ đực giàu flavonoid thể hiện hoạt tính sinh học đa dạng: gây độc tế bào ung thư (dòng MCF-7, Hep-G2, Hep3B, A549), chống oxy hóa dọn gốc tự do, kháng khuẩn (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis), hạ đường huyết và giảm đau. Trong số các flavonoid, quercetin là hoạt chất aglycon quan trọng có khả năng chống oxy hóa, kháng viêm và bảo vệ tim mạch. Tuy nhiên, phần lớn các công trình nghiên cứu trước đây tại Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang, chưa có tài liệu công bố quy trình chiết tách và định lượng cụ thể hàm lượng quercetin trong hoa đu đủ đực.

Mặt khác, trong y học cổ truyền, hỏa chế là phương pháp chế biến sử dụng tác động của nhiệt độ trực tiếp hoặc gián tiếp nhằm thay đổi tính năng, độ bền cơ học của tế bào thực vật, phân hủy độc chất hoặc làm biến đổi thành phần hoạt chất trong vị thuốc. Khi phát triển quy trình sản xuất cao dược liệu giàu hoạt chất, việc nghiên cứu tác động của nhiệt độ hỏa chế và các thông số chiết xuất lên hàm lượng hoạt chất mục tiêu là yêu cầu kỹ thuật tất yếu. Từ bối cảnh thực tiễn đó, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ của tác giả Nguyễn Thị Khánh Huyền được triển khai nhằm giải quyết hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
  2. Khảo sát ảnh hưởng của chế biến hỏa chế (nhiệt độ sấy, thời gian sấy) và các điều kiện chiết xuất (thời gian chiết, tỷ lệ dung môi/dược liệu, nồng độ ethanol) tới hàm lượng quercetin tạo ra khi thủy phân trong dịch chiết hoa đu đủ đực.

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là mẫu hoa đu đủ đực tươi, sau đó được rửa sạch, phơi khô và bảo quản trong túi kín. Mẫu dược liệu được thu hái tại huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình vào tháng 8 năm 2023, đã được ThS. Nghiêm Đức Trọng (Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội) giám định tên khoa học là Carica papaya Linn., họ Đu đủ (Caricaceae), lưu trữ tiêu bản với mã số HNIP/18826/24. Toàn bộ thực nghiệm được thực hiện tại Bộ môn Dược học cổ truyền, Khoa Dược liệu & Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội từ năm 2023 đến tháng 5 năm 2024.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận được xây dựng dựa trên lý thuyết hóa thực vật của nhóm hợp chất flavonoid và học thuyết chế biến thuốc cổ truyền. Quercetin ($C_{15}H_{10}O_7$, khối lượng phân tử 302,23 g/mol) là một flavonol aglycon kết tinh dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 316,5°C, không tan trong nước nhưng tan trong dung môi hữu cơ phân cực trung bình và cồn. Trong mô thực vật hoa đu đủ đực, quercetin chủ yếu tồn tại dưới dạng liên kết glycosid (như rutin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside). Dưới tác dụng xúc tác của acid vô cơ ở nhiệt độ cao, liên kết glycosid bị cắt đứt để giải phóng khung aglycon tự do là quercetin. Do đó, quy trình phân tích bắt buộc phải trải qua giai đoạn thủy phân acid (dung dịch $HCl\ 2N$ ở 70°C trong 2 giờ) và trung hòa bằng $Na_2CO_3$ về pH 5–6 trước khi chiết phân bố lỏng - lỏng bằng ethyl acetat.

Về phương diện chế biến cổ truyền, hỏa chế bao gồm các kỹ thuật tác động nhiệt như vi sao (50–80°C), sao vàng (100–140°C), sao vàng cháy cạnh/sao vàng hạ thổ (100–160°C) và sao đen/sao cháy (180–240°C). Nhiệt độ xử lý làm biến tính màng tế bào, giảm độ bền cơ học mô thực vật, giải phóng các hợp chất liên kết hoặc kích thích quá trình chuyển hóa nhiệt sinh học các tiền chất polyphenol thành aglycon tự do.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm trong khóa luận bao gồm các nội dung kỹ thuật sau:

  • Định tính: Sử dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC). Mẫu thử và mẫu đối chiếu quercetin ($100\ \mu g/ml$) được chấm trên bản mỏng silicagel $60GF_{254}$ tráng sẵn của hãng Merck (hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ). Hệ dung môi pha động khảo sát lựa chọn là toluen : ethyl acetat : acid formic (6 : 4 : 0,3 v/v). Phát hiện vết sắc ký dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm.
  • Định lượng bằng HPLC: Tiến hành trên hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản) gồm buồng cấp dung môi LC-20AD, buồng ổn nhiệt CTO-10AS, đầu dò UV-Vis photodiode array (DAD) SPD-M20A. Cột phân tích là cột pha đảo C18 Inertsustain GL Sciences ($250 \times 4,6\text{ mm}; 5\ \mu m$). Pha động rửa giải đẳng dòng gồm methanol : dung dịch acid phosphoric 0,1% (55 : 45 v/v), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, bước sóng phát hiện 370 nm, thể tích tiêm mẫu $20\ \mu L$.
  • Thẩm định quy trình phân tích: Thực hiện theo các tiêu chí hướng dẫn của Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức quốc tế (AOAC, 2023), bao gồm: độ phù hợp hệ thống (tiêm lặp lại 6 lần mẫu chuẩn và mẫu thử), độ đặc hiệu (so sánh mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn và kiểm tra hệ số tương đồng phổ DAD), khoảng tuyến tính và đường chuẩn (khảo sát dải nồng độ 25–800 $\mu g/ml$), độ chính xác (độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian qua 2 ngày, mỗi ngày 6 mẫu thử độc lập) và độ đúng (thực hiện phép thử thu hồi chuẩn ở 3 mức 75%, 100%, 125%).
  • Khảo sát hỏa chế và chiết xuất: Thực hiện phương pháp khảo sát đơn biến từng yếu tố: nhiệt độ sấy (80, 100, 120, 140, 160, 180, 200°C), thời gian sấy (15, 30, 45, 60, 90 phút), thời gian chiết siêu âm (30, 45, 60, 75, 90, 120 phút), tỷ lệ dung môi/dược liệu (10/1, 16/1, 18/1, 20/1, 24/1, 32/1 ml/g) và nồng độ dung môi ethanol (60%, 80%, 90%, 96%). Nguồn dữ liệu thu nhận hoàn toàn từ thực nghiệm đo phổ và diện tích pic sắc ký.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến đối tượng nghiên cứu và cơ sở lý thuyết của đề tài. Về thực vật học, tác giả mô tả vị trí phân loại học của Carica papaya Linn. theo hệ thống Takhtajan (2009), đặc điểm hình thái thân thảo phân nhánh giả, cấu tạo hoa đực mọc thành chùy xim phân nhánh dài ở kẽ lá, nhị xếp hai vòng trên ống tràng và nhụy tiêu giảm. Về phân bố sinh thái, cây ưa nhiệt độ 21–33°C, lượng mưa trên 1200 mm/năm và được trồng rộng rãi tại nhiều tỉnh thành ở Việt Nam.

Phần hóa thực vật tổng hợp chi tiết các nhóm chất đã được các nhóm tác giả trước phân lập từ hoa đu đủ đực:

  • Phân nhóm flavonoid: Rutin, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside, kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside, kaempferol-3-O-α-L-arabinopyranoside, quercetin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside và myricitrin.
  • Phân nhóm glycosid và phenolic: Benzyl-β-D-glucoside, acid gallic, vanillin.
  • Phân nhóm sterol: Stigmast-4-en-3-on, β-sitosterol 3-O-β-glucopyranosid, daucosterol, stigmasterol, saringosterol, cholest-5-en-3β,7β-diol.
  • Nhóm acid hữu cơ: Acid palmitic.

Tổng quan dược lý ghi nhận hoa đu đủ đực có hoạt tính gây độc tế bào ung thư MCF-7 ($IC_{50} = 55,875\ \mu g/ml$), Hep-G2 ($IC_{50} = 56,63\ \mu g/ml$); khả năng chống oxy hóa dọn gốc tự do DPPH với $IC_{50}$ dao động từ 17,47 đến 179,69 $\mu g/ml$; hoạt tính ức chế vi khuẩn S. aureus ở nồng độ 5% và kìm khuẩn E. coli với nồng độ ức chế tối thiểu $MIC = 2\text{ mg/ml}$; tác dụng giảm đau tại liều 300 mg/kg và điều hòa nồng độ lipoprotein máu trên mô hình động vật thực nghiệm.

Chương này cũng tổng hợp các nghiên cứu tiền đề về phương pháp hỏa chế trong y học cổ truyền và động học phân hủy nhiệt của quercetin, chỉ ra rằng xử lý nhiệt ở dải nhiệt độ thích hợp (như sấy ở 90–160°C trên một số dược liệu hành tím, Poincianella pyramidalis) có khả năng làm tăng hàm lượng quercetin tự do chiết tách được.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết nguồn gốc nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị phân tích và các bước tiến hành thực nghiệm. Mẫu hoa đu đủ đực thu hái tại Kim Bôi – Hòa Bình được làm khô và nghiền thành bột thô. Hóa chất phân tích gồm chất chuẩn quercetin có độ tinh khiết 97% (Macklin, CAS: 117-39-5), dung môi methanol dùng cho HPLC của hãng Merck; các hóa chất tinh khiết phân tích gồm $HCl$, ethyl acetat, $Na_2CO_3$, ethanol.

Quy trình chiết xuất và xử lý mẫu thử được chuẩn hóa: Cân chính xác 3,0000 g bột dược liệu, chiết siêu âm với 72 ml ethanol 90% trong 30 phút, lọc nóng thu dịch chiết. Dịch chiết được cô cạn còn khoảng 10 ml, bổ sung 20 ml dung dịch $HCl\ 2N$ và tiến hành thủy phân hồi lưu ở 70°C trong 2 giờ. Sau khi làm nguội, dịch thủy phân được trung hòa bằng $Na_2CO_3$ về pH 5–6, tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng 2 lần với ethyl acetat (mỗi lần 20 ml). Gộp lớp ethyl acetat, cô đuổi dung môi đến cắn khô, hòa tan cắn bằng 8 ml methanol kết hợp siêu âm, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút, chuyển dịch vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch và lọc qua màng lọc syringe 0,45 $\mu m$.

Hàm lượng quercetin trong dược liệu được tính theo công thức:

$$X (%) = \frac{(S - b) \times V \times 100}{a \times m \times (100 - A) \times 10^4}$$

Trong đó: $X$ là hàm lượng quercetin sau thủy phân (%); $S$ là diện tích pic quercetin (mAU.s); $a$ và $b$ là hệ số góc và hệ số chắn của đường chuẩn; $V$ là thể tích mẫu thử (10 ml); $m$ là khối lượng dược liệu (g); $A$ là hàm ẩm của dược liệu (xác định thực tế là 10,45%). Các tiêu chuẩn chấp nhận về thẩm định HPLC được thiết lập theo quy định của AOAC.

Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận

Chương 3 trình bày toàn bộ số liệu thực nghiệm, đồ thị sắc ký và thảo luận chuyên sâu về các kết quả đạt được:

  • Kết quả định tính bằng TLC: Trên sắc ký đồ dưới ánh sáng UV 254 nm và UV 366 nm, dịch chiết mẫu thử hoa đu đủ đực xuất hiện vết có màu sắc huỳnh quang và giá trị hệ số lưu giữ ($R_f \approx 0,44$) trùng khớp hoàn toàn với vết của chất đối chiếu quercetin, tách biệt rõ ràng khỏi các vết chất khác trong dịch chiết.
  • Xây dựng điều kiện sắc ký HPLC: Qua quét phổ UV từ 190 đến 400 nm của dung dịch chuẩn quercetin, chất phân tích có cực đại hấp thụ tại bước sóng 370 nm. Hệ pha động methanol : acid phosphoric 0,1% (55 : 45 v/v) với tốc độ dòng 1,0 ml/phút trên cột C18 cho pic quercetin cân đối, thời gian lưu ổn định ở khoảng 13,16–13,6 phút.
  • Kết quả thẩm định phương pháp định lượng:
Thông số thẩm định Tiêu chuẩn AOAC yêu cầu Kết quả thực nghiệm đạt được Đánh giá
Độ phù hợp hệ thống $RSD \le 2,0%$ đối với thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết $RSD < 2,0%$ trên 6 lần tiêm lặp lại của cả mẫu thử và mẫu chuẩn Đạt
Độ đặc hiệu Mẫu trắng không có pic tại $t_R$; pic mẫu thử trùng $t_R$ mẫu chuẩn; hệ số Match phổ $\ge 0,99$ Mẫu trắng không có tín hiệu; mẫu thêm chuẩn tăng diện tích pic; hệ số Match phổ DAD đạt 0,9961 Đạt
Khoảng tuyến tính Hệ số tương quan $R^2 \ge 0,99$ Khoảng 25 – 800 $\mu g/ml$; phương trình: $y = 82978x + 106$; $R^2 = 0,9976$ Đạt
Độ lặp lại trong ngày $RSD \le 5,3%$ (đối với hàm lượng 0,01% đến dưới 0,1%) Ngày 1: $RSD = 0,71%$ ($n=6$, hàm lượng trung bình 0,0484%); Ngày 2: $RSD = 1,26%$ ($n=6$, hàm lượng 0,0478%) Đạt
Độ chính xác trung gian $RSD \le 5,3%$ $RSD = 1,16%$ ($n=12$ qua 2 ngày); Hàm lượng trung bình 0,0481% Đạt
Độ đúng (thu hồi chuẩn) Tỷ lệ thu hồi đạt 90,0 – 107,0% ở mỗi mức nồng độ; $RSD \le 5,3%$ - Mức 75%: Thu hồi trung bình 97,03% ($RSD = 2,17%$);
- Mức 100%: Thu hồi trung bình 103,32% ($RSD = 0,26%$);
- Mức 125%: Thu hồi trung bình 101,74% ($RSD = 1,09%$)		 Đạt
  • Kết quả khảo sát hỏa chế và điều kiện chiết xuất:
Yếu tố khảo sát Dải điều kiện khảo sát Điều kiện cố định Kết quả tối ưu cho hàm lượng quercetin
Nhiệt độ sấy (hỏa chế) 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200°C Sấy 15 phút, chiết 60 phút, tỷ lệ DM/DL 20/1, cồn 60% Hàm lượng quercetin đạt đỉnh tại 160°C ($512,32\ \mu g/mg$). Nhiệt độ cao hơn làm suy giảm hoạt chất.
Thời gian sấy (hỏa chế) 15, 30, 45, 60, 90 phút Sấy ở 100°C, chiết 60 phút, tỷ lệ DM/DL 20/1, cồn 60% Hàm lượng quercetin đạt cao nhất tại 60 phút (tăng gấp khoảng 1,8 lần so với mẫu chưa xử lý).
Thời gian chiết siêu âm 30, 45, 60, 75, 90, 120 phút Dược liệu nguyên trạng, tỷ lệ DM/DL 20/1, cồn 60% Hàm lượng chiết đạt cực đại tại 30 phút. (Mức 75 phút tăng thứ cấp do bể siêu âm nóng lên).
Tỷ lệ dung môi/dược liệu 10/1; 16/1; 18/1; 20/1; 24/1; 32/1 (ml/g) Dược liệu nguyên trạng, chiết 60 phút, cồn 60% Hàm lượng quercetin hòa tan tăng dần và đạt đỉnh ở 24/1 ml/g (hoặc 20/1 ml/g khi cân đối dung môi).
Nồng độ ethanol 60%, 80%, 90%, 96% Dược liệu nguyên trạng, chiết 60 phút, tỷ lệ DM/DL 20/1 Đạt cực đại tại ethanol 90% ($473,69\ \mu g/ml$). Mức 96% làm đông tụ protein bề mặt tế bào gây giảm khuếch tán.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã định lượng được hàm lượng quercetin sinh ra sau thủy phân trong mẫu hoa đu đủ đực nguyên trạng thu hái tại Hòa Bình là 0,0481%. Quy trình định lượng bằng HPLC sử dụng cột C18, pha động methanol : acid phosphoric 0,1% (55 : 45 v/v), phát hiện DAD ở bước sóng 370 nm đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng toàn bộ các chỉ tiêu khắt khe của AOAC (2023) về tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính ($R^2 = 0,9976$), độ lặp lại ($RSD = 1,16%$) và độ đúng (thu hồi 97,03–103,32%).

Nghiên cứu cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định phương pháp hỏa chế (sấy nhiệt) tác động trực tiếp và làm gia tăng đáng kể hàm lượng quercetin tạo ra từ hoa đu đủ đực. Ở điều kiện nhiệt độ sấy 160°C trong thời gian 60 phút, hàm lượng quercetin tăng gần 1,8 đến 2 lần so với mẫu dược liệu không xử lý nhiệt. Mức nhiệt độ 160°C tương ứng với kỹ thuật sao đen/sao cháy trong y học cổ truyền, giúp phá vỡ các liên kết hóa học và cấu trúc màng tế bào thực vật, tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải phóng aglycon khi thủy phân.

So với các công trình nghiên cứu trước đây tại Việt Nam (vốn chỉ dừng lại ở việc định lượng flavonoid toàn phần hoặc chiết tách phân lập cấu trúc đơn thuần), đóng góp mới của đề tài là lần đầu tiên xây dựng hoàn chỉnh một phương pháp định lượng HPLC chuyên biệt cho quercetin sau thủy phân từ hoa đu đủ đực, đồng thời thiết lập được bộ thông số công nghệ chiết xuất tối ưu ở quy mô phòng thí nghiệm: nhiệt độ sấy 160°C, thời gian sấy 60 phút, dung môi ethanol 90%, tỷ lệ dung môi/dược liệu 20/1 (ml/g) và thời gian chiết siêu âm 30 phút.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận còn tồn tại một số giới hạn kỹ thuật được rút ra từ điều kiện thực nghiệm:

  • Quá trình chiết xuất sử dụng bể siêu âm hở chưa thể kiểm soát ổn định nhiệt độ dịch chiết trong suốt thời gian khảo sát; thời gian siêu âm kéo dài làm nước trong bể tự nóng lên, gây nhiễu biến thiên hàm lượng hoạt chất độc lập.
  • Việc khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện chế biến và chiết xuất mới chỉ tiến hành theo phương pháp khảo sát đơn biến (thay đổi từng yếu tố riêng lẻ, cố định các yếu tố còn lại), chưa áp dụng mô hình toán học tối ưu hóa đa biến (như phương pháp bề mặt đáp ứng Box-Behnken hay quy hoạch thực nghiệm) để khảo sát sự tương tác đồng thời giữa các thông số.
  • Nghiên cứu thực hiện trên một lô mẫu dược liệu duy nhất thu hái tại Kim Bôi, Hòa Bình vào tháng 8/2023, chưa đánh giá biến thiên hàm lượng quercetin theo mùa vụ, vùng địa lý hoặc giữa các giống đu đủ khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất:

  • Ứng dụng mô hình hóa thực nghiệm để tối ưu hóa đồng thời các thông số quy trình chiết xuất nhằm điều chế cao hoa đu đủ đực chuẩn hóa có hàm lượng quercetin cao.
  • Nghiên cứu mở rộng và nâng cấp quy mô quy trình công nghệ chiết xuất tạo cao dược liệu hoa đu đủ đực từ quy mô phòng thí nghiệm lên quy mô pilot và công nghiệp.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận tốt nghiệp này có giá trị ứng dụng và tham khảo học thuật trực tiếp đối với:

  • Sinh viên, học viên chuyên ngành Dược học, Dược liệu và Dược học cổ truyền: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về quy trình thủy phân hoạt chất glycosid giải phóng aglycon, kỹ thuật phân tích HPLC định lượng polyphenol và phương pháp thẩm định một quy trình phân tích định lượng dược liệu theo chuẩn quốc tế AOAC.
  • Các phòng kiểm nghiệm dược liệu và sản phẩm thảo dược: Cung cấp một quy trình định tính (TLC) và định lượng (HPLC) đã được thẩm định với đầy đủ các thông số thực nghiệm, có thể ứng dụng trực tiếp để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở kiểm soát chất lượng nguyên liệu hoa đu đủ đực.
  • Bộ phận nghiên cứu và phát triển (R&D) tại các doanh nghiệp sản xuất thuốc từ dược liệu và thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Sử dụng các dữ liệu về tác động của nhiệt độ hỏa chế (160°C, 60 phút) và dung môi chiết xuất (ethanol 90%, tỷ lệ 20/1, siêu âm 30 phút) để định hướng thiết kế quy trình sản xuất cao khô, cao lỏng hoa đu đủ đực có hoạt tính sinh học cao.

Câu hỏi thường gặp

1. Mẫu hoa đu đủ đực dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu và đã được thẩm định thực vật học như thế nào?
Dược liệu được thu hái tại huyện Kim Bôi, tỉnh Hòa Bình vào tháng 8 năm 2023. Mẫu nghiên cứu đã được ThS. Nghiêm Đức Trọng (Khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội) giám định định danh thực vật là loài Carica papaya Linn., thuộc họ Đu đủ (Caricaceae), và hiện được lưu trữ tiêu bản tại trường với mã số tiêu bản HNIP/18826/24.

2. Vì sao quy trình phân tích quercetin trong hoa đu đủ đực bắt buộc phải trải qua công đoạn thủy phân bằng acid?
Trong hoa đu đủ đực, quercetin phần lớn không tồn tại ở dạng tự do (aglycon) mà liên kết với các gốc đường tạo thành các phân tử flavonoid glycosid (như rutin, quercitrin, quercetin 3-O-β-D-galactopyranoside). Do đó, mẫu chiết cần được đun hồi lưu với dung dịch $HCl\ 2N$ ở 70°C trong 2 giờ để thủy phân hoàn toàn các liên kết glycosid, giải phóng toàn bộ khung quercetin tự do trước khi tiến hành chiết tách và định lượng trên HPLC.

3. Phương pháp định lượng HPLC quercetin trong đề tài đạt được các thông số thẩm định theo chuẩn AOAC như thế nào?
Phương pháp đạt độ đặc hiệu cao với hệ số tương đồng phổ DAD giữa pic mẫu thử và mẫu chuẩn đạt 0,9961; khoảng tuyến tính thiết lập từ 25 đến 800 $\mu g/ml$ với phương trình hồi quy $y = 82978x + 106$ ($R^2 = 0,9976$); độ lặp lại có $RSD = 1,16%$ ($n=12$); tỷ lệ thu hồi chất chuẩn đạt từ 97,03% đến 103,32% với $RSD \le 2,17%$, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của AOAC đối với hoạt chất có hàm lượng từ 0,01% đến dưới 0,1%.

4. Kỹ thuật hỏa chế (sấy nhiệt) tác động như thế nào đến hàm lượng quercetin trong hoa đu đủ đực?
Hỏa chế có tác động lớn nhất trong số các yếu tố khảo sát. Khi tăng nhiệt độ sấy từ 80°C đến 200°C, hàm lượng quercetin tăng dần và đạt đỉnh cao nhất tại 160°C ($512,32\ \mu g/mg$), sau đó giảm mạnh ở các mức nhiệt cao hơn. Khi khảo sát thời gian sấy ở 100°C, thời gian 60 phút cho hàm lượng quercetin cao nhất, tăng gấp khoảng 1,8 lần so với mẫu dược liệu nguyên trạng chưa qua xử lý nhiệt.

5. Vì sao khi tăng nồng độ ethanol chiết xuất lên 96% thì hàm lượng quercetin thu được lại suy giảm so với mức 90%?
Dung môi ethanol 90% cho hiệu suất chiết quercetin cao nhất ($473,69\ \mu g/ml$) do phù hợp với độ phân cực của phân tử quercetin. Khi tăng nồng độ ethanol lên 96%, cồn nồng độ quá cao làm đông tụ các chất protein và polysaccharid trên bề mặt tế bào dược liệu, làm co cụm mô tế bào, cản trở sự thấm sâu của dung môi và làm giảm tốc độ khuếch tán hoạt chất ra dịch chiết.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Khánh Huyền đã hoàn thành việc xây dựng và thẩm định quy trình định lượng quercetin sinh ra sau thủy phân từ hoa đu đủ đực bằng phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn AOAC với độ tin cậy và độ lặp lại cao. Nghiên cứu đã xác định hàm lượng quercetin trong hoa đu đủ đực nguyên trạng đạt 0,0481%, đồng thời làm sáng tỏ quy luật biến đổi hàm lượng hoạt chất dưới tác động của nhiệt độ hỏa chế và điều kiện chiết xuất. Kết quả chứng minh việc hỏa chế dược liệu ở 160°C trong 60 phút kết hợp chiết siêu âm với ethanol 90% (tỷ lệ dung môi/dược liệu 20/1 trong 30 phút) giúp nâng cao rõ rệt hàm lượng quercetin thu hồi, tạo cơ sở khoa học thực nghiệm vững chắc cho việc tiêu chuẩn hóa và phát triển quy trình sản xuất cao dược liệu hoa đu đủ đực quy mô lớn.