Đánh Giá Tác Dụng Giảm Đau, Chống Viêm Của Viên Nang Cao Hy Thiêm Trên Động Vật Thực Nghiệm

Viên nang cứng chứa cao khô từ bài thuốc cổ truyền cao hy thiêm cho thấy tác dụng giảm đau và chống viêm hiệu quả trên động vật thực nghiệm.

• Người hướng dẫn: Trần Thị Vân Anh
• Trường học: Đại học Hà Nội
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Đánh Giá Tác Dụng Giảm Đau và Chống Viêm Của Cao Hy Thiêm
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH ẢNH
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguyên nhân gây viêm
• 1.2. Phân loại viêm
• 1.3. Cơ chế bệnh sinh
• 1.4. Thuốc chống viêm
• 1.5. Phân loại cảm giác đau
• 1.6. Receptor với cảm giác đau
• 1.7. Các thuốc giảm đau
• 1.8. Tổng quan về các mô hình chống viêm giảm đau được nghiên cứu trên động vật thực nghiệm
• 1.9. Tổng quan về bài thuốc Cổ truyền Hy Thiêm
• 1.10. Tình hình nghiên cứu thảo dược có tác dụng chống viêm, giảm đau
• 1.11. Bài thuốc Hy Thiêm
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên vật liệu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thuốc đối chứng và hoá chất dùng trong nghiên cứu
• 2.4. Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
• 2.5. Động vật sử dụng trong nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7. Định lượng kirenol, darutosid và darutigenol trong cao khô Hy thiêm
• 2.8. Nghiên cứu độc tính cấp
• 2.9. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp
• 2.10. Nghiên cứu tác dụng giảm đau
• 2.11. Xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Kết quả định lượng Kirenol, darutosid và darutigenol trong mẫu cao dùng để đóng nang
• 3.2. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp
• 3.3. Kết quả nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp
• 3.4. Kết quả nghiên cứu tác dụng giảm đau cấp
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Về độc tính cấp
• 4.2. Tác dụng chống viêm cấp
• 4.3. Tác dụng giảm đau
• KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Tác Dụng Giảm Đau Của Cao Hy Thiêm

Cao Hy Thiêm, một loại thảo dược truyền thống, đã được nghiên cứu để đánh giá tác dụng giảm đau và chống viêm. Nghiên cứu cho thấy cao Hy Thiêm có khả năng làm giảm cơn đau hiệu quả, đặc biệt trong các trường hợp viêm khớp và đau nhức xương khớp. Các thành phần hoạt chất trong cao Hy Thiêm như kirenol và darutosid đã được xác định có tác dụng sinh học mạnh mẽ, giúp cải thiện tình trạng đau nhức cho người bệnh.

1.1. Tác Dụng Giảm Đau Của Cao Hy Thiêm

Cao Hy Thiêm đã được chứng minh có tác dụng giảm đau hiệu quả trong nhiều nghiên cứu. Các thí nghiệm trên động vật cho thấy cao Hy Thiêm làm giảm đáng kể số cơn đau quặn và thể tích bàn chân bị viêm, cho thấy khả năng giảm đau vượt trội của nó.

1.2. Cơ Chế Tác Dụng Của Cao Hy Thiêm

Cao Hy Thiêm hoạt động thông qua việc ức chế các chất trung gian gây viêm như cytokine và prostaglandin. Điều này giúp giảm viêm và đau nhức, mang lại hiệu quả điều trị cao cho người bệnh.

II. Vấn Đề Và Thách Thức Trong Nghiên Cứu Cao Hy Thiêm

Mặc dù cao Hy Thiêm có nhiều lợi ích, nhưng việc nghiên cứu và ứng dụng nó trong điều trị vẫn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề chính là thiếu thông tin về liều lượng và cách sử dụng hiệu quả. Ngoài ra, cần có thêm nhiều nghiên cứu lâm sàng để khẳng định tính an toàn và hiệu quả của cao Hy Thiêm.

2.1. Thiếu Thông Tin Về Liều Lượng Sử Dụng

Hiện tại, chưa có hướng dẫn cụ thể về liều lượng sử dụng cao Hy Thiêm cho các bệnh lý khác nhau. Điều này gây khó khăn cho việc áp dụng trong thực tiễn điều trị.

2.2. Cần Nghiên Cứu Lâm Sàng Để Khẳng Định Hiệu Quả

Nghiên cứu lâm sàng là cần thiết để xác định rõ ràng tác dụng và độ an toàn của cao Hy Thiêm. Các nghiên cứu này sẽ giúp củng cố niềm tin vào việc sử dụng cao Hy Thiêm trong điều trị.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tác Dụng Giảm Đau Của Cao Hy Thiêm

Nghiên cứu tác dụng giảm đau của cao Hy Thiêm thường được thực hiện thông qua các thí nghiệm trên động vật. Các phương pháp này giúp đánh giá chính xác hiệu quả của cao Hy Thiêm trong việc giảm đau và chống viêm.

3.1. Thí Nghiệm Trên Động Vật Thực Nghiệm

Các thí nghiệm trên chuột nhắt trắng đã chỉ ra rằng cao Hy Thiêm có khả năng giảm đau hiệu quả. Số liệu cho thấy sự giảm đáng kể số cơn đau quặn sau khi tiêm cao Hy Thiêm.

3.2. Đánh Giá Tác Dụng Chống Viêm

Nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng cao Hy Thiêm có tác dụng chống viêm mạnh mẽ, giúp giảm thể tích bàn chân chuột sau khi gây viêm, cho thấy khả năng điều trị viêm hiệu quả.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Cao Hy Thiêm Trong Điều Trị

Cao Hy Thiêm không chỉ được sử dụng trong y học cổ truyền mà còn đang dần được áp dụng trong y học hiện đại. Các sản phẩm từ cao Hy Thiêm đang được phát triển để phục vụ nhu cầu điều trị đau nhức và viêm cho bệnh nhân.

4.1. Sản Phẩm Từ Cao Hy Thiêm

Nhiều sản phẩm từ cao Hy Thiêm đã được phát triển, bao gồm viên nang và cao lỏng, giúp người bệnh dễ dàng sử dụng và tiếp cận.

4.2. Kết Quả Nghiên Cứu Ứng Dụng

Kết quả từ các nghiên cứu cho thấy cao Hy Thiêm có thể là một lựa chọn điều trị hiệu quả cho các bệnh nhân bị đau nhức xương khớp, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống.

V. Kết Luận Về Tác Dụng Giảm Đau Của Cao Hy Thiêm

Cao Hy Thiêm là một thảo dược có tiềm năng lớn trong việc giảm đau và chống viêm. Nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng cao Hy Thiêm có thể là một giải pháp hiệu quả cho những người mắc các bệnh lý liên quan đến đau nhức và viêm.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Cao Hy Thiêm

Nghiên cứu về cao Hy Thiêm cần được tiếp tục để khám phá thêm nhiều ứng dụng mới trong điều trị. Điều này sẽ giúp nâng cao giá trị của cao Hy Thiêm trong y học.

5.2. Khuyến Khích Sử Dụng Cao Hy Thiêm

Việc khuyến khích sử dụng cao Hy Thiêm trong điều trị sẽ giúp người bệnh có thêm lựa chọn an toàn và hiệu quả, đồng thời góp phần bảo tồn và phát triển y học cổ truyền Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong thực hành lâm sàng, viêm và đau là những phản ứng sinh lý bệnh phổ biến, xuất hiện đồng thời trong nhiều bệnh cảnh cấp tính và mạn tính, đặc biệt là các bệnh lý cơ xương khớp. Mặc dù các nhóm thuốc tân dược như thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) và thuốc giảm đau nhóm opioid mang lại hiệu quả nhanh chóng, việc sử dụng kéo dài thường đi kèm các biến cố bất lợi nghiêm trọng như viêm loét dạ dày - tá tràng, xuất huyết tiêu hóa, tổn thương tế bào gan, suy giảm chức năng thận, tai biến tim mạch hoặc nguy cơ dung nạp và nghiện thuốc. Do đó, xu hướng nghiên cứu và phát triển các chế phẩm thuốc có nguồn gốc từ thảo dược y học cổ truyền nhằm nâng cao tính an toàn và hạn chế tác dụng không mong muốn đang là một định hướng quan trọng trong ngành Dược.

Cây Hy thiêm (Sigesbeckia orientalis L., họ Cúc - Asteraceae) là vị thuốc nam phân bố phổ biến tại các tỉnh miền núi, trung du phía Bắc và Tây Nguyên của Việt Nam. Theo y học cổ truyền, Hy thiêm có tính hàn, vị đắng, quy kinh can và thận, có công năng khu phong thấp, lợi gân cốt, hoạt huyết, giảm độc và an thần, thường được sử dụng trong các bài thuốc chủ trị phong thấp tê bại, đau nhức xương khớp. Nhằm hiện đại hóa dạng bào chế và cung cấp các bằng chứng tiền lâm sàng có giá trị thực nghiệm, đề tài khóa luận "Đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm cấp của viên nang cứng chứa cao khô từ bài thuốc cổ truyền Cao Hy Thiêm trên động vật thực nghiệm" đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể gồm hai nhiệm vụ:

1. Nghiên cứu độc tính cấp của viên nang cứng chứa cao khô Hy thiêm trên động vật thực nghiệm.
2. Đánh giá tác dụng chống viêm, giảm đau cấp của viên nang cứng chứa cao khô Hy thiêm trên động vật thực nghiệm.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bột viên nang cứng chứa cao khô Hy thiêm (mỗi viên chứa 368 mg cao khô Hy thiêm và tá dược vừa đủ nang số 0) do Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội bào chế.
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Phạm vi thời gian và mẫu thử: Đề tài hoàn thành vào tháng 05/2023, thực hiện trên động vật gặm nhấm tiêu chuẩn gồm chuột nhắt trắng chủng Swiss và chuột cống trắng chủng Wistar.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về sinh lý bệnh của phản ứng viêm và cơ chế truyền dẫn cảm giác đau:

• Cơ chế bệnh sinh của viêm: Phản ứng viêm cấp tính gồm các giai đoạn biến đổi tuần hoàn (co mạch tức thời, giãn tiểu động mạch gây sung huyết, tăng tính thấm thành mạch tạo dịch rỉ viêm, bạch cầu xuyên mạch và thực bào) cùng sự giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, bradykinin, prostaglandin, nitric oxide (NO) và các cytokin tiền viêm (TNF-α, IL-1, IL-6).
• Cơ chế dẫn truyền cảm giác đau: Sự kích thích các thụ thể cảm nhận đau ngoại vi (nociceptors) tại mô liên kết dưới tác động của các yếu tố hóa học nội sinh giải phóng trong phản ứng viêm.
• Thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Hy thiêm: Các nghiên cứu hóa thực vật học chỉ ra thành phần chính trong Sigesbeckia orientalis L. là các hợp chất diterpenoid nhóm ent-pimarane (tiêu biểu là kirenol, darutosid, darutigenol) và ent-kaurane, kết hợp với flavonoid (rutin, 3,7-dimethylquercetin), acid phenolic và sesquiterpen lacton có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm và hạ acid uric huyết thanh.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm bao gồm:

• Định lượng hoạt chất: Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đầu dò DAD/UV ở bước sóng 215 nm trên cột Agilent C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm), pha động MeCN - nước chạy theo chương trình gradient nồng độ để định lượng đồng thời ba chất chuẩn kirenol, darutosid và darutigenol theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
• Nghiên cứu độc tính cấp: Thực hiện theo hướng dẫn của OECD (2001) và phương pháp xác định độc tính của Đỗ Trung Đàm (2014) trên chuột nhắt trắng chủng Swiss giống cái (trọng lượng 22 ± 2 g). Tiến hành thử nghiệm thăm dò và thử nghiệm chính thức với 4 mức liều tăng dần (300, 600, 1200, 2400 mg/kg), theo dõi triệu chứng ngộ độc trong 4–6 giờ đầu và tỷ lệ tử vong trong vòng 72 giờ.
• Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp: Đánh giá trên mô hình gây phù chân chuột cống trắng chủng Wistar (trọng lượng 200 ± 20 g) bằng Carrageenin 1% (0,05 ml) theo phương pháp của Winter và cộng sự (1968). Đo thể tích bàn chân chuột bằng thiết bị Plethysmometer 37140 (Ugo Basile) tại các thời điểm 0, 2, 3, 5 và 7 giờ sau gây viêm. Thuốc đối chứng dương là Aspirin liều 200 mg/kg; các mức liều cao Hy thiêm thử nghiệm là 102,2 mg/kg/ngày (CHT 1/2), 204,4 mg/kg/ngày (CHT 1) và 408,8 mg/kg/ngày (CHT 2), cho uống liên tục 5 ngày trước khi gây viêm.
• Nghiên cứu tác dụng giảm đau cấp: Đánh giá trên mô hình gây đau quặn bằng tiêm phúc mạc dung dịch acid acetic 1% (0,1 ml/10g) trên chuột nhắt trắng chủng Swiss theo phương pháp của Koster và cộng sự (1959). Thuốc đối chứng dương là Aspirin liều 150 mg/kg/ngày; các mức liều cao Hy thiêm thử nghiệm là 188,7 mg/kg/ngày (CHT 1/2), 377,4 mg/kg/ngày (CHT 1) và 754,8 mg/kg/ngày (CHT 2), cho uống liên tục 5 ngày. Đếm số cơn đau quặn của từng cá thể chuột theo từng khoảng thời gian 5 phút trong tổng số 30 phút.
• Nguồn dữ liệu và xử lý thống kê: Dữ liệu thực nghiệm thu thập trực tiếp trên hệ thống đo đạc chuyên dụng, được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel 2013 và GraphPad Prism 7, kiểm định sự khác biệt bằng thuật toán Student's t-test với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1 - TỔNG QUAN

Chương này hệ thống hóa các kiến thức lý thuyết và y văn chuyên ngành làm cơ sở định hướng cho nghiên cứu thực nghiệm:

• Trình bày định nghĩa, nguyên nhân cơ học, vật lý, hóa học, sinh học và phân loại viêm (viêm cấp, viêm mạn tính). Phân tích chi tiết chuỗi phản ứng biến đổi mô học, rối loạn vận mạch, tạo dịch rỉ viêm, hiện tượng bạch cầu xuyên mạch và thực bào.
• Phân loại và cơ chế tác dụng của các nhóm thuốc chống viêm hiện đại: thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs ức chế enzym COX-1 và COX-2), dẫn xuất glucocorticoid, thuốc chống thấp khớp tác dụng chậm (DMARDs) và các liệu pháp sinh học ức chế cytokin (kháng TNF-α, kháng IL-1, kháng IL-6).
• Trình bày sinh lý học cảm giác đau, thụ thể tiếp nhận đau và phân loại thuốc giảm đau ngoại vi (paracetamol, ketorolac), thuốc giảm đau trung ương (morphin và dẫn xuất opioid) cùng cơ chế phong bế kênh natri của thuốc tê.
• Tổng quan các mô hình dược lý kinh điển đánh giá chống viêm và giảm đau trên động vật thực nghiệm (mô hình Carrageenin, viêm tai do dầu croton, mâm nóng, vẫy đuôi, gây đau quặn bằng acid acetic).
• Tổng quan về vị thuốc Hy thiêm (Sigesbeckia orientalis L.): mô tả đặc điểm hình thái thực vật, vùng phân bố tại Việt Nam và các quốc gia châu Á, kỹ thuật thu hái phần trên mặt đất vào tháng 4–6, tính vị quy kinh và các nghiên cứu hóa thực vật học về các nhóm diterpenoid (ent-pimarane, ent-kaurane), flavonoid, phenolic và dẫn xuất triterpen.

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương 2 mô tả chi tiết vật liệu, thiết bị và quy trình thiết kế thực nghiệm:

• Quy đổi liều lượng: Liều dự kiến điều trị trên người là 4 viên/ngày (tương đương 31,45 mg cao khô/kg thể trọng/ngày). Sử dụng hệ số chuyển đổi liều theo diện tích bề mặt cơ thể (hệ số 12 cho chuột nhắt trắng và hệ số 6,5 cho chuột cống trắng), xác định liều ngoại suy tương đương trên chuột nhắt là 377,4 mg/kg/ngày và trên chuột cống là 204,4 mg/kg/ngày.
• Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu: Thiết lập điều kiện phân tích HPLC gradient để xác định hàm lượng ba hợp chất đánh dấu kirenol, darutosid và darutigenol trong mẫu cao khô trước khi đóng nang.
• Thiết kế các lô thực nghiệm:
  • Nghiên cứu độc tính cấp: 40 chuột nhắt trắng chia 4 lô, dùng các liều 300, 600, 1200 và 2400 mg/kg.
  • Nghiên cứu chống viêm cấp: 50 chuột cống trắng chia 5 lô (Lô 1: Chứng bệnh uống nước cất 0,2 ml/10g; Lô 2: Chứng dương Aspirin 200 mg/kg; Lô 3: CHT 1/2 liều 102,2 mg/kg; Lô 4: CHT 1 liều 204,4 mg/kg; Lô 5: CHT 2 liều 408,8 mg/kg).
  • Nghiên cứu giảm đau cấp: 50 chuột nhắt trắng chia 5 lô (Lô 1: Chứng bệnh uống nước cất 0,2 ml/10g; Lô 2: Chứng dương Aspirin 150 mg/kg; Lô 3: CHT 1/2 liều 188,7 mg/kg; Lô 4: CHT 1 liều 377,4 mg/kg; Lô 5: CHT 2 liều 754,8 mg/kg).

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Chương này công bố toàn bộ số liệu định lượng và chỉ số đo đạc dược lý thu thập được:

• Hàm lượng hoạt chất diterpenoid: Sắc ký đồ HPLC ghi nhận các pic sắc ký có độ phân giải tốt, thời gian lưu trùng khớp với chất chuẩn, không có pic tạp tại vị trí phát hiện. Hàm lượng định lượng trong cao khô Hy thiêm đạt: Kirenol là 18,46 mg/g; Darutosid là 8,38 mg/g; Darutigenol là 6,09 mg/g.
• Kết quả độc tính cấp: Trong suốt 72 giờ theo dõi ở tất cả 4 mức liều (từ 300 mg/kg đến 2400 mg/kg), không ghi nhận cá thể chuột nào bị chết (tỷ lệ chết 0/10 ở mỗi lô). Chuột hoạt động bình thường, không có dấu hiệu co giật, tiêu chảy hay xù lông. Giá trị LD50 qua đường uống của viên nang cao khô Hy thiêm được xác định là lớn hơn 2400 mg/kg, xếp vào nhóm 5 (chất gần như không độc) theo thang phân loại GHS.
• Kết quả chống viêm cấp trên mô hình Carrageenin: Tại tất cả các thời điểm đo sau khi gây phù (2, 3, 5 và 7 giờ), các lô dùng cao Hy thiêm và lô dùng Aspirin 200 mg/kg đều làm giảm độ phù bàn chân chuột có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,05). Tác dụng ức chế phù của cao Hy thiêm tăng dần theo liều lượng; ở liều 204,4 mg/kg/ngày và 408,8 mg/kg/ngày, tỷ lệ giảm phù tại thời điểm 5 giờ đạt lần lượt 50,12% và 57,50%.
• Kết quả giảm đau cấp trên mô hình acid acetic: Số cơn đau quặn trong 30 phút ở tất cả các lô dùng cao Hy thiêm đều thấp hơn rõ rệt so với lô chứng bệnh (p < 0,05). Tỷ lệ giảm đau đạt 22,86% ở liều 188,7 mg/kg/ngày; 47,30% ở liều 377,4 mg/kg/ngày và 53,64% ở liều 754,8 mg/kg/ngày (so với Aspirin 150 mg/kg đạt 62,63%). Sự khác biệt về số cơn đau quặn giữa hai lô CHT liều 377,4 mg/kg, 754,8 mg/kg và lô Aspirin không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Chương 4 - BÀN LUẬN

Chương này đối chiếu các phát hiện thực nghiệm với cơ chế sinh học và tài liệu tham khảo:

• Bàn luận về độc tính: Mức liều 2400 mg/kg không gây chết trên chuột nhắt trắng tương đương gấp 6,36 lần liều dự kiến sử dụng trên người, chứng minh chế phẩm viên nang có biên độ an toàn rộng.
• Phân tích cơ chế tác dụng chống viêm: Quá trình phù chân do Carrageenin diễn ra qua hai pha (pha sớm do giải phóng histamin, serotonin; pha muộn do giải phóng prostaglandin và thâm nhiễm bạch cầu). Cao Hy thiêm thể hiện tác dụng ức chế rõ rệt ở cả hai pha, đặc biệt mạnh mẽ ở pha sau, tương ứng với cơ chế tác dụng của các diterpenoid chính kirenol, darutosid và darutigenol.
• Phân tích cơ chế giảm đau ngoại vi: Tiêm acid acetic vào phúc mạc kích hoạt giải phóng các cytokin tiền viêm (TNF-α, IL-1β, IL-6) và prostaglandin gây kích ứng các ngọn dây thần kinh cảm giác. Việc cao Hy thiêm làm giảm mạnh số cơn quặn đau tương đương Aspirin khẳng định thuốc có tác dụng giảm đau ngoại vi thông qua việc ức chế tổng hợp các chất trung gian gây đau.

Kết quả và đóng góp

Bảng tổng hợp số liệu thực nghiệm chính

1. Kết quả định lượng hoạt chất chính trong mẫu cao khô Hy thiêm:

Hoạt chất Diterpenoid	Hàm lượng trong cao khô (mg/g)
Kirenol	18,46
Darutosid	8,38
Darutigenol	6,09

2. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng (n = 10/lô):

Lô thử nghiệm	Liều dùng (mg/kg)	Số chuột chết sau 72 giờ	Tỷ lệ chết (%)
Lô 1	300	0/10	0
Lô 2	600	0/10	0
Lô 3	1200	0/10	0
Lô 4	2400	0/10	0

3. Tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng Carrageenin (n = 10/lô):

Lô thử nghiệm	Độ phù sau 2 giờ (%)	Độ phù sau 3 giờ (%)	Độ phù sau 5 giờ (%)	Độ phù sau 7 giờ (%)
Lô 1: Chứng bệnh (Nước cất)	54,32 ± 3,75	64,96 ± 5,45	71,99 ± 3,15	55,80 ± 5,16
Lô 2: Aspirin 200 mg/kg	41,10 ± 1,75	29,10 ± 9,47	24,24 ± 7,24	19,26 ± 6,61
Lô 3: CHT 1/2 (102,2 mg/kg/ngày)	38,47 ± 9,19	48,94 ± 5,35	45,69 ± 9,99	42,52 ± 8,12
Lô 4: CHT 1 (204,4 mg/kg/ngày)	44,83 ± 6,76	38,72 ± 12,47	35,90 ± 10,12	34,29 ± 10,33
Lô 5: CHT 2 (408,8 mg/kg/ngày)	45,24 ± 1,92	33,82 ± 4,54	30,59 ± 3,44	24,59 ± 5,06

Ghi chú: p < 0,05 đối với tất cả các lô thử nghiệm so với lô chứng bệnh tại các thời điểm tương ứng.

4. Tỷ lệ phần trăm giảm phù chân chuột so với lô chứng bệnh:

Lô thử nghiệm	Tỷ lệ giảm phù sau 2h (%)	Tỷ lệ giảm phù sau 3h (%)	Tỷ lệ giảm phù sau 5h (%)	Tỷ lệ giảm phù sau 7h (%)
Lô 2: Aspirin 200 mg/kg	24,33	55,20	66,32	65,48
Lô 3: CHT 1/2 (102,2 mg/kg/ngày)	9,90	29,66	40,93	31,05
Lô 4: CHT 1 (204,4 mg/kg/ngày)	17,47	40,39	50,12	38,54
Lô 5: CHT 2 (408,8 mg/kg/ngày)	16,72	47,93	57,50	55,93

5. Tác dụng giảm đau cấp trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic (n = 10/lô):

Lô thử nghiệm	Liều dùng (mg/kg/ngày)	Tỷ lệ giảm số cơn đau quặn so với chứng (%)	Ý nghĩa thống kê (p)
Lô 1: Chứng bệnh	-	-	-
Lô 2: Aspirin (Chứng dương)	150	62,63	p < 0,05 so với chứng
Lô 3: CHT 1/2	188,7	22,86	p < 0,05 so với chứng; p < 0,05 so với Aspirin
Lô 4: CHT 1	377,4	47,30	p < 0,05 so với chứng; p > 0,05 so với Aspirin
Lô 5: CHT 2	754,8	53,64	p < 0,05 so với chứng; p > 0,05 so với Aspirin

Đóng góp học thuật và thực tiễn của khóa luận

• Đã kiểm tra và định lượng đồng thời 3 hoạt chất diterpenoid chính (kirenol, darutosid, darutigenol) trong mẫu cao khô Hy thiêm làm tiêu chuẩn đánh giá nguyên liệu đầu vào cho dạng thuốc nang cứng.
• Chứng minh tính an toàn cấp tính của viên nang cao Hy thiêm với mức liều dung nạp trên động vật thử nghiệm đạt tới 2400 mg/kg (cao gấp 6,36 lần liều lâm sàng quy đổi).
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm xác thực về hiệu lực chống viêm cấp và giảm đau ngoại vi của chế phẩm dạng viên nang cứng trên hai mô hình động vật tiêu chuẩn, cho thấy liều tương đương lâm sàng và liều gấp đôi có hiệu lực giảm đau tương đương với Aspirin liều 150 mg/kg.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận ghi nhận các hạn chế dựa trên phạm vi nghiên cứu và đề xuất các hướng mở tiếp theo:

• Hạn chế của đề tài:
  • Nghiên cứu độc tính mới chỉ dừng lại ở thử nghiệm độc tính cấp tính đường uống trên chuột nhắt trắng trong thời gian 72 giờ, chưa tiến hành đánh giá độc tính bán trường diễn và trường diễn trên chức năng gan, thận và cơ quan tạo máu khi dùng kéo dài.
  • Tác dụng dược lý mới chỉ được khảo sát trên hai mô hình cấp tính (gây phù chân chuột bằng Carrageenin và đau quặn do acid acetic), chưa khảo sát trên các mô hình viêm mạn tính (như mô hình u hạt amiant, viêm khớp thực nghiệm) hoặc mô hình giảm đau trung ương (mô hình mâm nóng, mô hình vẫy đuôi).
  • Chưa tiến hành phân lập tinh chế riêng lẻ từng hoạt chất để khảo sát cơ chế phân tử ở mức độ thụ thể tế bào.
• Hướng nghiên cứu tiếp (theo đề xuất của tác giả):
  1. Tiếp tục triển khai nghiên cứu độc tính bán trường diễn của viên nang cứng cao Hy thiêm trên động vật thực nghiệm.
  2. Tiến hành thêm các nghiên cứu đánh giá tác dụng giảm đau, chống viêm trên các mô hình gây đau và gây viêm mạn tính khác.
  3. Hoàn thiện các nghiên cứu tiền lâm sàng theo quy định của Bộ Y tế và từng bước triển khai thử nghiệm trên lâm sàng.
  4. Nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp chiết xuất, làm giàu hoạt chất chính có tác dụng trong Hy thiêm và nâng cao kỹ thuật bào chế nhằm tinh giảm số lượng viên nang phải sử dụng trong một ngày điều trị.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên chuyên ngành Dược học, Dược lý học, Dược liệu học và Dược học cổ truyền: Cung cấp tài liệu tham khảo về phương pháp luận nghiên cứu dược lý thực nghiệm, phương pháp tính toán và ngoại suy liều lượng giữa người và các loài động vật gặm nhấm (chuột nhắt, chuột cống).
• Nghiên cứu viên phát triển sản phẩm thuốc từ dược liệu: Tham khảo quy trình thẩm định và định lượng đồng thời ba hợp chất nhóm diterpenoid (kirenol, darutosid, darutigenol) bằng kỹ thuật HPLC-DAD.
• Các phần nội dung đáng tham khảo nhất trong văn bản:
  • Quy trình thiết kế và tiến hành đo thể tích viêm chân chuột bằng thiết bị Plethysmometer trên mô hình Carrageenin tại mục 2.2.3.
  • Quy trình đếm và phân tích số cơn đau quặn phúc mạc do acid acetic tại mục 2.2.4.
  • Hệ thống dữ liệu định lượng hoạt chất và các bảng số liệu đáp ứng giảm đau, kháng phù chi tiết tại Chương 3.

Câu hỏi thường gặp

1. Hàm lượng của ba chất chuẩn diterpenoid trong cao khô Hy thiêm dùng đóng nang được xác định là bao nhiêu?
Theo kết quả phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ở bước sóng 215 nm, hàm lượng của ba chất đánh dấu trong mẫu cao khô Hy thiêm lần lượt là: Kirenol đạt 18,46 mg/g; Darutosid đạt 8,38 mg/g; và Darutigenol đạt 6,09 mg/g cao khô.

2. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường uống của viên nang cao Hy thiêm trên chuột nhắt trắng ghi nhận điều gì?
Khi cho chuột nhắt trắng uống bột viên nang cao Hy thiêm với các mức liều tăng dần từ 300 mg/kg đến mức cao nhất là 2400 mg/kg (gấp 6,36 lần liều dùng quy đổi từ người), tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ ghi nhận là 0% (0/10 cá thể ở mỗi lô), không xuất hiện triệu chứng ngộ độc bất thường. Do đó, LD50 qua đường uống lớn hơn 2400 mg/kg và chế phẩm được xếp vào nhóm 5 (gần như không có độc tính) theo phân loại GHS.

3. Hiệu lực ức chế phù viêm cấp của cao Hy thiêm trên mô hình Carrageenin diễn biến như thế nào qua các thời điểm?
Cao Hy thiêm ở các mức liều 102,2 mg/kg, 204,4 mg/kg và 408,8 mg/kg đều làm giảm độ phù chân chuột có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm chứng bệnh từ thời điểm sau 2 giờ đến 7 giờ. Tác dụng kháng viêm thể hiện rõ nét nhất ở thời điểm 5 giờ sau gây viêm với tỷ lệ giảm phù lần lượt là 40,93% (liều 102,2 mg/kg), 50,12% (liều 204,4 mg/kg) và 57,50% (liều 408,8 mg/kg), so với mức giảm 66,32% của lô đối chứng Aspirin 200 mg/kg.

4. Mức liều cao Hy thiêm nào cho tác dụng giảm đau tương đương với thuốc đối chứng Aspirin?
Trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic 1%, cao khô Hy thiêm ở liều 377,4 mg/kg/ngày (làm giảm 47,30% số cơn đau quặn) và liều 754,8 mg/kg/ngày (làm giảm 53,64% số cơn đau quặn) cho hiệu quả giảm đau tương đương với Aspirin liều 150 mg/kg/ngày (làm giảm 62,63% số cơn đau quặn) với sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

5. Hệ số quy đổi liều từ người sang động vật thực nghiệm trong nghiên cứu này được tính như thế nào?
Từ liều dự kiến sử dụng trên lâm sàng cho người là 4 viên/ngày (tương đương 31,45 mg/kg/ngày), tác giả sử dụng hệ số chuyển đổi liều tương đương theo diện tích bề mặt cơ thể: nhân với hệ số 12 đối với chuột nhắt trắng (đạt liều 377,4 mg/kg/ngày) và nhân với hệ số 6,5 đối với chuột cống trắng (đạt liều 204,4 mg/kg/ngày).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã hoàn thành việc định lượng đồng thời 3 hoạt chất diterpenoid chính (kirenol, darutosid, darutigenol) và chứng minh độ an toàn cấp tính đường uống (LD50 > 2400 mg/kg) của viên nang cứng cao khô Hy thiêm. Nghiên cứu khẳng định chế phẩm có tác dụng chống viêm cấp rõ rệt trên mô hình phù chân do Carrageenin và tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình đau quặn do acid acetic tương đương thuốc đối chứng Aspirin. Kết quả thực nghiệm cung cấp cơ sở khoa học quan trọng cho việc tiếp tục nghiên cứu độc tính bán trường diễn, phát triển dạng bào chế và thử nghiệm lâm sàng cho bài thuốc cổ truyền Hy thiêm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 - TỔNG QUAN 1. Định nghĩa Viêm vừa là phản ứng tự vệ và thích nghi của cơ thể nhằm phá hủy hoặc loại trừ các vật lạ khi chúng xâm nhập vào cơ thể, vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng cơ quan. có thể ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [1]. Nguyên nhân gây viêm Có rất nhiều nguyên nhân gây viêm.

Mọi nguyên nhân dẫn đến tổn thương và làm chết một lượng tối thiểu tế bào tại chỗ đều có thể gây viêm tại chỗ đó. Có thể xếp thành 2 nhóm lớn [8] : 1. Nguyên nhân bên ngoài - Cơ học: từ xây xát nhẹ tới chấn thương nặng. gây phá hủy tế bào và mô, làm phóng thích ra những chất gây viêm nội sinh.

- Vật lý: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hóa protid tế bào gây tổn thương enzym; tia quang tuyến, tia xạ (UV, X) do tạo ra các gốc tự do gây phá hủy một số enzym oxy hóa, còn gây tổn thương ADN. - Hóa học: các acid, kiềm mạnh, các chất hóa học khác (thuốc trừ sâu, các độc tố.) gây hủy hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym chủ yếu. - Sinh học: là nguyên nhân phổ biến nhất gồm virus, vi khuẩn, ký sinh trùng…[8] 1. Nguyên nhân bên trong.

Có thể gặp như thiếu oxy tại chỗ, hoại tử mô, xuất huyết, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (tắc mạch). Ngoài ra, viêm có thể bị gây ra do phản ứng kết hợp kháng nguyên – kháng thể như viêm cầu thận, viêm trong hiện tượng Arthus [8]. Phân loại viêm Có nhiều cách phân loại, mỗi cách phân loại đưa lại một lợi ích riêng [8]. Theo diễn biến chia ra viêm cấp và viêm mạn.

Viêm cấp - Khi thời gian diễn biến ngắn (vài phút – vài ngày). Dịch chứa nhiều protein huyết tương và xuất ngoại nhiều bạch cầu đa nhân trung tính [8]. - Trong viêm cấp, có đáp ứng tức thời và sớm với tổn thương. Viêm cấp có 3 hiện tượng cấu thành: làm giãn mạch, do đó tăng lượng máu tới ổ viêm; thay đổi cấu trúc trong mạch vi tuần hoàn, cho phép các protein huyết tương ra khỏi mạch máu; di tản bạch cầu từ vi tuần hoàn và tích tụ chúng vào nơi tổn thương.

Những thành phần trên gây sưng, nóng đỏ trong viêm cấp [8]. Viêm mạn - Thời gian diễn biến kéo dài từ vài ngày đến hàng tháng, hoặc năm. - Viêm mạn tính có thể bắt đầu ngay từ đầu, nhưng đa số là do viêm cấp chuyển sang. Do vậy biểu hiện của viêm mạn tính gồm: + Tiết dịch, nhưng sưng, đỏ và nóng thì không rõ rệt, hoặc không có.

+ Hiện tượng chủ yếu là quá sản tế bào và xơ hóa của chất căn bản. + Chức năng mô và cơ quan ít bị ảnh hưởng, hoặc chỉ suy giảm chậm chạp. + Hiện tượng huy động bạch cầu vẫn còn, nhưng không lớn, tình trạng tăng bạch cầu trung tính không rõ rệt; tuy vẫn có thực bào tại ổ viêm nhưng không mạnh mẽ. - Điều kiện để một viêm cấp tính chuyển thành viêm mạn tính là: + Yếu tố gây viêm còn tồn tại (vi khuẩn không bị tiêu diệt hết, dị vật chưa được loại trừ triệt để, hoặc tiếp tục tạo mới.) + Bạch cầu hạt trung tính và đại thực bào tiếp tục tới ổ viêm nhưng không đủ sức loại trừ hẳn yếu tố gây bệnh mà chỉ duy trì thế cân bằng.

+ Có sự thâm nhiễm và tham gia của lympho bào tại ổ viêm. 4 + Có sự thâm nhập và tham gia hàn gắn của các tế bào sợi non ở rìa ổ viêm. - Viêm hạt: một số tác nhân trong viêm mạn tính tạo ra hình ảnh tổn thương đặc trưng gọi là viêm u hạt (bệnh lao, hủi, giang mai, bệnh do bụi. Các u hạt là tập hợp các đại thực bào đã bị thay đổi hình dạng gọi là “tế bào dạng biểu mô”, thường được vây quanh bằng một vòng đai lympho bào.

Cơ chế bệnh sinh Ổ viêm Rối loạn tuần hoàn Rối loạn chuyển hoá Tổn thương mô Hình 1. Hiện tượng biến đổi tại ổ viêm [8] 1. Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm: Xảy ra sớm và dễ nhận thấy nhất ngay khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể: - Rối loạn vận mạch Hiện tượng co mạch xảy ra sớm và ngắn nhất, có tính phản xạ, do dây thần kinh co mạch hưng phấn làm các tiểu động mạch co lại. Là tiền đề cho chuỗi phản ứng dây chuyền tiếp theo: giãn tiểu động mạch, tạo sự sung huyết động mạch [9,10].

Tiếp theo là giải phóng các enzym từ lysosom của tế bào chết, các hóa chất trung gian có hoạt tính từ mastocyt và bạch cầu hay các sản phẩm hoạt động thực bào của bạch cầu, các cytokin (TNF, IL-1, PAF. Đặc biệt là sự có mặt của nitric oxide NO do NOsynthetase của các tế bào viêm. Biểu hiện bên ngoài tại ổ viêm là hiện tương sưng, nóng, đỏ, đau [8]. Khi quá trình thực bào bắt đầu yếu đi đưa đến giảm sung huyết động mạch, chuyển dần sang sung huyết tĩnh mạch giúp dọn sạch ổ viêm, chuẩn bị cho quá trình sửa chữa - cô lập ổ viêm, ngăn sự lan rộng của tác nhân gây bệnh.

Giai đoạn ứ máu xảy ra tiếp sau đó với vai trò tăng cường sự sửa chữa và cô lập ổ viêm [8]. 5 - Tạo dịch rỉ viêm Là các sản phẩm xuất tiết tại ổ viêm, xuất hiện ngay từ khi sung huyết động mạch. Nhìn chung dịch gồm hai thành phần chính: từ máu thoát ra (nước, muối, albumin, globulin, kháng thể chống lại tác nhân viêm, fibrinogen, hồng cầu, tiều cầu và chủ yếu là bạch cầu). Thành phần thứ hai gồm các chất mới được hình thành: histamin, serotonin, acetylcholin, các kinin huyết tương (gây giãn mạch, đau), leukotaxin làm tăng tính thấm mạch và hóa ứng động bạch cầu (C5a bổ thể, PAF đại thực bào), leucotrien, sản phẩm chuyển hóa của acid arachidonic, các cytokin IL- 1, 6, 8 từ đại thực bào và tế bào nội mô hoạt hóa; chất gây sốt (gồm IL-1, PG, TNF-α), các acid nhân có tác dụng kích thích sản xuất bạch cầu, tái tạo mô và tăng sinh kháng thể.

Dịch rỉ viêm có tính chất bảo vệ nhưng nếu lượng quá nhiều sẽ gây chèn ép mô xung quanh gây đau nhức [8]. - Bạch cầu xuyên mạch Khi tính thấm thành mạch tăng, có sự thoát mạch, máu chảy chậm, lúc đó bạch cầu rời khỏi dòng trục, tiến về phía ngoại vi tới trườn theo vách mạch bám dính và xuyên mạch. Ngoài ra còn có vai trò của đại thực bào được hoạt hóa, tiết thêm các chất gây hóa ứng động mạnh và xa hơn, kéo đại thực bào, bạch cầu trung tính tới những mạch quanh ổ viêm. Ở hầu hết các viêm cấp, giai đoạn đầu chủ yếu là bạch cầu trung tính (6 - 24 giờ đầu) tiếp theo là monocyt (24 - 48 giờ sau đó) cuối cùng là lympho [8].

- Bạch cầu thực bào Khi bị thực bào thì có 5 khả năng có thể xảy ra: tác nhân bị tiêu đi nhờ các cơ chế phụ thuộc và không phụ thuộc oxy (gặp trong đa số trường hợp). Không bị tiêu hủy mà tồn tại lâu trong tế bào như bụi than trong thực bào ở phổi; tác nhân có thể bị nhả ra mà tế bào thực bào không chết; nó không bị tiêu hủy mà có thể theo thực bào đi nơi khác gây những ổ viêm mới (lao mạn tính). Nó cũng có thể làm chết thực bào như vi khuẩn lao hay liên cầu [8]. Rối loạn chuyển hóa 6 Tại ổ viêm quá trình oxy hóa tăng làm tăng nhu cầu oxy nhưng sự sung huyết động mạch chưa đáp ứng kịp.

Do vậy, pH sẽ tiến tới giảm, từ đó kéo theo hàng loạt những rối loạn chuyển hóa của glucid, lipid và protid [8]. Tổn thương mô Có hai loại tổn thương tại ổ viêm [8]: - Tổn thương tiên phát: phụ thuộc cường độ của nguyên nhân gây viêm mà gây hoại tử tế bào ít hay nhiều. - Tổn thương thứ phát: do những rối loạn tại ổ viêm, phụ thuộc vào cường độ của nguyên nhân và mức độ phản ứng của cơ thể. Phản ứng của cơ thể tuy có tác dụng khu trú và loại trừ yếu tố gây bệnh nhưng tùy mức độ lại gây ra ứ máu, tạo ra nhiều chất gây thiểu dưỡng, tổn thương, hoại tử tế bào.

Tăng sinh mô và tế bào Ngay trong giai đoạn đầu đã có tăng sinh tế bào (bạch cầu đa nhân trung tính, rồi đơn nhân và lympho bào). Về cuối, sự tăng sinh vượt mức hoại tử khiến ổ viêm được sửa chữa. Các mô của cơ quan viêm có thể được tái sinh đầy đủ nên cấu trúc và chức năng cơ quan được phục hồi; nếu không được như vậy thì một phần nhu mô bị thay thế bằng mô xơ (sẹo) [8]. Nguyên bào xơ (fibroblast) giữ một vai trò chủ yếu trong quá trình hàn gắn vết thương.

Chúng chịu tác động bởi cytokin IL-4, TNF-α, các yếu tố sinh trưởng với C5a và LTB4. Trên bề mặt chúng có những thụ thể tiếp nhận các protein khung đỡ (collagen I, II, III, fibronectin, tropoelastin, elastin). Các yếu tố trên điều hòa sự phân triển nguyên bào xơ và bài tiết các protein khung đỡ là cơ sở hình thành mô sẹo thay thế cho nhu mô tổn thương, làm lành vết thương [8]. Thuốc chống viêm Trên cơ sở những hiểu biết về viêm người ta xác định các thuốc chống viêm phải làm giảm hoặc đối lập các chất trung gian hóa học trong phản ứng viêm.

Các thuốc chống viêm thông thường được chia thành 2 nhóm [10]: 1. Thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) 7 Đây là nhóm thuốc được sử dụng phổ biến hiện nay. NSAIDs gồm nhiều nhóm thuốc có cấu trúc hóa học khác nhau nhưng đều có các tác dụng chung là giảm đau, hạ sốt, chống viêm, chống kết tập tiểu cầu với những mức độ khác nhau [10]. Phospholipit màng (-) Glucocorticoid Endotoxin Cytokines Axit arachidonic (-) Mitogen (+) Thuốc chống viêm Chất ức chế COX1 COX2 chọn lọc (-) kinh điển (-) (-) COX2 PGE2/PGI2 dạ dày -Các đại thực bào PEG2/PGI2 thận -Các tế bào hoạt dịch TXA2 tiểu cầu -Phản ứng viêm PGI2 nội mạc -PGE2 Hình 1.

Cơ chế tác dụng của các thuốc chống viêm NSAIDS [11] Các nhóm thuốc thường dùng: - Dẫn xuất của acid salicylic: Trên lâm sàng thường dùng là aspirin, tác dụng chống viêm chỉ xuất hiện với liều ≥ 3g/ ngày, tác dụng hạ sốt và giảm đau chỉ với liều 500mg/ lần (trong 1- 4 giờ) [10]. Khi dùng kéo dài có thể gây hội chứng “salicyle”, trong một số trường hợp có thể gặp dấu hiệu đặc ứng, mày đay, phù quinck, hen, xuất huyết dạ dày. - Nhóm indol: Dẫn xuất thường gặp là indomethacin, sulindac và etodolac.