Định Danh Bằng Hình Thái Một Số Chủng Nấm Bào Ngư Xám Thương Mại

Khám phá cách định danh hình thái các chủng nấm bào ngư xám thương mại tại thị trường thành phố Hồ Chí Minh. Thông tin hữu ích cho người tiêu dùng.

• Tác giả: Bùi Thị Như Quỳnh
• Người hướng dẫn: TS. Hồ Bảo Thùy Quyên
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Nông Nghiệp - Môi Trường
• Đề tài: Định Danh Nấm Bào Ngư Xám Thương Mại Tại TP. Hồ Chí Minh
• Loại tài liệu: báo cáo khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: TPHCM

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu về nấm Bào ngư
• 1.2. Phân bố của nấm bào ngư
• 1.3. Các khóa phân loại thường sử dụng
• 1.3.1. Khóa phân loại nấm đến cấp chi bằng các đặc điểm đại thể
• 1.3.2. Khóa phân loại dựa trên sự kết hợp các đặc điểm hiển vi của các chi Friesian với khóa phân loại của Singer
• 1.3.3. Khóa phân loại của Daniel E.
• 1.3.4. Khóa phân loại mới nhất của Largent
• 1.3.5. Khóa phân loại của Lê Bá Dũng về các loài thuộc chi Pleurotus phân bố ở Tây Nguyên
• 1.4. Phân loại một số loài thuộc chi Pleurotus dựa trên đặc điểm hình thái
• 1.4.1. Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland
• 1.4.2. Pleurotus sajor-caju (Fr)
• 1.4.3. Pleurotus pulmonarius (Fr)
• 1.4.4. Pleurotus ostreatus (Jacq)
• 1.4.5. Phân biệt Pleurotus pulmonarius và Pleurotus ostreatus
• 1.5. Phương pháp định danh nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 1.5.1. Phương pháp PCR
• 1.5.2. Phương pháp PCR sequencing
• 1.6. Các nghiên cứu liên quan đến các loài thuộc chi Pleurotus ở Việt Nam
• 2. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và môi trường
• 2.3.1. Môi trường và hóa chất
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Thu thập và xử lý mẫu
• 2.4.2. Phân lập và giữ giống mẫu
• 2.4.3. Phân tích hình thái và định danh nấm
• 2.4.4. Định danh các chủng vi nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả làm thuần
• 3.2. Kết quả phân tích hình thái các mẫu nấm
• 3.2.1. Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA1a
• 3.2.2. Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XLA2b
• 3.2.3. Phân tích đặc điểm hình thái mẫu nấm XBT3b
• 3.2.4. Phân tích đặc điểm hình thái nấm XLA4a
• 3.3. Định danh dựa trên vùng trình tự ITS
• 3.3.1. Kết quả BLAST
• 3.3.2. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Định Danh Nấm Bào Ngư Xám Thương Mại Tại TP

Nấm bào ngư xám, thuộc chi Pleurotus, là một trong những loại nấm ăn phổ biến tại Việt Nam. Chúng không chỉ có giá trị dinh dưỡng cao mà còn có nhiều ứng dụng trong y học. Việc định danh nấm bào ngư xám là rất quan trọng để phân biệt các chủng khác nhau, từ đó nâng cao chất lượng sản phẩm và đáp ứng nhu cầu thị trường. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các đặc điểm hình thái của nấm bào ngư xám thương mại tại TP. Hồ Chí Minh.

1.1. Đặc điểm hình thái của nấm bào ngư xám

Nấm bào ngư xám có nhiều đặc điểm hình thái đặc trưng như mũ nấm rộng, màu sắc đa dạng và cuống nấm ngắn. Những đặc điểm này giúp phân biệt chúng với các loại nấm khác. Việc nhận biết chính xác các đặc điểm này là cần thiết để đảm bảo chất lượng nấm trong sản xuất.

1.2. Tầm quan trọng của nấm bào ngư trong ẩm thực

Nấm bào ngư xám không chỉ là thực phẩm bổ dưỡng mà còn có nhiều lợi ích cho sức khỏe. Chúng chứa nhiều vitamin và khoáng chất, giúp tăng cường hệ miễn dịch và phòng ngừa bệnh tật. Sự phổ biến của nấm bào ngư trong ẩm thực Việt Nam ngày càng gia tăng.

II. Vấn đề và Thách thức trong Định Danh Nấm Bào Ngư Xám

Mặc dù nấm bào ngư xám được sản xuất và tiêu thụ rộng rãi, nhưng việc định danh nấm vẫn gặp nhiều khó khăn. Các dòng nấm khác nhau thường bị nhầm lẫn do sự đa dạng về hình thái và đặc điểm sinh học. Điều này không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm mà còn gây khó khăn trong việc quản lý và phát triển ngành nấm.

2.1. Những khó khăn trong việc phân loại nấm

Việc phân loại nấm bào ngư xám gặp khó khăn do sự đa dạng về hình thái và môi trường sống. Nhiều loài mới được phát hiện nhưng chưa được xác định chính xác, dẫn đến nhầm lẫn trong thương mại.

2.2. Tác động của việc nhầm lẫn đến thị trường

Sự nhầm lẫn trong định danh nấm có thể dẫn đến việc tiêu thụ các sản phẩm kém chất lượng, ảnh hưởng đến uy tín của nhà sản xuất và sự tin tưởng của người tiêu dùng.

III. Phương pháp Định Danh Nấm Bào Ngư Xám Hiệu Quả

Để giải quyết vấn đề định danh nấm bào ngư xám, nhiều phương pháp đã được áp dụng. Các phương pháp này không chỉ dựa vào hình thái mà còn kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử để xác định chính xác các chủng nấm.

3.1. Phương pháp phân tích hình thái

Phân tích hình thái là phương pháp truyền thống để định danh nấm. Các đặc điểm như hình dáng, màu sắc và kích thước của mũ nấm, cuống nấm được ghi nhận và so sánh với các tài liệu đã công bố.

3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử trong định danh nấm

Kỹ thuật sinh học phân tử, như PCR và sequencing, giúp xác định chính xác các chủng nấm dựa trên trình tự gen. Phương pháp này mang lại độ chính xác cao hơn so với phương pháp hình thái.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn của Nghiên Cứu Định Danh Nấm Bào Ngư Xám

Nghiên cứu về định danh nấm bào ngư xám không chỉ có giá trị trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nấm tại TP. Hồ Chí Minh. Các kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong sản xuất và tiêu thụ nấm thương mại.

4.1. Cải thiện quy trình sản xuất nấm

Việc xác định chính xác các chủng nấm giúp cải thiện quy trình sản xuất, từ đó nâng cao năng suất và chất lượng nấm. Điều này cũng giúp nhà sản xuất chủ động hơn trong việc lựa chọn giống nấm phù hợp.

4.2. Tăng cường giá trị thương mại của nấm

Nghiên cứu định danh nấm bào ngư xám giúp tăng cường giá trị thương mại của sản phẩm. Sự phân biệt rõ ràng giữa các chủng nấm sẽ thu hút người tiêu dùng và mở rộng thị trường tiêu thụ.

V. Kết Luận và Tương Lai của Nghiên Cứu Định Danh Nấm Bào Ngư Xám

Nghiên cứu về định danh nấm bào ngư xám tại TP. Hồ Chí Minh đã chỉ ra tầm quan trọng của việc phân loại chính xác các chủng nấm. Tương lai của ngành nấm phụ thuộc vào việc áp dụng các phương pháp hiện đại trong định danh và sản xuất nấm.

5.1. Hướng đi mới cho ngành nấm

Ngành nấm cần tiếp tục nghiên cứu và áp dụng các công nghệ mới để nâng cao chất lượng sản phẩm. Việc đầu tư vào nghiên cứu sẽ giúp ngành nấm phát triển bền vững hơn.

5.2. Tầm quan trọng của giáo dục và đào tạo

Giáo dục và đào tạo về kỹ thuật nuôi trồng và định danh nấm là rất cần thiết. Điều này sẽ giúp nâng cao nhận thức của người sản xuất và người tiêu dùng về giá trị của nấm bào ngư xám.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nấm Bào ngư (Pleurotus spp.) là một trong những loại nấm ăn và nấm dược liệu quan trọng trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Loại nấm này có hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu protein, các vitamin nhóm B (B1, B2), vitamin PP, các acid amin thiết yếu và không làm tăng cholesterol máu. Bên cạnh đó, nấm còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học hỗ trợ miễn dịch, kháng u, kháng virus, hạ đường huyết và bảo vệ gan. Nhờ khả năng chuyển hóa tốt các cơ chất giàu cellulose và lignin từ phế phụ phẩm nông - lâm nghiệp (như mùn cưa, rơm rạ, bã mía, thân lõi ngô), nghề nuôi trồng nấm bào ngư đang phát triển mạnh tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.

Tuy nhiên, trong sản xuất và tiêu thụ thương phẩm, các dòng nấm bào ngư xám trên thị trường chủ yếu được phân biệt một cách cảm quan qua màu sắc, mùi vị hoặc địa phương sản xuất. Nhiều nghiên cứu trước đây tại Việt Nam tập trung vào kỹ thuật nuôi trồng, cơ chất, thành phần dinh dưỡng hoặc hoạt tính enzyme, trong khi việc xác định chính xác các dòng thuần ở cấp độ loài còn hạn chế. Hơn nữa, chi Pleurotus có tính đa hình thái cao và vùng phân bố rộng, dẫn đến tình trạng nhầm lẫn tên gọi khoa học giữa các loài có hình thái tương tự (chẳng hạn giữa Pleurotus pulmonarius, Pleurotus ostreatus, Pleurotus sajor-caju, Pleurotus cornucopiae).

Để giải quyết vấn đề này, đề tài được thực hiện với các mục tiêu và nội dung cụ thể:

1. Mục tiêu nghiên cứu: Định danh bằng hình thái kết hợp sinh học phân tử một số chủng nấm bào ngư xám thương mại đang được kinh doanh tại thị trường Thành phố Hồ Chí Minh.
2. Nội dung nghiên cứu:
   • Thu thập và xử lý các mẫu nấm bào ngư xám thương phẩm.
   • Phân lập, làm thuần và lưu giữ giống vi nấm.
   • Phân tích các đặc điểm hình thái đại thể và vi thể theo các khóa phân loại nấm chuyên ngành.
   • Định danh các chủng nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử (khuếch đại, giải trình tự vùng gen ITS, so sánh BLAST và dựng cây phát sinh loài).
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:
   • Đối tượng: 04 mẫu nấm bào ngư xám thương mại có nguồn gốc từ các trại trồng nấm tại Long An và Bến Tre, đang lưu thông trên thị trường TP. Hồ Chí Minh.
   • Thời gian thực hiện: Từ tháng 09/2018 đến tháng 05/2019.
   • Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phía Nam, Viện Nấm học và Công nghệ sinh học – Liên hiệp các Hội Khoa học kỹ thuật Việt Nam. Kinh phí thực hiện được hỗ trợ từ Đề tài Khoa học công nghệ cấp Bộ (Mã số B2018-MSB-09 của Bộ Giáo dục và Đào tạo).

STT	Ký hiệu mẫu	Nguồn gốc thu thập
1	XLA1a	Công ty nấm Minh Phương, Phường Khánh Hậu, TP. Tân An, Long An
2	XLA2b	Chợ Mới, Phường 2, TP. Tân An, Long An
3	XBT3b	Chợ Phường 2, TP. Bến Tre (Trại nấm Châu Thành)
4	XLA4a	Công ty nấm Minh Phương, Phường Khánh Hậu, TP. Tân An, Long An

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và hệ thống phân loại

Nghiên cứu áp dụng phương pháp phân loại tích hợp (polyphasic taxonomy), kết hợp các đặc trưng hình thái học truyền thống với phân tích dữ liệu phân tử:

• Khóa phân loại hình thái: Sử dụng kết hợp khóa phân loại của Friesian, khóa Singer, khóa phân loại của Daniel E. Stuntz, khóa phân loại chi Pleurotus ở Malaysia của Corner (1981), khóa phân loại mới của Largent (1977, 1988) và khóa phân loại các loài Pleurotus Tây Nguyên của Lê Bá Dũng (2003). Các tiêu chí đánh giá bao gồm: hình dạng, màu sắc, kích thước mũ nấm, kiểu đính cuống, dạng bào tầng, sự hiện diện của mấu nối (clamp connections), cấu trúc lớp bì mũ nấm, kiểu hệ sợi nấm (monomitic/dimitic), hình dạng và kích thước basidiole, đảm (basidia), liệt bào (cystidia) và bào tử đảm (basidiospores).
• Phân loại sinh học phân tử: Sử dụng vùng trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) thuộc cụm gen ribosome RNA (rRNA) – chỉ thị phân tử chuẩn quốc tế trong định danh nấm học.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm được triển khai tuần tự qua các giai đoạn:

1. Xử lý mẫu, phân lập và làm thuần:

   • Quả thể tươi được đo đạc kích thước bằng thước kẹp Calip, phân tích hình thái sơ bộ.
   • Quả thể non hoặc sắp thành thục được tách mô vô trùng, cấy phân lập trên môi trường thạch PDA (Potato Dextrose Agar) ở 25–27°C.
   • Cấy chuyền làm thuần hệ sợi nấm và cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng MYA (Malt Yeast Agar), bảo quản ở 4–5°C (mỗi chủng lưu giữ 4 đơn vị giống).
   • Quả thể mẫu được sấy khô ở 50–60°C và bảo quản trong túi polymer có hạt hút ẩm silicagel.

2. Phân tích giải phẫu vi thể:

   • Thực hiện vi phẫu mũ nấm, bào tầng để quan sát các cấu trúc hiển vi dưới kính hiển vi quang học.
   • Đo đạc kích thước tế bào (sợi nấm, lớp bì, basidiole, đảm, bào tử) bằng trắc vi thị kính và trắc vi vật kính.

3. Tách chiết DNA tổng số:

   • Tách chiết DNA bộ gen từ mẫu nấm theo quy trình CTAB cải tiến (Hosaka & Uno, 2011; Saghai-Maroof et al., 1984).
   • Nghiền mẫu với dung dịch CTAB 2x, ủ ở 65°C trong 1 giờ; chiết tách protein và tạp chất bằng CIA (Chloroform-Isoamyl alcohol); kết tủa DNA bằng Isopropyl alcohol ở -20°C; rửa sạch cặn DNA bằng Ethanol 70% và hòa tan trong đệm TE (pH 8,0).

4. Khuếch đại và kiểm tra vùng gen ITS:

   • Phản ứng PCR thể tích 25 µL sử dụng cặp mồi chuyên biệt ITS1 và ITS4 (White et al., 1990):
     • Thành phần: DreamTaq Buffer 1X (1,5 µL), dNTPs 0,2 mM (2,5 µL), mồi ITS1 0,2 µM (0,5 µL), mồi ITS4 0,2 µM (0,5 µL), DreamTaq DNA polymerase 0,05 U/µL (1,25 µL), DNA khuôn (2,5 µL), nước cất 2 lần (16,25 µL).
   • Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gel agarose 1,2% trong đệm TAE 0,5X (130V, 30 phút), nhuộm Gel Red và quan sát dưới hệ thống Geldoc.
   • Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit ISOLATE II PCR and Gel Kit (Bioline, Anh).

5. Giải trình tự và xử lý dữ liệu phát sinh loài:

   • Giải trình tự chuỗi nucleotide bằng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên hệ thống tự động Applied Biosystems 3500x DNA Analyzer.
   • Xử lý, cắt bỏ đoạn mồi và hiệu chỉnh chuỗi bằng phần mềm ATGC ver 8.
   • So sánh độ tương đồng chuỗi với cơ sở dữ liệu GenBank thông qua công cụ BLAST (NCBI).
   • Căn chỉnh chuỗi đa trình tự (multiple sequence alignment) bằng phần mềm MEGA ver 7.0, thu được khối dữ liệu 576 nucleotide (loại bỏ gap).
   • Xây dựng cây phát sinh loài bằng 3 thuật toán: Neighbor-Joining (NJ, mô hình p-distance), Maximum Parsimony (MP, thuật toán CNI on random trees) và Maximum Likelihood (ML, mô hình Kimura 2-parameter), kiểm tra độ tin cậy với 1000 lần lặp bootstrap. Loài Auricularia auricula-judae được chọn làm nhóm ngoại (outgroup).

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

Chương I hệ thống hóa toàn diện các tài liệu khoa học về chi nấm Bào ngư (Pleurotus):

• Đặc điểm sinh học và giá trị: Nấm bào ngư gồm khoảng 40 loài thuộc họ Pleurotaceae, có khả năng tiết enzyme phân hủy lignin và cellulose mạnh. Sản lượng nuôi trồng thế giới tăng trưởng nhanh chóng (đạt trên 3 triệu tấn vào năm 2005). Nấm vừa là thực phẩm giàu dinh dưỡng vừa là nguồn dược liệu quý chứa phức hợp polysaccharide liên kết protein phòng chống khối u và kháng khuẩn.
• Phân loại học và các khóa phân loại: Trình bày chi tiết các nguyên lý định danh của Friesian, Singer, Daniel E. Stuntz, Largent và Lê Bá Dũng. Mô tả hình thái chi tiết các loài thương mại phổ biến: Pleurotus cornucopiae, Pleurotus cystidiosus, Pleurotus sajor-caju, Pleurotus pulmonarius và Pleurotus ostreatus.
• Tiêu chí phân biệt P. pulmonarius và P. ostreatus: Hai loài này thường bị nhầm lẫn trong sản xuất. Buchanan (1993) và Guzmán (2000) chỉ ra các điểm sai khác cơ bản:
  • P. pulmonarius: Mũ nấm màu xám nâu nhạt đến trắng hơi vàng, kích thước nhỏ (<10–13 cm), cuống thường đính lệch gần giữa, quả thể phát triển thuận lợi vào mùa ấm/nhiệt đới, lớp bì mỏng (40–50 µm) chứa các sợi nấm vách dày.
  • P. ostreatus: Mũ nấm màu xám nâu đậm, kích thước lớn (12–18 cm), cuống đính lệch hẳn sang một bên, quả thể hình thành ở điều kiện lạnh, lớp bì dày hơn (90–120 µm).
• Nguyên lý sinh học phân tử: Trình bày cơ chế phản ứng PCR, phương pháp giải trình tự Sanger cổ điển và công nghệ giải trình tự tự động đánh dấu huỳnh quang huỳnh quang 4 màu qua mao quản. Điểm lại các nghiên cứu về nấm Pleurotus tại Việt Nam của Trịnh Tam Kiệt, Lê Xuân Thám, Lê Bá Dũng, Ngô Thị Phương Dung.

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương II mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất, môi trường nuôi cấy và quy trình thực hiện các nội dung nghiên cứu:

• Liệt kê đầy đủ hệ thống máy móc: Tủ cấy vô trùng, máy luân nhiệt PCR (Bio-Rad), máy điện di, hệ thống giải trình tự Applied Biosystems 3500x, máy đọc gel Geldoc, máy ly tâm, cân kỹ thuật, kính hiển vi quang học.
• Chuẩn bị hóa chất và môi trường: Môi trường PDA, MYA; hóa chất tách chiết CTAB, CIA, Isopropanol, đệm TE, TAE, Gel Red, bộ kit ISOLATE II.
• Trình bày sơ đồ nghiên cứu và quy trình thao tác chuẩn từ khâu thu thập mẫu ngoài thị trường, xử lý giải phẫu hình thái đến các bước sinh học phân tử và phân tích tin sinh học.

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Chương III trình bày chi tiết các số liệu thực nghiệm thu được từ 4 mẫu nấm nghiên cứu:

1. Kết quả làm thuần: Sau 2 tháng nuôi cấy, phân lập và làm thuần thành công 4 chủng từ 4 mẫu nấm thương phẩm ban đầu: XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a.

2. Kết quả phân tích đặc điểm hình thái:

   • Chủng XLA1a: Mũ nấm hình quạt hoặc gần tròn, màu xám sẫm, kích thước 50–120 x 80–150 mm, bề mặt trơn láng có lông tơ ở tâm, rìa uốn vào trong. Phiến dày, màu trắng, chạy từ mũ xuống đỉnh cuống. Cuống nấm màu trắng đính lệch, kích thước 3,5–8 x 0,7–2,2 cm, đáy có lông tơ. Vi thể: Basidiole hình am-pun (20–25 x 3,3–7 µm), lớp bì mũ dày 110–180 µm gồm các sợi nấm xếp song song thể nền, hệ sợi monomitic.
   • Chủng XLA2b: Mũ nấm dạng lồi, màu xám nâu nhạt, kích thước 5,5–8 x 4,6–6,3 cm. Cuống đính lệch, kích thước 4,5–6,2 x 1–1,2 cm, bề mặt có khe rãnh dọc phủ lông tơ. Vi thể: Sợi nấm thể nền bào tầng đường kính 4,7–9,7 µm, basidiole hình am-pun (20–25,5 x 4–8 µm), lớp bì dày 83–115 µm, hệ sợi monomitic.
   • Chủng XBT3b: Mũ nấm màu xám nâu nhạt, kích thước 4,5–7,5 x 4,6–5,4 cm. Cuống đính lệch, kích thước 0,6–1,2 x 3,3–6,2 cm. Quan sát thấy cấu trúc sinh sản hoàn chỉnh: Bào tử đảm hình trụ, không màu, bề mặt láng, kích thước 6,7–10,3 x 3–4 µm; đảm hình chùy kích thước 26–30 x 4–8 µm; basidiole hình am-pun (18–25 x 4–8 µm); lớp bì dày 80–150 µm; không có liệt bào; hệ sợi monomitic.
   • Chủng XLA4a: Quả thể mọc thành chùm lớn, mũ màu kem xám, kích thước 8,5–13,3 x 5–10 cm, đặc biệt rìa mũ uốn lượn sóng, bề mặt có lông tơ dài không phân nhánh có mấu nối. Cuống kích thước 55–70 x 1,5–3 mm. Vi thể: Basidiole hình am-pun (20–25 x 4–6 µm), lớp bì dày 80–120 µm, hệ sợi monomitic.

Chủng mẫu	Dạng & Kích thước mũ	Đặc điểm cuống	Kích thước Basidiole	Độ dày lớp bì	Hệ sợi
XLA1a	Quạt/tròn, xám sẫm (50–120 x 80–150 mm)	Đính lệch, trắng (3,5–8 x 0,7–2,2 cm)	20–25 x 3,3–7 µm	110–180 µm	Monomitic
XLA2b	Quạt/lồi, xám nâu nhạt (55–80 x 46–63 mm)	Đính lệch, có khe dọc (4,5–6,2 x 1–1,2 cm)	20–25,5 x 4–8 µm	83–115 µm	Monomitic
XBT3b	Quạt/lồi, xám nâu nhạt (45–75 x 46–54 mm)	Đính lệch, phình đáy (3,3–6,2 x 0,6–1,2 cm)	18–25 x 4–8 µm	80–150 µm	Monomitic
XLA4a	Quạt/phẳng, kem xám, mép lượn sóng (85–133 x 50–100 mm)	Mọc chùm, đính lệch (55–70 x 1,5–3 mm)	20–25 x 4–6 µm	80–120 µm	Monomitic

3. Kết quả định danh sinh học phân tử và phát sinh loài:
   • Kết quả so sánh BLAST trên GenBank cho thấy chuỗi ITS của cả 4 chủng XLA1a, XLA2b, XBT3b và XLA4a đều đạt độ bao phủ truy vấn (Query Cover) 100% và độ tương đồng nhận dạng (Percent Identity) 100% với loài Pleurotus pulmonarius.
   • Khối dữ liệu 576 nucleotide sau căn chỉnh được phân tích phát sinh loài. Cả 3 cây tiến hóa xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (ML), Neighbor Joining (NJ) và Maximum Parsimony (MP) đều cho kết quả thống nhất: 4 chủng nghiên cứu nằm chung trong một nhánh đơn vị phân loại (clade) với loài chuẩn Pleurotus pulmonarius với giá trị ủng hộ bootstrap đạt mức ý nghĩa cao (>50%).

STT	Ký hiệu mẫu	Độ bao phủ (%)	Độ tương đồng (%)	Tên loài tương đồng trên GenBank
1	XLA1a	100%	100%	Pleurotus pulmonarius
2	XLA2b	100%	100%	Pleurotus pulmonarius
3	XBT3b	100%	100%	Pleurotus pulmonarius
4	XLA4a	100%	100%	Pleurotus pulmonarius

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

• Kết luận: Đã làm thuần 4 chủng nấm bào ngư xám thương phẩm (XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a). Phân tích hình thái xác định các mẫu thuộc chi Pleurotus, mang nhiều đặc trưng tương đồng với nhóm loài P. pulmonarius / P. ostreatus. Phân tích vùng gen ITS và cây phát sinh loài (ML, NJ, MP) khẳng định cả 4 chủng nấm bào ngư xám thương mại nghiên cứu đều là loài Pleurotus pulmonarius.
• Kiến nghị: Cần tiếp tục thu thập các quả thể nấm ở giai đoạn thành thục hoàn toàn để thu thập bổ sung các chỉ số hình thái học còn thiếu (dấu ấn bào tử, cấu trúc đảm và liệt bào ở các mẫu non) nhằm hoàn thiện bộ dữ liệu đối chiếu hình thái - di truyền.

---

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả khoa học chính:

   • Phân lập và làm thuần thành công 04 chủng nấm bào ngư xám thương phẩm từ Long An và Bến Tre.
   • Thiết lập bộ dữ liệu chi tiết về đặc điểm hình thái đại thể (kích thước, dạng mũ, kiểu cuống, phiến) và cấu trúc hiển vi giải phẫu (chiều dày lớp bì, cấu trúc basidiole, hệ sợi nấm monomitic) của các chủng nghiên cứu.
   • Khuếch đại và giải trình tự thành công vùng gen ITS (chuỗi phân tích 576 bp), xác định chính xác danh tính phân loại học của cả 04 chủng nấm thương phẩm này là loài Pleurotus pulmonarius (độ tương đồng 100%).

2. Đóng góp vào thực tiễn:

   • Làm sáng tỏ tên khoa học của các giống nấm "bào ngư xám" đang được sản xuất tại khu vực phía Nam (vốn thường bị gọi không chính xác hoặc nhầm lẫn với Pleurotus ostreatus hoặc Pleurotus sajor-caju).
   • Cung cấp cơ sở khoa học chính xác phục vụ công tác quản lý giống, bảo tồn nguồn gen vi nấm và hỗ trợ các cơ sở sản xuất meo giống chủ động kiểm soát chất lượng chủng nấm trong sản xuất nông nghiệp.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các mẫu nấm thương phẩm thu thập từ thị trường khi phân tích chủ yếu ở giai đoạn quả thể non (trừ mẫu XBT3b), do đó một số tiêu chí hình thái vi thể như vết in dấu ấn bào tử (spore print), cấu trúc liệt bào (cystidia) và đảm sinh sản chưa được quan sát đầy đủ ở tất cả các mẫu.
• Hướng mở rộng: Thu thập và nuôi trồng quả thể đến giai đoạn trưởng thành hoàn toàn để hoàn thiện dữ liệu giải phẫu hiển vi; mở rộng phạm vi thu thập mẫu nấm bào ngư thương mại trên toàn địa bàn các tỉnh phía Nam.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ sinh học, Nông nghiệp, Sinh học: Tham khảo quy trình thực nghiệm tích hợp giữa phương pháp giải phẫu hình thái nấm lớn (Macrofungi) và kỹ thuật sinh học phân tử (tách chiết DNA bằng CTAB, PCR mồi ITS1/ITS4, phân tích BLAST, dựng cây phát sinh loài trên phần mềm MEGA).
• Kỹ thuật viên tại các trung tâm giống và trại nấm: Ứng dụng quy trình phân lập, giữ giống thuần khiết trên môi trường MYA/PDA và sử dụng các chỉ thị phân tử để kiểm định độ thuần của nguồn giống thương mại.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Bốn chủng nấm bào ngư xám trong nghiên cứu có nguồn gốc từ đâu?

Bốn chủng nấm được phân lập từ các mẫu nấm thương phẩm bán tại TP.HCM, có xuất xứ từ các trại nấm thuộc tỉnh Long An (Công ty nấm Minh Phương - TP. Tân An, Chợ Mới - TP. Tân An) và tỉnh Bến Tre (Chợ Phường 2 - Trại nấm Châu Thành), được ký hiệu lần lượt là XLA1a, XLA2b, XBT3b và XLA4a.

2. Kỹ thuật sinh học phân tử nào được dùng để định danh loài?

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR khuếch đại vùng trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer) với cặp mồi ITS1 và ITS4, sau đó giải trình tự chuỗi nucleotide bằng BigDye Terminator v3.1 trên hệ thống máy giải trình tự tự động 3500x DNA Analyzer. Dữ liệu chuỗi được so sánh BLAST trên GenBank (NCBI) và phân tích cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 7.0.

3. Kết quả định danh cuối cùng của 4 chủng nấm này là gì?

Cả 4 chủng nấm bào ngư xám thương mại (XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a) đều được định danh chính xác là loài Pleurotus pulmonarius với độ bao phủ truy vấn 100% và độ tương đồng 100% trên cơ sở dữ liệu GenBank, đồng thời cùng nằm trong một nhóm đơn ngành trên cây phát sinh loài.

4. Vì sao phân tích hình thái đơn thuần khó định danh chính xác loài ở các mẫu này?

Chi Pleurotus có sự biến thái hình thái lớn chịu ảnh hưởng của môi trường và các loài như P. pulmonarius, P. ostreatus, P. cornucopiae có nhiều đặc điểm vi học và đại thể tương đồng. Ngoài ra, các mẫu nấm thương phẩm thu thập từ thị trường thường còn non, thiếu các cấu trúc sinh sản thành thục như dấu in bào tử, đảm và liệt bào hoàn chỉnh, đòi hỏi phải kết hợp giải trình tự gen để khẳng định loài.

5. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng những phương pháp nào và dùng loài ngoại nhóm nào?

Khối dữ liệu 576 nucleotide vùng gen ITS được phân tích bằng 3 phương pháp độc lập gồm: Maximum Likelihood (ML - mô hình Kimura 2-parameter), Neighbor Joining (NJ - mô hình p-distance) và Maximum Parsimony (MP - thuật toán CNI on random trees) với 1000 lần lặp bootstrap. Loài Auricularia auricula-judae được sử dụng làm nhóm ngoại (outgroup).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Bùi Thị Như Quỳnh đã hoàn thành việc phân lập, làm thuần và phân tích toàn diện các đặc điểm hình thái học đại thể, vi thể kết hợp với chỉ thị phân tử vùng gen ITS cho 04 chủng nấm bào ngư xám thương phẩm tại TP. Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên cứu khẳng định cả 4 chủng nấm khảo sát (XLA1a, XLA2b, XBT3b, XLA4a) đều thuộc loài Pleurotus pulmonarius với độ tin cậy tuyệt đối (độ tương đồng 100%). Đề tài cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học chuẩn xác, góp phần giải quyết tình trạng nhầm lẫn danh pháp và nâng cao hiệu quả công tác quản lý, sản xuất meo giống nấm bào ngư tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1. Giới thiệu về nấm Bào ngư Nấm Bào ngư (nấm Sò: Oyster) rất phong phú và đa dạng, bao gồm khoảng 40 loài, cho đến nay hầu như các nhà nghiên cứu đều thống nhất chúng thuộc chi Pleurotus (Fr. Một số nhà nấm học coi chúng là một họ riêng Pleurotaceae. Các nấm Bào ngư Pleurotus spp.

có khả năng chuyển hoá các chất xơ sợi giàu cellulose và lignin - thực chất là khả năng phân hủy các polysacchride tự nhiên để tạo nên nguồn carbon cho nấm sinh trưởng phát triển (Lê Xuân Thám, 2010). Loại nấm này có tính thích nghi rộng và có thể trồng được trên các loại phế phẩm công - nông nghiệp khác nhau như bông vải, rơm rạ, mùn cưa, thân cây gỗ, thân lõi ngô, trấu và bã mía (Lê Vĩnh Thúc, 2015) nhờ đó hầu hết các loại phụ phế liệu, các chất phế thải của nông, lâm, công nghiệp đều có thể được nấm Bào ngư sử dụng hiệu quả. Đây là nguồn tài nguyên nấm quý đang được công nghệ hóa rộng rãi ở Việt Nam, góp phần phát triển nông thôn, miền núi và giải quyết các loại phụ, phế liệu công, nông, lâm nghiệp giàu chất xơ, góp phần cung cấp sinh khối có giá trị kinh tế cao, bã thải lại là nguồn phân bón sinh học sạch sinh thái. Do vậy, sản lượng nấm Bào ngư nuôi trồng trên thế giới từ 1986-1991 đã tăng rất nhanh: gần 450% (1993), đến 2005 đã tăng tới hơn 3 triệu tấn.

Không chỉ có giá trị là thực phẩm giàu dinh dưỡng, nấm Bào ngư còn là nguồn dược liệu có tính kháng sinh (P.) và phòng chống ung thư với polysaccharides liên kết protein tách từ Pleurotus ostreatus (Fr. sajor-caju (Fr. Với hơn 20 loài và chủng được nuôi trồng trên toàn thế, chi Pleurotus là một trong những nhóm nấm trồng đa dạng nhất. Cho đến nay, quan hệ di truyền, cũng như việc phân loại các loài thuộc chi Pleurotus vẫn chưa được hiểu rõ và chưa thống nhất.

Kirk và cộng sự (2008) đã phân loại các loài thuộc chi Pleurotus thành khoảng 20 loài. Nguyên nhân khiến việc phân loại nhóm nấm này trở nên phức tạp và thường xuyên bị nhầm lẫn là do sự đa dạng trong hình thái và đặc điểm phân bố rộng khắp trên toàn thế giới của chúng. Rất nhiều loài mới khi đưa vào nuôi trồng và thương mại hóa đã được gọi bằng những tên không chính xác như loài P. pulmonarius ở Ấn Độ thường bị nhầm là P.

sajor – caju và loài P. ostreatus thường bị gọi nhầm là P. florida ở châu Âu (David và cộng sự, 2011). SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 3 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM Báo cáo khóa luận tốt nghiệp 2019 1.

Phân bố của nấm bào ngư Nấm Bào ngư rất phong phú và đa dạng, bao gồm khoảng 40 loài, cho đến nay các nghiên cứu đều thống nhất chúng thuộc chi Pleurotus (Fr. Ở Việt Nam cho đến nay đã ghi nhận khoảng 15 loại nấm Bào ngư: P. blaoensis, tuy nhiên số loài lưu mẫu thực sự rất ít, không quá 9 loài. Phần lớn các cơ sở khác chỉ có 2- 3 loài mà thôi.

Không thấy ghi nhận loài nào có độc, hầu hết các loài Pleurotus đều dược Singer ghi nhận là có thể ăn được; thực tế quá nửa số loài trên đã được nuôi trồng phổ biến ở nước ta. abalonus được nuôi trồng xuất khẩu, được thị trường khu vực và thế giới coi trọng (Lê Xuân Thám, 2010). Có nhiều nghiên cứu về số lượng loài Pleurotus ở các quốc gia. Theo Lê Xuân Thám có 4 loài gồm P.

salmoneostramineus ở Nhật Bản. Ở Mexico có 8 loài thương mại phổ biến nhất, trong đó thì P. djamor là quan trọng nhất. Hầu hết chúng đều có nguồn gốc từ Mỹ và Châu Âu, ngoại trừ P.

Nhiều công ty trồng các loài Pleurotus trong các trang trại nhỏ, bắt đầu ở khu vực Xalapa trong những năm 1980 và dần lan rộng đến các thành phố lớn của Mexico (Guzmán, 2000). Theo Lechner và các cộng sự (2004) đã miêu tả thì chi Pleurotus tại Argentina gồm có các loài Pleurotus albidus, Pleurotus cystidiosus, Pleurotus djamor, Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius và Pleurotus rickii Bresadoa. Còn tại Malaysia, số lượng loài của Pleurotus cũng khá đa dạng, được chia thành nhiều nhóm dựa trên các đặc điểm khác nhau và hình thái, gồm nhóm A là các loài có hệ sợi dimitic với các tế bào dạng nhánh xương, mũ trơn hoặc có lông tơ hướng về chân, không có bao gốc như các loài P. luctuosus, P problematicus, còn nhóm B là các loài có hệ sợi monomitic như P.

japonicus và một số loài không có mấu nối và cysistidia như P. omnivagus, và một số nhóm khác. SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 4 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM Báo cáo khóa luận tốt nghiệp 2019 1. Các khóa phân loại thường sử dụng 1.

Khóa phân loại nấm đến cấp chi bằng các đặc điểm đại thể Theo Friesian, chi Pleurotus bao gồm các loại nấm có phần rìa phiến bằng phẳng, thuộc nhóm pleurotoid, gồm các đặc điểm: mũ nấm có nhiều thịt, mềm dẻo, màu sắc bề mặt mũ đa dạng, cuống thường không có hoặc nếu có thường ngắn, mọc lệch hoặc biến dị, thường không có bao gốc. Bào tầng dạng phiến không tách ra theo chiều dọc, không xoăn hoặc lượn sóng, phẩn rìa thường bắng phẳng, không có răng cưa, không có dạng sáp. Bào tử có màu trắng đến màu hoa cà nhạt, thường mọc trên gỗ (Largent. Khóa phân loại dựa trên sự kết hợp các đặc điểm hiển vi của các chi Friesian với khóa phân loại của Singer Largent đã dựa trên những đặc điểm của các loài trong nhóm chi của Friesian và khóa phân loại của Singer để miêu tả chi Pleurotus mang các đặc điểm gồm bề mặt mũ thường có lông măng và chúng cũng không chứa dextrin, phần thịt mũ không có trạng thái hóa keo; phần mô của bào tầng nếu không mang hạt sẽ chuyển sang màu xanh lá cây ngã sang xanh dương khi tác dụng với KOH, các sợi nấm ở bào tầng đan xen không theo quy luật; bào tử hình trụ, không chứa tinh bột hay dextrin; không có các clamp (mấu nối); các cheilocystidia nếu có trên phần rìa mép của bào tầng thường nhỏ, mỏng manh, không dễ thấy; rìa bào tầng đều bằng phẳng (không có dạng răng cưa) khi trưởng thành; quả thể không phát sáng, mọc trên gỗ hoặc nền đất, không mọc trên các thực vật như rong rêu (Largent và Watling, 1977).

Khóa phân loại của Daniel E. Stuntz Trong khóa phân loại này, chi Pleurotus được miêu tả thuộc nhóm Pleurotoid với các đặc điểm: quả thể mọc độc lập, không mọc trên các loại nấm khác, mũ nấm mềm mịn, có nhiều thịt. Cuống nấm ngắn thường đính lệch một bên, bào tử có màu trắng tới màu vàng nhạt, hoặc màu kem đến màu hoa cà nhạt; các phiến có thể phân bố dày hoặc mỏng, cuộn vòng quanh, không thường xoăn hay uốn cong, lượn sóng, phần rìa phiến bằng phẳng, không có răng cưa. SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 5 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM Báo cáo khóa luận tốt nghiệp 2019 Về các đặc điểm hiển vi, Pleurotus có hệ sợi monomitic với vách mỏng hoặc dày, dấu in bào tử đa dạng; cheilocystidia hình thành ở phần rìa phiến, còn pleurocystidia có thể có hoặc không nhưng không bao giờ có dạng metuloid (Largent và Watling, 1977).

Khóa phân loại mới nhất của Largent Chi Pleurotus được xếp trong họ Tricholomataceae được phân biệt với các chi khác qua các đặc điểm: basidia không có các cấu trúc hạt chứa sắt; bào tử có sắc tố xanh hoặc không; bào tử đảm (basidiospores) không có tinh bột hoặc dextrin; bào tử có màu trắng, kem hoặc vàng nhạt; cuống thường mọc lệch tâm hoặc không có, hình trụ hoặc gần hình trụ; bào tầng dạng phiến mỏng, rìa phiến trơn, bằng phẳng, bào tầng phát triển tốt; quả thể không mọc trên rêu, mũ nấm lớn và có nhiều màu sắc. Đặc điểm riêng của chi được miêu tả gồm quả thể hầu như có kích thước từ vừa đến lớn, đường kính trung bình của mũ khoảng từ 2- 5cm. Bề mặt mũ thường trơn, không có lông, nếu có thường có lông măng, màu sắc mũ đa dạng như trắng, xám, nâu, vàng đất, xanh dương, hiếm khi có xanh lá. Bào tầng thường có màu trắng hoặc kem nhạt, rìa phiến thường bằng phẳng và chạy dọc về phía cuống.

Bào tử thường gồm các màu trắng, kem hoặc xám tím. Cuống thường ngắn, đính lệch tâm, hiếm khi không có cuống, một số loài có vòng bao chân. Môi trường sống chủ yếu là gỗ, một số hiếm mọc trên nền đất và thường xuất hiện ở những nơi mà thực vật bị chôn vùi. Bào tử có dạng hình trụ hoặc gần hình trụ, trơn, không chứa tinh bột; hệ sợi nấm phân bố không theo quy luật với vách có độ dày mỏng khác nhau (Largent và Baroi, 1988).

Khóa phân loại của Lê Bá Dũng về các loài thuộc chi Pleurotus phân bố ở Tây Nguyên Trong khóa này, chi Pleurotus được miêu tả gồm các đặc điểm như mũ nấm chất thịt, ít khi chất bì dai hay chất màng, cuống nấm chất thịt lệch, ở bên hoặc không có, gắn liền với tổ chức của mũ nấm. Phiến nấm lõm, mọc thẳng, mọc dài hoặc do phát triển từ giữa mà ra. Bào tử không màu, ít khi có màu hồng nhạt hay tím nhạt, hình chữ nhật dài đến hình hạt đậu, không có thể hình cầu (Lê Bá Dũng, 2003). SVTH: BÙI THỊ NHƯ QUỲNH 6 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TPHCM Báo cáo khóa luận tốt nghiệp 2019 1.

Phân loại một số loài thuộc chi Pleurotus dựa trên đặc điểm hình thái Pleurotus cornucopiae (Paulet) Rolland Đồng danh: Pleurotus cornucopiae var. cornucopiae (Paulet) Rolland 1910, Pleurotus cornucopiae subsp. cornucopiae (Paulet) Rolland 1910, Pleurotus ostreatus var. cornucopiae (Paulet) Pilát 1935, Pleurotus ostreatus f.

1886, Pleurotus sapidus Sacc. Mũ nấm rộng 40 – 150 (– 300) mm, lồi lên khi tai nấm còn non, sau đó tai nấm sẽ hạ xuống và lõm ở trung tâm, rìa mép tai nấm thẳng hoặc cong vào, tai nấm dày, có màu nâu xám nhạt đến màu vàng kem hơi nâu, bề mặt mũ trơn láng, tuy nhiên ở giữa tai nấm có một ít cụm lông tơ, đôi khi rìa mép tai nấm cũng có một ít lông tơ. Các phiến nấm nằm sát khít nhau, chạy từ rìa mép mũ nấm đến gần chân cuống nấm, tạo thành những rãnh liên kết nhau như mạng lưới bao phủ gần hết cuống nấm. Phiến khá mỏng, chiều rộng ≤ 10 mm, có màu xanh xám đến màu màu đất son; rìa mép phiến khá nguyên vẹn và cùng màu với phiến hoặc có màu hơi nâu hơn.

Cuống nấm có kích thước 30 – 110 x 10 – 20 mm, đính gần tâm hoặc đính lệch. Các cuống liên kết với nhau thành chùm.